Введение к работе
Актуальность работы. Патогенные стрептококки относятся к наиболее распространенным возбудителям бактериальных инфекций человека. В последние десятилетия заболевания, вызываемые стрептококками серогруппы В (СГВ) или Streptococcus agalactiae, в большинстве стран мира рассматриваются в качестве важной социально-экономической и медицинской проблемы. Известно, что СГВ является естественным обитателем прямой кишки человека, способного вызывать инфекции уро-генитальной системы у женщин. Наряду с этим, СГВ может вызывать различные патологии беременности, в том числе выкидыши, внутриутробное поражение плода, преждевременные роды. СГВ могут вызывать серьезные инфекции у новорожденных, такие как сепсис, пневмония и менингит. Особо опасны инфекции, вызываемые СГВ у детей не старше десяти дней, протекающие в форме молниеносного сепсиса и приводящие к смертности в высоком проценте случаев.
Заболевания, вызываемые СГВ, как правило, лечат антибиотиками [Страчунский Л.С. 2002, Поляк М.С. 2003]. Препаратами выбора при лечении СГВ инфекций являются антибиотики бета-лактамного ряда (бензилпенициллин, ампициллин [Семина Н.А. 2004], ампициллин в комбинации с сульбактамом [Бурбелло А.Т. 2003]); макролиды (эритромицин, кларитромицин, рокситромицин, азитромицин) и ванкомицин [Зуева Л.П. 2004].
В целях профилактики инфекций, вызванных СГВ, используют такие антибиотики, как бензатин бензилпенициллин, эритромицин и ампициллин с сульбактамом [Бурбелло А.Т. 2003].
Антибиотики, широко применяемые для профилактики и лечения, нередко оказываются неэффективными в силу увеличения числа антибиотикоустойчивых штаммов. Другим недостатком антибиотикотерапии является возникновение побочных эффектов для здоровья людей. К ним относятся аллергические реакции, негативное воздействие на центральную нервную и сердечно-сосудистую системы, и на некоторые внутренние органы человека. Кроме того, применение антибиотиков может приводить к нарушению микробиоценоза организма, что приводит к дисбиозам и, как следствие, к уменьшению устойчивости организма к другим инфекционным агентам, в первую очередь микоплазмам, хламидиям и грибам рода Candida.
В этой связи очевидна необходимость поиска новых средств и способов профилактики, в том числе специфической профилактики инфекций, вызываемых СГВ, посредством создания вакцинных препаратов.
В настоящее время большое число лабораторий мира работает над созданием вакцины против СГВ. Основными аргументами в пользу
целесообразности создания такой вакцины, помимо низкой эффективности антибиотиков или невозможности их применения для профилактики, является возможность четкого выделения основных контингентов лиц, подлежащих вакцинации. В первую очередь - это носительницы СГВ с осложненной первой беременностью, планирующие рождение второго ребенка, а также здоровые женщины - будущие матери, нуждающиеся в профилактике СГВ инфекций. Потенциально объектами для иммунизации могут рассматриваться лица пожилого возраста, учитывая высокий уровень СГВ заболеваний в этой возрастной группе.
Одним из новых направлений при создании вакцин является использование в качестве её компонентов рекомбинантных полипептидов, полученных на основе поверхностных белковых факторов патогенности СГВ. Выбор рекомбинантного полипептида или оптимальной комбинации полипептидов при создании вакцины должен определяться рядом условий, в число которых входят распространенность, консервативность, иммуногенность и протективность исходных поверхностных белков СГВ, на основе которых конструируются рекомбинантные полипептиды.
Среди поверхностных белковых факторов патогенности СГВ перспективными кандидатами для создания вакцины рассматриваются и сериновые протеазы. Последние способствуют выживанию СГВ в организме хозяина, так как они участвуют в расщеплении белков в качестве источников энергии или с целью подавления иммунных реакций организма. Важной особенностью некоторых сериновых протеаз является их способность расщеплять хемоаттрактанты. Так, например, С5а пептидаза, или ScpB, специфически расщепляет С5а компонент комплемента человека, мобилизующий полиморфноядерные лейкоциты; а протеаза CspA гидролизует ряд хемокинов СХС семейства, а именно GRO-alpha, GRO-beta, GRO-gamma, пептид, активирующий нейтрофилы (NAP-2), и гранулоцитарный хемотаксический белок 2 (GCP-2). С5а компонент комплемента и перечисленные хемокины обладают свойствами анафилотоксинов и стимулируют привлечение в очаг инфекции полиморфноядерных лейкоцитов и макрофагов, поэтому их инактивация способствует подавлению факторов врожденного иммунитета. Указанные свойства сериновых протеаз ScpB и CspA указывают на их физиологическую значимость для СГВ.
В силу изложенного, получение иммуногенных и протективных рекомбинантных полипептидов на основе С5а пептидазы и протеазы CspA позволит использовать их в качестве компонентов при создании вакцинного препарата против СГВ.
Все вышесказанное определило цели и задачи настоящего исследования.
Цель исследования - получение рекомбинантных полипептидов на основе сериновых протеаз S. agalactiae С5а пептидазы и протеазы CspA для вакцинной профилактики заболеваний, вызываемых стрептококками группы В.
Для этого планировалось выполнить следующие задачи:
Анализ вторичной структуры С5а пептидазы и протеазы CspA для выявления потенциально иммуногенных участков данных белков.
Изучение распространенности и консервативности гена cspA, кодирующего протеазу CspA, в штаммах СГВ.
Получение очищенных препаратов рекомбинантных полипептидов на основе С5а пептидазы и протеазы CspA.
Изучение иммуногенности рекомбинантных полипептидов и протективные свойств антител, полученных к рекомбинантным полипептидам, в опытах in vivo и in vitro.
Изучение вклада различных частей С5а пептидазы и протеазы CspA в индукцию гуморального иммунного ответа в организме человека.
Исследование токсичности рекомбинантных полипептидов в опытах in vivo.
Научная новизна работы.
1. Впервые продемонстрирована распространенность гена cspA,
кодирующего сериновую протеазу CspA среди штаммов СГВ различных
серотипов. Доказана консервативность участков гена cspA, кодирующих N-
терминальную и С-терминальную части протеазы CspA.
2. Просеквенированные фрагменты гена cspA десяти штаммов СГВ
различных серотипов депонированы в банк данных GenBank NCBI и им
присвоены следующие номера: HQ849568, HQ849569, HQ849570, HQ849571,
HQ849572, HQ849573, HQ849574, HQ849575, HQ849576 и HQ849577.
3. Впервые изучен вклад различных участков С5а пептидазы и протеазы
CspA в формирование протективного иммунитета к стрептококку группы В и
показано, что наличие во вторичной структуре полипептида а-спиральных
структур способствует повышению иммуногенности и протективности.
4. Впервые проклонированы определенные фрагменты генов,
кодирующие различные участки на С5а пептидазе и протеазе CspA, и получены
соответствующие им рекомбинантные полипептиды РЫа, РЬЗа, Pb4a, Csp2 и
Csp3.
5. Впервые продемонстрировано, что полипептиды малых размеров (73 -^
85 аминокислотных остатков) на основе С5а пептидазы и протеазы CspA
способны индуцировать синтез специфических антител с протективными
свойствами не только против S. agalactiae, но и против S. pyogenes.
Теоретическая значимость работы.
Продемонстрирована распространенность гена cspA, кодирующего поверхностную сериновую протеазу CspA, как в референс-штаммах, так и в клинических изолятах СГВ различных серотипов. Доказана консервативность фрагментов гена cspA, кодирующих N-терминальную и С-терминальную части протеазы CspA, в штаммах СГВ различных серотипов. Изучен вклад различных частей С5а пептидазы и протеазы CspA в формировании гуморального иммунного ответа к СГВ. Показано, что индукция синтеза специфических и протективных антител зависит от процентного содержания а-спиральных структур в молекуле белка.
Практическая значимость работы.
Созданы штаммы-продуценты Е. coli рекомбинантных полипептидов на основе С5а пептидазы (РЫа, РЬЗа и РЬ4а) и протеазы CspA (Csp2 и Csp3). Доказано, что высокоочищенные рекомбинантные полипептиды РЫа, РЬЗа и Csp3 обладают иммуногенностью и способностью формировать образование протективных антител к СГВ. Рекомбинантные полипептиды РЬЗа и Csp3 рассматриваются как перспективные компоненты вакцины против СГВ.
Основные положения, выносимые на защиту:
Ген cspA, кодирующий протеазу CspA, присутствует во всех референс-штаммах и клинических изолятах СГВ; степень гомологии фрагментов гена cspA (csp2 и csp3) в различных штаммах - 98-^100%.
Проклонированы фрагменты гена С5а пептидазы и протеазы CspA, которые кодируют рекомбинантные полипептиды РЫа, РЬЗа, Pb4a, Csp2 и Csp3.
Участки С5а пептидазы на N-терминальном конце с 96 по 169 аминокислотный остаток и в центральной области с 496 по 570 аминокислотный остаток, а также участок с 1247 по 1332 аминокислотный остаток на С-терминальном конце протеазы CspA, содержат детерминанты, отвечающие за индукцию специфических антител, эффективно опсонизирующих СГВ.
Рекомбинантные полипептиды РЬЗа и Csp3, содержащие высокий процент а-спиральных структур, обладают высокой иммуногенностью, а антитела, полученные к ним, проявляют протективную и опсонизирующую активность in vitro и in vivo.
5. Рекомбинантные полипептиды РЬЗа и Csp3 на основе С5а
пептидазы и протеазы CspA, соответственно, могут быть рекомендованы для
дальнейшего использования при создании вакцин против СГВ.
Личный вклад автора в проведенное исследование.
Личный вклад автора заключался в самостоятельном формулировании задач работы, проведении микробиологических, молекулярно-генетических, биохимических, иммунологических исследований, а также в статистической обработке и анализе полученных данных, обобщении и интерпретации результатов.
Апробация работы.
По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе один патент и четыре статьи в изданиях, рекомендованных ВАК России. Материалы исследований были представлены на нескольких отечественных и международных научных конференциях и симпозиумах (на Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», г. Санкт-Петербург, Россия, 2007; 11-ой Международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», г. Пущино, Россия, 2007; «XVII международном симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям им. Ленсфильд», г. Порто Хели, Греция, 2008; 3-м Конгрессе европейских микробиологов, г. Гетерборг, Швеция, 2009; III Международном молодежном медицинском Конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения-2009», г. Санкт-Петербург, Россия, 2009; 20-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям «20 ECCMID», г. Вена, Австрия, 2010; на конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», г. Санкт-Петербург, Россия, 2010).
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа изложена на 153 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, общее заключение, выводы, список литературы. Работа проиллюстрирована 28 рисунками и 16 таблицами. Список литературы включает 179 источников, из них 12 отечественных и 167 зарубежных.
