Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .27
1.1. Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта здоровых людей 27
1.2. Дисбиоз .31
1.3. Пути коррекции дисбиоза. Пробиотики 33
1.4. Лактобациллы как пробиотики 37
1.4.1.Влияние лактобацилл на организм человека 37
1.4.2. Продукция кислот лактобациллами 39
1.4.3. Продукция бактериоцинов лактобациллами .40
1.5. Бифидобактерии как пробиотики .43
1.5.1. Взаимоотношение бифидобактерий с макроорганизмом 43
1.5.2. Противовирусная активность бифидобактерий .45
1.5.3. Биосинтетические возможности бифидобактерий 47
1.6. Изучение антагонистической активности лактобацилл, бифидобактерий .48
1.7. Адгезивные свойства лактобацилл и бифидобактерий 50
1.8. Современные подходы в поиске новых пробиотиков 51
ГЛАВА 2. Собственные исследования 53
2.1. Выделение и идентификация представителей микробиоценоза кишечника здоровых людей 53
2.2. Отбор антагонистически активных штаммов лактобацилл и бифидобактерий 61
2.3. Биохимическая идентификация антагонистически активных штаммов лактобацилл и бифидобактерий 61
2.4. Генетическая идентификация антагонистически активных штаммов лактобацилл и бифидобактерий 66
2.5. Характеристика пробиотического потенциала лактобацилл и бифидобактерий .68
2.5.1. Определение антагонистической активности лактобацилл и бифидобактерий методом агаровых слоев 68 2. 5.2. Факторы патогенности лактобацилл и бифидобактерий 71
2.5.3. Чувствительность лактобацилл и бифидобактерий к желчи .71
2.5.4. Чувствительность лактобацилл и бифидобактерий к антимикробным препаратам 73
2.5.5. Способность бактерий сквашивать молоко.75
2.6. Адгезивная активность лактобацилл и бифидобактерий .76
2.7. Симбиоз лактобацилл и бифидобактерий 77
Заключение 80
Выводы 89 Практические рекомендации .91
Перспективные направления дальнейшей разработки темы 92
Список сокращений 93
Список литературы 94
Приложение .118
- Лактобациллы как пробиотики
- Современные подходы в поиске новых пробиотиков
- Биохимическая идентификация антагонистически активных штаммов лактобацилл и бифидобактерий
- Способность бактерий сквашивать молоко
Введение к работе
Актуальность проблемы
Микробиота кишечника человека представлена более 1014 микроорганизмов, активно участвующих в жизнедеятельности человека (пищеварительном процессе, обмене веществ, поддержании иммунного статуса и др.). Последние научные данные указывают на специфичность в составе кишечной микрофлоры, как у каждого индивидуума, так и у национальных и региональных групп населения (наличие различных энтеротипов) (Arumugan M., 2011). Огромное число микроорганизмов в кишечнике пока не позволяет провести их полный анализ. Существуют различные подходы, позволяющие охарактеризовать отдельные элементы микробиоты. Предлагаемый в данной работе анализ свойств бактерий рода Lactobacillus и Bifidobacterium из кишечной микробиоты здоровых жителей Центрального федерального округа России позволит разработать новые подходы и оценить региональную специфичность состава этих компонентов микробиоты. Данные могут быть использованы для разработки научной основы создания пробиотических препаратов, базирующихся на принципах персонализированной медицины.
Симбиотическая микрофлора людей, проживающих в регионах с разными климатическими условиями, бытовыми традициями населения, рационами питания, не одинакова, поскольку биоценозы имеют выраженный индивидуальный характер и заметно отличаются даже у индивидуумов одного региона. Еще более значительные различия отмечаются в микробной экологии окружающей среды, особенности которой в значительной степени отражаются на составе транзиторного компонента эндогенных микробных систем населения. Поэтому следует принимать во внимание тесную взаимосвязь между индигенной микрофлорой человека и экзогенным микробным миром, поскольку собственная микробиота человека является частицей биосферного микробного звена, а одной из важных функций эндогенной микроэкологической системы является поддержание гармоничных взаимоотношений человека с микробным сообществом окружающей среды. Между аутофлорой людей и экзогенным микроценозом региона эволюционно сформировались определенные компромиссные отношения, которые позволяют предупредить агрессивное воздействие на организм человека экзогенных потенциальных патогенов (Широбоков В.П., 2008).
Адаптация организма человека к экзогенному микроценозу региона прослеживается в онтогенезе. Так, у новорожденных начинает активно развиваться эффективный иммунный ответ в отношении экзогенной микрофлоры, специфичной для конкретного региона. Поэтому наиболее высокую эффективность обычно проявляют пробиотики, основу которых составляют «местные» штаммы микроорганизмов.
Повышенное внимание к пробиотическим препаратам в настоящее время вызвано ростом контингента лиц, имеющих микроэкологические нарушения и требующих коррекции собственной микрофлоры (Алешкин А.В., 2011). Наиболее эффективными и физиологичными средствами коррекционного воздействия на микрофлору при дисбактериозах являются биопрепараты с живыми культурами лактобацилл и бифидобактерий. Создание и широкое внедрение в медицину высококачественных пробиотиков на основе региональных биовариантов нормальной микрофлоры является в настоящее время актуальной и важной задачей (Янковский Д.С., 2008).
Степень разработанности темы исследования
Глобальные национальные и международные проекты сегодня активно занимаются изучением нормального микробиоценоза и его изменений при различных заболеваниях. Микробиота человека изучается в рамках программы Human Microbiome Project (), где определена полная нуклеотидная последовательность и аннотированы геномы 20 штаммов 14 видов лактобацилл. По проекту «Русский метагеном» осуществлено глубокое секвенирование свыше 150 образцов ДНК, выделенных из кала здоровых людей, проживающих на территории Российской Федерации. В географию выборки входили города из различных федеральных округов – Центрального (Москва), Северо-Западного (Санкт-Петербург), Приволжского (Казань, Самара, Саратов), Южного (Ростов-на-Дону), Западной Сибири (Омск, Новосибирск). В рамках проекта были выявлены территориальные различия микробиоты у людей, проживающих в России, но был показан общий схожий метаболизм микрофлоры у людей, проживающих в разных городах.
В 2003 году региональная оценка микробиоты кишечника проводилась у населения Западной Сибири. Установлено, что характер дисбиотических нарушений зависит от уровня загрязненности атмосферного воздуха. Распространенность дисбактериоза у жителей Западной Сибири составила 762±0,05 случаев на 1000 населения (Леванова Л.А., 2003). Исследования показывают, что качественные и количественные нарушения состава собственной микрофлоры кишечника связаны с увеличением численности E.coli со сниженной лактазной активностью, стафилококков и грибов рода Candida на фоне угнетения роста и снижения колонизирующей способности лактобацилл и бифидобактерий (Але-шукина А.В., 2012).
История создания пробиотических препаратов в России связана с именем Г.И. Гончаровой, которая в 1966 году впервые разработала технологию изготовления «Бифидумбактерина сухого». Среди представителей бифидофлоры от детей и взрослых был отобран ряд штаммов, перспективных как по технологическим, так и медико-биологическим характеристикам.
В настоящее время современные пробиотики получены в Германии, Бельгии, Дании. В России широкое применение находят отечественные пробиотики IV поколения, представляя собой живые B.bifidum1 (Бифидумбактерин форте, Пробифор) либо B.bifidum1+L.plantarum8RA-3 (Флорин форте), сорбированные (иммобилизованные на частицах измельченного активированного угля).
О.Г. Жиленковой проведены работы по выделению от здоровых детей производственно-перспективных штаммов бифидобактерий, обладающих определенными физиолого-биохимическими свойствами и антагонистической активностью (2011). При генетической идентификации лактобацилл и бифидо-бактерий в настоящее время используют секвенирование гена 16S рРНК (Боти-на С.Г., 2011), двухлокусное секвенирование (Субботина М.Е., 2009) и секве-нирование нескольких фрагментов генома (Кунда М.С., 2009).
В связи с тем, что эффективность пробиотических препаратов определяется совокупностью биологических свойств штаммов, входящих в их состав, большое внимание уделяется созданию поликомпонентных пробиотиков (Алешкин А.В., 2011; Амерханова А.М., 2009).
Однако ни один из отечественных или зарубежных пробиотических препаратов не создан на основе микроорганизмов, отвечающих этно-региональным критериям. Наиболее эффективным может быть использование штаммов, характерных для данного региона, которые могут адаптироваться к конкретному макроорганизму. Поэтому создание пробиотических препаратов, основанных на принципах персонализированной медицины и ориентированных на конкретные региональные группы населения страны, является инновационным направлением по улучшению здоровья населения.
Цель исследования
Охарактеризовать микробиоту кишечника коренных жителей
Центрального федерального округа Российской Федерации и селекционировать новые штаммы лактобацилл и бифидобактерий, перспективные для создания на их основе региональных пробиотических препаратов.
Задачи исследования
-
Выделить и идентифицировать микрофлору кишечника от практически здоровых людей в возрасте от 18 до 21 года, постоянно проживающих на территории Центрального федерального округа Российской Федерации.
-
Селекционировать лактобациллы и бифидобактерии, обладающие высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, перспективные для конструирования новых пробиотических препаратов для жителей Центрального федерального округа Российской Федерации.
-
Провести генетическую идентификацию антагонистически активных штаммов лактобацилл и бифидобактерий с помощью ПЦР-генотипирования и прямого секвенирования.
-
Определить адаптационный и пробиотический потенциал антагонистически активных штаммов лактобацилл и бифидобактерий.
-
Определить симбиотические взаимоотношения антагонистически активных штаммов лактобацилл и бифидобактерий.
Научная новизна
Впервые охарактеризована микробиота кишечника практически здоровых
людей в возрасте от 18 до 21 года, коренных жителей Центрального
федерального округа Российской Федерации, проживающих в Тверской,
Ярославской, Московской, Костромской, Брянской, Тульской, Воронежской, Калужской, Тамбовской, Смоленской и Владимирской областях. Установлено, что у 75% обследованных лиц выявлены нарушения микроэкологии кишечника с преобладанием дисбиоза I степени.
Получены новые данные о видовом разнообразии состава микробиоты при дисбиотических нарушениях кишечника у практически здоровых людей с доминированием представителей рода Bacillus среди условно-патогенной микрофлоры, что может служить основой для разработки персонифицированного подхода при коррекции дисбактериоза кишечника у населения Центрального федерального округа Российской Федерации.
Из кишечника здоровых людей с нормобиоценозом, коренных жителей Центрального федерального округа России, селекционированы новые штаммы лактобацилл и бифидобактерий, обладающие высокой степенью антагонизма по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, чувствительностью к антимикробным препаратам, широким спектром пробиотического и адаптационного потенциала, что соответствует современным требованиям общих фармакопейных статей (ОФС) 2013 года к штаммам микроорганизмов, перспективным для конструирования пробиотиков.
Теоретическая и практическая значимость
Характеристика бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium как потенциальных пробиотических штаммов, выделенных из кишечника практически здоровых жителей конкретного округа России, позволит установить региональную специфичность микробиоты и теоретически обосновать перспективы создания пробиотических препаратов, базирующихся на принципах персонализированной медицины и ориентированных на конкретные региональные группы населения страны.
Охарактеризованные 6 штаммов лактобацилл и 5 штаммов бифидобакте-рий с наиболее выраженными антагонистическими свойствами по отношению к условно-патогенной и патогенной бактериальной, а также грибковой микрофлоре желудочно-кишечного тракта могут быть использованы как штаммы-кандидаты для конструирования новых перспективных пробиотических препаратов.
Определенные в ходе проведения работы нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК Lactobacillus rhamnosus 32 к. аннотированы и зарегистрированы в базе данных GenBank (№ SUB168082).
Выделенные штаммы лактобацилл и бифидобактерий депонированы в музейной коллекции лаборатории генетики микроорганизмов Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук и могут быть использованы в дальнейших исследованиях ключевых генов, отвечающих за пробиоти-ческие свойства штаммов.
Материалы диссертации включены в электронный учебно-методический комплекс, использующийся в учебном процессе, на кафедре микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тверская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Методологическая база внедрена в работу бактериологической лаборатории научно-исследовательского центра Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тверская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации при изучении микробиоценозов различных биотопов организма человека.
Методология и методы исследования
Методология настоящего исследования включает современные методы научного познания и определяет характеристику компонентов, необходимых для решения поставленных задач. Теоретической основой исследования являются данные научной литературы, посвящнной проблеме коррекции дисбактериоза.
Предмет исследования - микроэкологические нарушения кишечника,
связанные с увеличением количества условно-патогенной микрофлоры и
снижением количества представителей нормобиоценоза. Объектом
исследования являлась микробиота клинического материала от практически
здоровых людей, проживающих в Центральном федеральном округе
Российской Федерации. В работе применялись бактериологические и
молекулярно-генетические методы исследований, а также методы
статистической обработки.
Материалы и методы
Работа проводилась на базе бактериологической лаборатории научно-
исследовательского центра Государственного бюджетного образовательного
учреждения высшего профессионального образования «Тверская
государственная медицинская академия» Минздрава России (г. Тверь).
Объект исследования
Материалом для исследования служили фекалии 156 практически здоровых студентов медицинской академии в возрасте от 18 до 21 года (120 девушек и 36 юношей), в третьем поколении коренных жителей Тверской, Ярославской, Московской, Костромской, Брянской, Тульской, Воронежской, Калужской, Тамбовской, Смоленской и Владимирской областей ЦФО РФ. Материал брали в зимний период. На момент обследования никаких жалоб на нарушение функций пищеварительного тракта добровольцы не предъявляли.
Микробиологические методы
Выделение и идентификацию микроорганизмов проводили по
общепринятым методикам на основании морфологических, культуральных и биохимических свойств (Никитин В.М., 1986).
Для изучения аэробной и анаэробной микрофлоры посевы производили на отечественные и импортные питательные среды: желточно-солевой агар, среда Эндо (г. Оболенск), Эритрит агар (ФГУП НПО «Микроген», Москва), Sabouraud Dextrose Agar, MRS Agar, Schaedler Agar с кровью, Muller-Hinton II агар (BBL). Посевы культивировали в аэробных, микроаэрофильных и анаэробных условиях с использованием микроанаэростатов и газогенераторных пакетов Gas Pack Plus (BBL) в течение 24-72 часов при температуре 37оС. Для биохимический идентификации использовали тест-системы: Enterotube II (BBL), API 20 C AUX, API 20 Staph; API 20 Strept, API 50 CH, API 20A (bio Mrieux).
Первичное исследование антагонизма лактобацилл и бифидобактерий к
тестовым культурам патогенных и условно-патогенных микроорганизмов
проводили согласно методике прямого антагонизма; после биохимической и
генетической идентификации антагонистическую способность
микроорганизмов выявляли методом отсроченного антагонизма (Блинкова
Л.П., 2003). В качестве тест-культур были использованы следующие штаммы:
Candida albicans АТСС 885-653, Salmonella enterica Typhimurium 415, Shigella
sonnei I фазы 941 из коллекции культур НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН;
Bacillus subtilis 534 из коллекции МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского;
Staphylococcus aureus АТСС 25923, Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas
aeruginosa ATCC 9027 из государственной коллекции патогенных
микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
Наличие лецитиназной, казеинолитической, уреазной, желатиназной,
нуклеазной, каталазной и гемолитической активности у лактобацилл и
бифидобактерий определяли по стандартным методикам (Общая
фармакопейная статья. Требования к штаммам микрорганизмов, используемым для производства пробиотиков для медицинского применения, 2013).
Чувствительность лактобацилл к желчи определяли измеряя оптическую плотность суточной бульонной культуры с желчью при длине волны 600 нм по отношению к исходному бульону. Чувствительность бифидобактерий к желчи определяли путем подсчета количества колоний после пересева бульонной культуры с желчью на плотной питательной среде по сравнению с контролем бульонной культуры без желчи. Способность микроорганизмов сквашивать молоко определяли по образованию творожистого осадка после внесения суточной бульонной культуры лактобацилл и 48-часовой культуры бифидобактерий в стерильное обезжиренное молоко (Общая фармакопейная статья. Требования к штаммам микрорганизмов, используемым для производства пробиотиков для медицинского применения, 2013).
Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам проводили методом диффузии в агар на среде Muller-Hinton с использованием стандартных дисков производства BBL согласно требованиям МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (2004) с учтом стандартов Института клинических и лабораторных стандартов, CLSI, США.
Степень адгезии бактерий определяли, пользуясь средним показателем адгезии (СПА) на эритроцитах человека О (I) группы Rh+ (Брилис В.И., 1986).
Биосовместимость исследуемых лактобацилл и бифидобактерий между собой изучалась методом совместного культивирования на плотной питательной среде (Глушанова Н.А., 2005).
Молекулярно-генетические методы
Видовую идентификацию лактобацилл и бифидобактерий проводили с помощью молекулярно-генетических методов на основе амплификации и секвенирования фрагментов гена 16S рРНК на базе Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (г. Москва). Амплификацию проводили в термоцикле-рах Терцик фирмы ДНК-Технология. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК проводили в НИИ ФХМ ФМБА РФ на приборе 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA) с набором реактивов Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA). Консенсусные последовательности сравнивали с помощью алгоритма BLASTn с базой данных GenBank.
Статистическая обработка результатов, анализ данных и программное обеспечение
Данные экспериментов обрабатывали с помощью прикладной программы STATISTICA (Stat Soft Russia) и «Excel». Для представителей нормофлоры, патогенных и условно-патогенных микроорганизмов были рассчитаны статистические параметры. Для биохимической идентификации использовали программу API WEB для ПК (bio Mrieux, Франция). Секвенированные последовательности сопоставляли с международной базой данных NCBI c помощью сервиса BLASTn ().
Личное участие автора в получении результатов
Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования,
анализе и обобщении полученных результатов. Вклад автора заключается в
непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач,
их экспериментально-микробиологической реализации до обсуждения
результатов в научных публикациях и докладах. В работе было использовано
16 различных методик. Все 575 культур микроорганизмов были выделены
автором совместно с лаборантом кафедры микробиологии и вирусологии с
курсом иммуногогии ГБОУ ВПО Тверская ГМА Минздрава России Червинец
Л.Ф. и идентифицированы автором по морфологическим, тинкториальным,
культуральным и биохимическим свойствам с использованием современных
биохимических тест-систем. У 11 отобранных штаммов были определены
антагонистическая активность прямым и отсроченным методами,
чувствительность к антимикробным препаратам, наличие факторов
патогенности (выявляли лецитиназную, казеинолитическую, уреазную, желатиназную, нуклеазную, каталазную и гемолитическую активности), чувствительность к желчи, способность сквашивать обезжиренное молоко, степень адгезии и биосовмесимость на плотной питательной среде.
Генетическую идентификацию 6 штаммов лактобацилл и 5 штаммов бифидобактерий проводили в Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (г. Москва) совместно с д-ром биол. наук Полуэктовой Е.У. и канд. биол. наук Незаметдиновой В.З. под руководством д-ра биол. наук профессора Даниленко В.Н. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК проводили в НИИ ФХМ ФМБА РФ на приборе 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Клинически здоровые люди в возрасте от 18 до 21 года, постоянно проживающие в Центральном федеральном округе Российской Федерации, обладают разной степенью нарушений микробиоценоза кишечника.
2. Селекционированные и охарактеризованные штаммы лактобацилл и бифидо-бактерий могут быть использованы как резерв с целью создания на их основе региональных пробиотиков для коррекции нарушений микрофлоры людей, проживающих в Центральном федеральном округе Российской Федерации.
Степень достоверности и апробация результатов исследования
Достоверность полученных данных основана на большом объме материала и современных методиках сбора и обработки информации. Исследование выполнено на высоком научно-методическом уровне с применением современных микробиологических, молекулярно-генетических, биоинформационных, статистических методов и международных баз данных. В работе использовано сертифицированное и поверенное оборудование. Положения диссертационной работы научно обоснованы данными литературы, результаты подтверждены статистически. Полученные данные документированы таблицами, графиками и фотографиями. Предложены рекомендации для дальнейшего использования селекционированных штаммов.
Диссертация апробирована на расширенном заседании кафедры микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тверская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (протокол №4 от 16.01.2014).
Результаты исследования представлены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (Омск, 2011); 8-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии (Санкт-Петербург, 2011); XII съезде Научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2012); X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012); XIII Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Владивосток, 2012); республиканской научно-практической конференции «Медицинское образование, наука и практика: традиции, инновации, приоритеты» (Актобе, 2012); V Всероссийском с международным участием медико-биологическом конгрессе молодых ученых «Симбиоз-Россия 2012» (Тверь); 9-ой Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии «Санкт-Петербург – Гастросессия-2012»; I межвузовской научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и медицинская наука» (Тверь, 2013).
Публикации: по теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 3 статьи в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, 1 — в других научных изданиях, 11 — в материалах конференций.
Объем и структура диссертации: работа состоит из введения, обзора литературы, главы собственных исследований, заключения, списка сокращений, списка литературы, приложения. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 рисунками, 21 таблицей. Библиографический указатель включает 203 наименования, из них 78 отечественных и 125 зарубежных источников литературы.
Лактобациллы как пробиотики
Физиологически ценным компонентом нормального микробиоценоза толстой кишки являются лактобациллы. Присутствуя практически во всех отделах ЖКТ, они вступают в сложные взаимодействия с другими микроорганизмами [133].
Лактобациллы обладают рядом важнейших свойств, положительно влияющих на поддержание микробного гомеостаза и активацию иммунитета:
— подавляют гнилостные и гноеродные бактерии;
— обладают антибактериальной активностью, которая связана с выработкой ими в процессе сбраживания углеводов молочной кислоты, спирта, лизоцима, ре-утерина, плантарицина, лактоцидина и лактолина; предохраняют слизистую оболочку кишечника от возможного внедрения патогенных микробов [85];
— выполняют важную роль в поддержании колонизационной резистентности организма за счет активной конкуренции с потенциальными патогенами за лимитируемые питательные субстраты и места адгезии на эпителии [115];
— стимулируют деятельность иммунной системы хозяина, индуцируют синтез интерферона и противовоспалительных интерлейкинов, способствуют об разованию специфических антител, воздействуют на специфический и неспеци фический иммунитет, стимулируя синтез иммуноглобулина А совместно с интерфероном, улучшают эпителиальную резистентность и активируют клетки моноцитарно-макрофагального ряда; стимулируют дифференцировку Т-клеток в сторону супрессорного и цитотоксического фенотипов, способны активировать экспрессию генов провоспалительных цитокинов [60, 89, 116, 157];
— участвуют в пищеварительной, биосинтетической, детоксицирующей и других функциях нормофлоры человека;
— играют значительную роль в метаболизме белков, жиров, углеводов, нуклеиновых кислот, желчных кислот, холестерина, гормонов, оксалатов;
— способны деградировать отдельные токсины, канцерогены, аллергены, препятствовать всасыванию токсичных продуктов метаболизма, в первую очередь аммиака и отдельных аминов [153];
— обладают свойством вступать в антагонизм по отношению к потенциальным патогенам [125, 164, 179].
В последние годы вызывает интерес способность отдельных кислоторези-стентных лактобацилл пролиферировать в желудке и конкурировать с Helicobacter pylori, способствуя элиминации данных микроорганизмов [95, 99, 191].
Лактобациллы снижают встречаемость диареи, ассоциированной с антибио-тикотерапией, и колитов у взрослых и детей, вызываемых C.difficile, оказывают положительный эффект при лечении синдрома раздраженного кишечника [94, 106, 135], заболеваниях урогенитального тракта и бактериальных вагинозов у женщин [92, 114, 170], при кариесе [186], аллергических заболеваниях [90].
По данным экспертной комиссии LABIP (TheLacticAcidBacteriaIndustrialPlatforrm), имеется достоверная информация о положительном воздействии лактобактерий на усвоение лактозы, подавлении под их влиянием некоторых возбудителей кишечных заболеваний, снижении активности ферментов фекалий, которые могут играть роль в формировании рака толстого кишечника, а также о регулярном воздействии лактобактерий на иммунную систему [167].
Вводимые извне лактобациллы стимулируют рост собственной лакто- и би-фидофлоры, обладают противораковой активностью, стимулируют различные звенья иммунитета: при оральном назначении Lactobacillus acidophilus более чем в 4 раза увеличивается синтез IgA [154]. Показано, что у больных с постинфекционным синдромом раздраженного кишечника при употреблении пробиотического продукта, содержащего лактобациллы, отмечается рост уровня секреторного иммуноглобулина класса А в слюне (у 83 % пациентов); снижение более чем в 2 раза провоспалительных цитокинов — интерлейкина-1 (IL-1) и ферритина; снижение содержания фактора некроза опухоли- (ФНО-) и интерферона- (IFN-); незначительное снижение уровня противовоспалительного интерлейкина-4 (IL-4) [154].
В основе антибактериальной активности лактобацилл лежит множество факторов, важнейшим среди которых является производство молочной кислоты [49,50].
Представители рода Lactobacillus подразделяются на три группы в зависимости от ферментативных возможностей: гомоферментативные, которые продуцируют более 85% молочной кислоты из глюкозы; гетероферментативные, которые продуцируют только 50% молочной кислоты и значительное количество этанола, уксусной кислоты и двуокиси углерода; гетероферментативные, выделяющие D- и L-молочные кислоты, уксусную кислоту и двуокись углерода [120].
Проведены исследования, посвященные изучению действия молочной кислоты лактобацилл на грамотрицательные бактерии, в частности на S. enterica serovar typhimurium [108, 140, 201], E.coli O157:H7 [161], H. pylori [181], Pantoea agglomerance VTT-E-90396 и Fusarium avenaceum VTT-D-80147 [104]. Результаты последних исследований in vitro показали, что L. crispatus наиболее эффективно подавлял рост Campylobacter jejuni засчет молочной кислоты, по сравнению с другими лактобациллами, L. acidophilus, L. gallinarum и L. helveticus. Вагинальные лактобациллы L. crispatus, L. gasseri, L. jensenii подавляли рост N. gonorr-hoeae в анаэробных условиях засчет значительного подкисления среды [120].
S. Menard при исследовании противоинфекционной и иммуностимулирующей активности L.plantarum показал, что представители этого вида лактобацилл обладают выраженной способностью в анаэробных условиях образовывать уксусную и молочную кислоты, а также катаболизировать аргинин и генерировать окись азота, которая образуется в ЖКТ за счет конститутивных ферментов лакто-бацилл, участвует в таких функциях кишечника, как бактериостаз, секреция муку-са, перистальтика, обеспечение местного иммунитета [158].
Кроме молочной кислоты лактобациллы продуцируют уксусную, ацетоук-сусную, хлористоводородную и пропионовую кислоты, которые могут оказывать подавляющее воздействие на H. pylori [193].
Лактобациллы, как представители нормофлоры влагалища, подавляют рост Streptococcus agalactiae, продуцируя органические кислоты: уксусную и молочную. При совместном культивировании лактобацилл и стрептококков значительное угнетение роста последних наблюдалось уже через 4 часа инкубации [104].
Современные подходы в поиске новых пробиотиков
Способность к адгезии кишечных лактобацилл и бифидобактерий изучается, используя клетки линий Caco-2 и HT29-MTX. G.J. Chauviere с соавторами [96] обнаружил, что не все штаммы лактобацилл адгезировались на энтероцитоподобных клетках Caco-2, указывая на штаммоспецифичность. Некоторые штаммы лактобацилл, например, L.acidophilus BG2FO4 и LB, L. rham-nosus DR20, L.acidophilus HN017, L. casei Shirota, L. rhamnosus LC-705, прикрепляются к энтероцитоподобным клеткам Caco-2 [98, 129, 190]. Как и лактобациллы, штаммы бифидобактерий проявляют адгезивность. B.adolescentis, B.angulatum, B.bifidum, B.breve, B.catenulatum, B.infantis, B.longum, B. Pseudocate-nulatum, B.breve4, B.infantis1, B.lactis DR10 проявили адгезивную активность к щеточной каемке клеток Caco-2 и к слизи, секретируемой клетками HT29-MTX [86, 100]. Механизм прикрепления штаммов B.longum к клеткам Caco-2 связан с аутоаггрегационными и гидрофобными свойствами бактерий [103]. Было обнаружено, что бифидобактерии прикреплялись к слизи, выделенной от пожилых людей, в меньшей степени, чем от других возрастных групп. Этот факт является фактором, способствующим снижению колонизации бифидобактерий у пожилых людей [107]. У штаммов B.lactis Bb12 адгезия увеличивалась в присутствии L.casei rhamnosus GG и L.bulgaricus.
Адгезия лактобацилл и бифидобактерий происходит засчет пассивных сил, электростатического и гидрофобного взаимодействия, а также специфических структур [117]. L.johnsonii La1 проявляет высокую кальций независимую адгезив-ность по отношению к культуре клеток Caco-2 [100]. Выделен поверхностный протеин L.fermentum 104R с молекулярной массой 29 kDa, который может вызывать адгезию, будучи изолированным из супернатанта клеточной культуры бактерии. In vivo показано, что протеин участвует в прикреплении этого штамма к сли 51 зистой оболочке тонкого кишечника [88, 172]. Установлено, что липотейхоевая кислота отвечает за адгезию L.johnsonii La1. L.fermentum имеет поверхностные лектиноподобные структуры белковой природы, благодаря которым штамм проявляет свои адгезивные свойства [122]. Таким образом, лактобациллы и бифидобактерии содержат большое количество разнообразных внешних структур, отвечающих за взаимодействие с эпителиальными клетками кишечника. Есть данные указывающие на то, что некоторые штаммы бифидобактерий колонизируют пищеварительный тракт in vivo. У мышей - гнотобиотов C3H/He/Oujco при энтеральном назначении штаммов B.infantis -1, проявляющих адгезивность in vitro обнаружен высокий уровень этих бактерий в слизистой оболочке различных отделов желудочно-кишечного тракта и в кишечном содержимом. Жизнеспособные B. adolescentis выделялись из организма мышей даже спустя 5 дней после окончания энтерального введения [127]. Современные подходы в поиске новых пробиотиков Современные методики оценки кишечной микробиоты позволяют выявлять ее нарушения и совершенствовать подходы для создания новых пробиотиков [162]. В России широкое применение находят отечественные пробиотики IV по коления. Министерством здравоохранения РФ в 2013 году разработан новый ком плекс общих фармакопейных статей (http://www.rosminzdrav.ru/docs/mzsr/regulation/81), определяющих основные тре бования к штаммам микроорганизмов, используемых в производстве пробиотиков для медицинского применения [52, 121]. Современные источники указывают на то, что наиболее эффективным может быть использование штаммов, характерных для данного региона, которые могут адаптироваться к конкретному макроорганизму. Поэтому актуальным является создание пробиотических препаратов, основанных на принципах персонализи рованной медицины; их назначение должно зависеть от группы населения с определенными фенотипами, генотипами, образом жизни, выбором питания, экологической обстановкой [82, 91].
Несмотря на большое количество информации, на данный момент отсутствуют сведения о генетической особенности лактобацилл и бифидобактерий, выделенных от различных этно-географических групп населения. В связи с этим ак-тульным считается разработка методологии сравнительного исследования нор-мофлоры человека, изучение их действия in vitro для выделения высокоантагонистических пробиотических штаммов с целью создания новых пробиотиков.
Альтернативой классической биохимической идентификации становится метод генотипирования с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) [63]. Использование генетических платформ второго поколения позволяет проводить метагеномные исследования не только на основании анализа генов 16S рРНК, но и по полному секвенированию генов микроорганизмов, их плазмид и вирусов. Разработка новых и оптимизация известных молекулярно-генетических методик индикации и точной видовой идентификации бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium является актуальной, практически значимой и своевременной задачей, которой уделяется большое внимание как отечественными, так и зарубежными исследователями [19, 93, 174, 192].
Биохимическая идентификация антагонистически активных штаммов лактобацилл и бифидобактерий
Критерием отбора служило первичное определение антагонистической активности штаммов лактобацилл и бифидобактерий, которая изучалась методом перпендикулярных штрихов (прямого антагонизма) по отношению к индикаторному штамму.
Из 124 изолятов лактобацилл и 87 бифидобактерий было выделено 6 антагонистически активных штаммов лактобацилл и 5 штаммов бифидобактерий от людей с нормобиоценозом, проявляющих антагонизм к индикаторным культурам Staphylococcus aureus АТСС 25923, Candida albicans АТСС 885-653, Escherichia coli АТСС 25922. Далее проводили накопление чистой культуры на MRS и Schaedler Agar для идентификации и дальнейшего изучения.
Биохимическая активность лактобацилл определялась с помощью тест-системы api 50 CH (bio Mrieux) и программного обеспечения API WEB по 50 Генетическую идентификацию лактобацилл и бифидобактерий проводили на базе лаборатории генетики микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Определение нуклеотидной последовательности ПЦР-продуктов позволяет подтвердить видовое определение штаммов и выявляет штаммовые различия (обычно 1-3 нуклеотида). Для определения вида лактобацилл по гену 16S РНК использовали стандартные праймеры 27f (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) и 1492r (GGTTACCTTGTTACGACTT); ожидаемый размер ПЦР-фрагментов – 1465 пн [147]. Результаты представлены в таблице 12. Результаты, полученные после биохимической и генетической идентификации лактобацилл, показали, что у 5 штаммов лактобацилл, подтверждена видовая принадлежность, полученная по биохимическим тестам. У 1 штамма генетическое исследование изменило его видовое название: L. planta-rum 17 к. на L.casei 17 к. (таблица 13). Результаты, полученные после биохимической и генетической идентификации бифидобактерий (таблица 15), показали, что у 2 штаммов бифидобактерий подтверждена видовая принадлежность, полученная по биохимическим тестам. У 2 штаммов генетическое исследование изменило его видовое название: B. bifidum 191 на B. adolescentis 191, B. adolescentis 201 на B. longum 201, и у 1 штамма биохимическая идентификация не определила видовую принадлежность штамма.
Определение антагонистической активности методом агаровых слоев или методом отсроченного антагонизма проводили, используя в качестве тестовых штаммов Candida albicans ATCC 885-653, Salmonella enterica Typhimurium 415, Shigella sonnei I фазы 941, Bacillus subtilis 534 из коллекции культур НИИЭМ им.
Н. Ф. Гамалеи РАМН г. Москва; Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeru-ginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus ATCC 25923 из государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
В результате отобранные штаммы лактобацилл и бифидобактерий проявили антагонизм ко всем тест-культурам условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, зоны подавления роста которых составили более 20 мм (таблицы 16, 17, рисунок 8).
При исследовании 6 антагонистически активных штаммов лактобацилл и 5 антагонистически активных штаммов бифидобактерий на наличие фенотипических признаков, ассоциированных с синтезом ферментов агрессии, не обнаружено каталазной активности, микробных протеаз (казеиназа и желатиназа), нуклеазной активности (ДНК-аза и РНК-аза), уреазной, гемолитической и лецитиназной активности.
Cкорость размножения исследуемых бульонных культур характеризовалась величиной оптической плотности растущих бульонных культур по отношению к стерильному бульону. Величина оптической плотности сравнивалась с контролем, где происходило размножение исследуемого штамма в отсутствие желчи.
При исследовании чувствительности лактобацилл к желчи (рисунок 9, таблица 18) было выявлено, что желчь не подавляет рост данных штаммов. У двух штаммов происходило периодическое увеличение и уменьшение оптической плотности при различных концентрациях желчи (L.rhamnosus 38 k. и L.plantarum 46 k.). У трех штаммов после достижения минимального пика оптической плотности происходило равномерное ее повышение (L.rhamnosus K9 L, L.plantarum 32 k., L.casei 17 k.). И у одного штамма после достижения максимального пика оптической плотности происходило равномерное ее снижение (L.plantarum 36 ст.).
При исследовании чувствительности бифидобактерий к желчи выявлено, что 10 и 20% концентрация желчи подавляла рост всех штаммов бифидобактерий. Минимальная концентрация желчи, подавляющая рост всех бифидобактерий за исключением B. longum 264, составила 0,625% (таблица 19). B. longum 264 была чувствительна ко всем концентрациям желчи, даже к минимальной 0,625%.
Способность бактерий сквашивать молоко
Все штаммы лактобацилл показали способность сквашивать молоко через 12-14 часов. B. bifidum 172 сквашивал молоко через 18-20 часов, B.longum 264 – через 48 часов, у остальных штаммов бифидобактерий не выявлена способность сквашивать молоко.Симбиоз лактобацилл и бифидобактерий определялся методом совместного культивирования на плотной питательной среде (рисунки 14, 15).
В результате установлено, что лактобациллы и бифидобактерии не оказывали взаимного антагонистического воздействия, так как при культивировании отсутствовали зоны подавления роста микроорганизмов (рисунки 16, 17).
Микрофлора человека принимает участие в различных метаболических и биосинтетических процессах: синтезе витаминов, гормонов, антибиотических веществ, усилении физиологической активности кишечника, гидролизе токсических продуктов метаболизма белков, липидов, углеводов, деконъюгации солей желчных кислот и др. Она обеспечивает колонизационную резистентность желудочно-кишечного тракта в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов [72]. Микробиота человека неодинакова у людей разных континентов, стран и даже регионов, так как существует тесная взаимосвязь между индигенной микрофлорой человека, макроорганизмом и экзогенными факторами окружающей среды. При дисбиотических нарушениях в кишечнике наблюдается снижение представителей нормофлоры, избыточный рост условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, общее снижение иммунной защиты макроорганизма, что требует коррекции препаратами-пробиотиками. Создание эффективных пробиотиков, направленных на коррекцию микрофлоры людей, проживающих в определенном регионе, является в настоящее время актуальной и важной задачей.
В связи с этим цель нашей работы охарактеризовать микробиоту кишечника здорового человека, проживающего в Центральном федеральном округе Российской Федерации, и селекционировать новые штаммы лактобацилл и бифидобак-терий для создания региональных пробиотических препаратов.
В данной работе определен качественный и количественный состав микробиоты кишечника здоровых людей в возрасте от 18 до 21 года, проживающих на территории ЦФО РФ. Показано, что нарушения микроэкологии кишечника выявляются у 75% здоровых людей. Нами были не только подтверждены данные литературы о превалировании родов Lactobacillus, Entero-coccus, Bifidobacterium, Bacteroides среди представителей нормофлоры [2, 7], но и внесены дополнения, которые показали, что частота встречаемости лактобацилл составила 79%, энтерококков - 61%, бифидобактерий - 55%, бактероидов - 42%. Распространенность других микроорганизмов составила менее 40%, а именно пептострептококки встречались в 26% случаях, эшерихии - в 11%, лептотрихии и клостридии - в 5%, непатогенные стафилококки - в 1%.
В нашем исследовании некоторые представители патогенной и условно-патогенной микрофлоры высевались в большем процентном соотношении, чем по данным научных источников: бациллы - в 35% случаев (по данным литературы -не превышает 30%), актиномицеты - в 26% [13, 28]. Кандиды высевались только в 17% случаев, хотя анализ литературы показывает, что частота носительства грибов рода Candida у здоровых лиц достигает в кишечнике 65-80% [8, 10]. Патогенные стафилококки были выявлены лишь в 4%, хотя в последних исследованиях Е.В. Диц и П.Н. Соколов указывают на то, что чаще всего при дисбактериозе выделяется S. aureus (30%) [28].
При определении количества представителей нормофлоры выявлено, что средние значения колебались от 6,26 до 7,72 lg КОЕ/г. Количество лактобацилл составило - 7,25±0,08 lg КОЕ/г, энтерококков - 7,17±0,09 lg КОЕ/г, бактероидов -7,25±0,09 lg КОЕ/г, пептострептококков - 7,15±0,13 lg КОЕ/г, эшерихий -7,58±0,18 lg КОЕ/г, стафилококков - 6,26±0,74 lg КОЕ/г, лептотрихий - 7,33±0,17 lg КОЕ/г, клостридий - 7,04±0,28 lg КОЕ/г, что соответствует последним данным экспериментальных исследований [13, 28]. По данным М.Д. Ардатской (2010) бифидобактерии обнаруживаются в количестве более 8 lg КОЕ/г, а по нашим данным количество бифидобактерий оказалось ниже, составив 7,72±0,07 lg КОЕ/г.
Количество патогенных и условно-патогенных микроорганизмов было высоким по сравнению с данными литературы и составило для бацилл - 7,86±0,14 lg КОЕ/г, актиномицет - 7,74±0,08 lg КОЕ/г, кандид - 6,43±0,17 lg КОЕ/г, стафилококков - 6,48±0,3 lg КОЕ/г. Данные литературы указывают на присутствие этих микроорганизмов в количестве, не превышающем 6 lg КОЕ/г [8]. Нами впервые определена ведущая роль представителей рода Bacillus в дисбиотических нарушениях кишечника у клинически здоровых людей. Наши исследования выявили у здоровых людей представителей рода Bacillus, которые встречались в 35% случаев. Данный микроорганизм превалировал среди условно-патогенной микрофлоры и высевался в большом количестве - 7,86±0,14 lg КОЕ/г. По данным литературы, в последнее время подобная тенденция не прослеживается.
В результате наших исследований нормобиоценоз кишечника выявлен только у 25% клинически здоровых людей, что соответствует данным литературы. По мнению разных авторов, дисбактериоз кишечника встречается у 70–90% здорового населения разных возрастных групп [6, 28]. В нашей работе у большинства добровольцев (52%) определена 1 степень микробиоценозных изменений, причем количество ассоциаций микроорганизмов в среднем составило 3 рода представителей в основном нормофлоры и УПМ (Lactobacillus, Bifidobacte rium, Enterococcus, Bacteroides, Peptostreptococcus, реже Bacillus, Candida и Acti nomyces). С увеличением степени дисбактериоза количество ассоциаций микроогранизмов уменьшается, но в состав микробиоты начинают входить условно-патогенные микроорганизмы (Bacillus, Candida), вытесняя представителей нормофлоры (Lactobacillus и Bifidobacterium). При бактериологическом обследовании кишечной микрофлоры некоторыми авторами [55] было выявлено, что выделение грибов всегда сопровождалось обнаружением других видов условно-патогенных бактерий, и кандиды не обнаруживались в монокультуре. В нашей работе кандиды часто выделялись с бациллами, но также присутствовали и в ассоциациях с представителями нормофлоры. Для профилактики и лечения дисбактериоза желудочно-кишечного тракта применяют препараты-пробиотики, самыми перспективными среди которых являются лактобациллы и бифидобактерии, как наиболее эффективные и физиологичные средства коррекционного воздействия на микрофлору [27, 48, 83, 84, 97]. Микрофлора людей, проживающих в разных регионах, различающихся неоднородным климатом, бытовыми условиями, рационами питания и т.д., не является одинаковой по спектру встречаемости и количеству. В нашей работе была проведена селекция антагонистически активных штаммов лактобацилл и бифидобактерий от здоровых людей Центрального федерального округа России по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, нуклеотидной последовательности гена 16S РНК, отсутствию ферментов ассоциированных с факторами патогенности, адгезивной способности, по чувствительности к антимикробным препаратам, а также по антагонистической активности к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. В результате изучения антагонистической активности было отобрано 6 антагонистически активных штаммов лактобацилл и 5 штаммов бифидобактерий, проявивших антагонизм в методе перпендикулярных штрихов по отношению к тестовым штаммам Staphylococcus aureus ATCC 25923, Candida albicans АТСС 885-653, Escherichia coli АТСС 25922.
