Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Симбиоз организма и микрофлоры его пищеварительного тракта 11
1.2. Пробиотические препараты 17
1.2.1. История становления предмета и термина 17
1.2.2. Использование пробиотиков в сельском хозяйстве 21
1.2.3. Механизмы действия пробиотиков 26
1.3. Ферментные препараты 36
1.3.1. Применение ферментов в кормлении сельскохозяйственной птицы: предпосылки, необходимость 36
1.3.2. Разнообразие кормовых ферментных препаратов 41
1.3.3. Влияние экзогенных ферментов на процессы пищеварения 44
1.4. Микробиологические препараты с ферментативным эффектом 48
1.5. Проблемы сохранности кормовых добавок и пути их решения 56
2. Материалы и методы исследований 58
2.1. Объекты исследований 58
2.1.1. Штаммы микроорганизмов 58
2.1.2. Животные 60
2.2. Питательные среды для хранения и культивирования микроорганизмов 60
2.3. Методы изучения культурально-морфологических свойств целлюлозолитических бактерий 62
2.4. Методы изучения целлюлозолитической активности микроорганизмов 63
2.5. Методы определения количества микробных клеток в разных субстратах 64
2.6. Методы изучения устойчивости микроорганизмов к термообработке в лабораторных и промышленных условиях 65
2.7. Тестирование штамма Bacillus pantothenticus №1-85 на наличие патогенности и токсигенности 68
2.8. Методы изучения технологических аспектов культивирования Bacillus pantothenticus №1-85 70
2.9. Изучение влияния Bacillus pantothenticus №1-85 на продуктивные качества цыплят-бройлеров 72
3. Экспериментальная часть. Результаты исследований 76
3.1. Изучение влияния температурного воздействия на жизнеспособность микроорганизмов препарата целлобактерин в лабораторных условиях 76
3.2. Изучение влияния гранулирования и экспандирования на жизнеспособность микроорганизмов препарата целлобактерин в условиях производственного эксперимента 80
3.3. Отбор наиболее активных изолятов целлюлозолитических бактерий из коллекции ГНУ ВНИИСХМ 86
3.4. Изучение свойств отобранного штамма целлюлозолитических бактерий 96
3.5. Тестирование штамма Bacillus pantothenticus №1-85 на наличие патогенности и способность образовывать токсины 100
3.6. Изучение параметров роста и отработка технологии высушивания культуры Bacillus pantothenticus №1-85 103
3.7. Изучение влияния штамма Bacillus pantothenticus №1-85 на продуктивность цыплят-бройлеров 118
3.8. Изучение сохранности Bacillus pantothenticus №1-85 в кормовых смесях при экспандировании и гранулировании 126
3.9. Сохранность бактерий штамма № 1-85 в комбикорме в течение срока его хранения 130
Заключение 132
Выводы 138
Практические предложения 140
Литература 141
Приложения 154
- Использование пробиотиков в сельском хозяйстве
- Микробиологические препараты с ферментативным эффектом
- Методы изучения устойчивости микроорганизмов к термообработке в лабораторных и промышленных условиях
- Изучение влияния температурного воздействия на жизнеспособность микроорганизмов препарата целлобактерин в лабораторных условиях
Введение к работе
Животные с момента их рождения вступают в сложные симбиотические взаимоотношения с микроорганизмами, населяющими их пищеварительный тракт. Нормальная кишечная микрофлора оказывает влияние на формирование иммунной системы молодых животных, участвует в инактивации некоторых продуктов распада и препятствует размножению в их кишечнике условно-патогенных бактерий (Чахава, 1972; Малик, 2002).
В некоторых случаях такой симбиоз является жизненно необходимым, так как микроорганизмы предоставляют свои ферментные системы для расщепления недоступных высшим организмам полимеров - например растительной клетчатки (Hungate, 1966; Пивняк и др., 1982; Russel et al., 2001).
Доказано, что химический состав пищи, потребляемой высшим организмом, оказывает непосредственное влияние на качественные и количественные характеристики микробного сообщества кишечника (Любянскене и др., 1989). Следовательно, неправильное кормление животных приводит к нежелательной сукцессии микробиоценоза их желудочно-кишечного тракта, что является причиной снижения продуктивности и возникновения ряда заболеваний (Russel et al., 1996; Nagaraja et al., 1998).
Рацион сельскохозяйственных животных и птицы включает большое количество растительных компонентов. У крупного рогатого скота и других видов жвачных в процессе эволюции сформировался мощный аппарат, состоящий из специальных отделов пищеварительного тракта и населяющих их микроорганизмов, позволяющий им эффективно использовать растительную клетчатку.
Животные с однокамерным желудком и птицы лишены такой возможности. Существует ряд подходов корректирующих процессы пищеварения и направленных на стабилизацию продуктивности при повышении в рационе доли труднопереваримых растительных полимеров.
Во-первых, практикуется использование сухих
стабилизированных форм ферментов, получаемых при культивировании естественных продуцентов (грибов, бактерий). Существуют разные препараты из этой серии, отличающиеся, как по ферментативному спектру, так и по активности входящих в них компонентов. Чаще всего применяют ферменты, действие которых направлено на целлюлозу, промежуточные продукты её гидролиза, а также на некрахмальные полисахариды и фитин. При включении ферментных препаратов в низкопитательные рационы сельскохозяйственных животных и птицы удаётся добиться повышения их продуктивности и снижения затрат корма (Околелова и др., 2001; Пирс, 2002).
Второе, не менее крупное направление - использование пробиотиков - препаратов на основе штаммов полезных микроорганизмов, чаще всего изолированных из желудочно-кишечного тракта животных или человека. Подавляющее число добавок этой группы создано на основе классических пробиотических бактерий (pp. Lactobacillus, Bifidobacterium). Занимая свободные экологические ниши в кишечнике животных, и продуцируя, ряд биологически активных веществ, они оказывают положительное воздействие на здоровье животных (Малик, 2001; Guamer, 2003). Основной эффект от их использования, складывается из повышения сохранности поголовья, а также получения экологически чистой продукции.
И наконец, среди микробиологических добавок есть препараты, способные заменить в рационах животных как кормовые ферменты так и пробиотики (Эрнст, 1991; Тараканов, 1998; Лаптев и др., 2003). Микроорганизмы, входящие в их состав продуцируют ряд ферментов, отсутствующих у высших животных.
Одним из таких препаратов является целлобактерин, созданный коллективом учёных Всероссийского научно - исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии, на основе ассоциации целлюлозолитических и молочнокислых бактерий.
Для наиболее полноценного использования той или иной добавки необходимо найти оптимальный путь включения её в состав комбикорма. Как правило, он заключается во внесении дополнительных компонентов в комбикорм во время его изготовления. Это позволяет применить более точную дозировку, добиться равномерного распределения добавки в комбикорме и снизить затраты труда. Особенно важен такой подход при использовании хозяйством гранулированных кормов, так как равномерное смешивание мелкодисперсных препаратов с готовыми гранулами практически невозможно.
На сегодня существует проблема сохранности добавок в комбикормах, подвергающихся различным видам термообработки. Многие производители комбикормов используют процессы экспандирования и экструдирования для повышения переваримости растительных компонентов рациона и снижения контаминации конечного продукта. При этом становится невозможным включение термолабильных добавок в состав комбикорма при его изготовлении.
В связи с этим основной целью нашей работы являлось выделение штаммов термостойких целлюлозолитических бактерий и
«
создание на их основе препарата, способного повышать продуктивность сельскохозяйственных животных и птицы.
В задачи исследований входило:
Изучить влияние температурного воздействия на жизнеспособность микроорганизмов препарата целлобактерин в лабораторных и производственных экспериментах.
Провести отбор среди штаммов целлюлозолитических бактерий, из коллекции ГНУ ВНИИСХМ, по критериям ферментативной активности и термоустойчивости.
Изучить культурально - морфологические свойства наиболее активного изолята и отработать технологию его выращивания в производственных условиях, с последующим высушиванием на твёрдом носителе.
Изучить воздействие термообработки комбикорма на жизнеспособность отобранного штамма и проанализировать его влияние на продуктивность цыплят-бройлеров в промышленных условиях.
Научная новизна
1. В результате выполненной работы впервые получены данные по влиянию различных процессов термообработки комбикорма на сохранность в нём полезных микроорганизмов. Установлены пороговые значения температуры производственных процессов, превышение которых делает использование препарата целлобактерин неэффективным.
2- Впервые был проведён направленный отбор среди изолятов целлюлозолитических микроорганизмов коллекции ГНУ
ВНИИСХМ, завершившийся выделением наиболее
ферментативно-активных и термостойких штаммов. 3. Впервые изучено влияние целлюлозолитических бактерий рода Bacillus на продуктивность сельскохозяйственной птицы.
Апробация работы
Материалы диссертации были доложены:
на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых "Биотехнология - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке" (г. Санкт-Петербург, 30 окт. 2001 г);
на региональной конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (г. Саратов, 26-27 марта 2002 г);
на II международной научно-практической конференции «Научно-технический прогресс в животноводстве России — ресурсосберегающие технологии производства экологически безопасной продукции животноводства» (Дубровицы, 29 сентября 2003 г);
на III научно-практической конференции «Перспективные направления в производстве и использовании комбикормов и балансирующих добавок» (Дубровицы, 17 декабря 2003 г);
Публикации
Основные результаты диссертации опубликованы в 9 печатных работах.
Структура и объём диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения,
заключения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений. Работа изложена на 161 странице машинописного текста, содержит 9 рисунков и 27 таблиц. Библиография включает 137 ссылок наименований работ, из них 89 зарубежных авторов.
Использование пробиотиков в сельском хозяйстве
Возможность использования пробиотических препаратов в сельском хозяйстве впервые обозначилась в 1968 г., когда японская фирма Nissin Fleur Milling Со Ltd разработала первый коммерческий препарат для ветеринарии на основе бифидобактерий, выделенных от животных, (Шендеров, Манвелова, 1997). С тех пор интерес к пробиотикотерапии удерживался на среднем уровне, время от времени озаряясь какой-либо новой разработкой. Однако в последнее десятилетие сформировался комплекс условий, который заставил исследователей заняться этой проблемой более плотно. Это ухудшившаяся экологическая обстановка, невозможность применения кормовых антибиотиков в прежних объёмах и более жёсткие требования к конечной продукции. Всё это привело к тому, что появилось довольно много препаратов для животных, созданных на основе различных видов микроорганизмов, причём последние не всегда выделяются из желудочно-кишечного тракта. В данной части обзора рассмотрено использование пробиотиков в сельском хозяйстве для животных и птицы.
Все препараты, содержащие культуры живых полезных микроорганизмов можно разделить по форме выпуска, составу препарата и характеру его действия.
В зависимости от формы выпуска пробиотики бывают жидкими, пастообразными, лиофильно высушенными, а также высушенными путём нанесения микроорганизмов на какой-либо субстрат. В качестве последнего могут выступать различные субстанции: лигнин, вермикулит, шроты, отруби. В некоторых случаях носитель помимо своей основной функции выполняет также роль сорбента. Для мелких домашних животных в последнее время стали производиться пробиотические препараты.
Классифицировать пробиотики в зависимости от состава входящих в них микроорганизмов можно следующим образом: S Классические пробиотики - препараты на основе бактерий pp. Lactobacillus и Bifidobacterium. S Препараты на основе бактерий pp. Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Leuconostoc. S Препараты на основе дрожжей p.Saccharomyces. S Препараты на основе бактерий .Bacillus. S Препараты на основе целлюлозолитических бактерий. При изготовлении пробиотиков отбирают штаммы, обладающие высокой естественной резистентностью неплазмидной природы и адгезивной способностью (Коршунов и др., 1996). Шендеров и Манвелова в своей работе (Шендеров, Манвелова, 1997) указывают следующие требования, предъявляемые к указанным микроорганизмам: микроорганизмы должны оказывать положительный эффект на организм хозяина; при длительном использовании не должны вызывать побочных эффектов; должны обладать колонизационным потенциалом, т.е. сохранять жизнеспособность в желудочно-кишечном тракте до достижения максимально положительного эффекта; обладать стабильными характеристиками, как в клинической практике, так и в технологическом плане. Шендеров (Шендеров, 1998) в зависимости от состава пробиотиков, выделяет следующие их категории: 1. Монопробиотики - субстанции, содержащие представителей только одного вида бактерий. 2. Ассоциированные пробиотики - субстанции, представляющие собой ассоциацию штаммов нескольких видов микроорганизмов (от 2 до 30). Также пробиотики подразделяются на: 1. Синбиотики - комплексные препараты на основе живых микроорганизмов и пребиотиков. 2. Гетеропробиотики - назначаются вне зависимости от видовой принадлежности хозяина, от которого первоначально были выделены штаммы пробиотических бактерий. 3. Гомопробиотики - назначаются только представителям того вида животных, от которых были выделены соответствующие штаммы. 4. Аутопробиотики - штаммы нормальной микрофлоры, изолированные от конкретного животного и предназначенные для коррекции его микроэкологии. В настоящее время Центром контроля качества и стандартизации кормовых добавок и ветеринарных препаратов (ФГУ ВГНКИ) зарегистрировано более тридцати пробиотиков различного состава. Среди них встречаются моно-, поликомпанентные и комбинированные формы (Малик, Панин, 2001). Большая их часть представлена препаратами на основе молочнокислых бактерий, затем следуют препараты на основе бациллярных форм, и наконец, единичные пробиотики, включающий дрожжи и целлюлозолитические микроорганизмы (рис. №1). Некоторые сведения о пробиотиках для сельскохозяйственных животных, встречающихся в настоящее время на Российском рынке, представлены в таблице № 1.
Микробиологические препараты с ферментативным эффектом
Известно также, что смена рациона, перевод молодых животных в следующую возрастную группу часто сопровождаются нарушением процессов пищеварения, снижением привесов и общей резистентности организма. Зачастую главной причиной этих нежелательных явлений оказывается некомпетентность пищеварительных ферментов. В этом случае коррекция рациона ферментными препаратами может иметь хорошие результаты.
Как уже говорилось выше, экзогенные ферменты обладают способностью изменять физико-химические свойства содержимого кишечника. В частности, большое количество научных работ посвящено снижению вязкости химуса (Bedford et al., 1991; Bedford, 1996; Пирс, 2002).
При использовании ферментных препаратов, содержащих целлюлазы, ксиланазы, пектиназы усиливается расщепление белков и крахмала, что объясняется большей доступностью питательных веществ в связи с разрушением клеточных стенок (Околелова, 2001).
Изучено влияние ксиланазы на популяции кишечной микрофлоры (Apajalahti, Bedford, 1999). Авторы наблюдали заметные колебания численности различных групп микроорганизмов, населяющих кишечник, в зависимости от доли пшеницы в рационе и от добавления к нему фермента. При замене всей зерновой части рациона пшеницей, в содержимом слепой кишки повышалось общее число микроорганизмов, однако на этом фоне снижалось количество энтеробактерий. Введение в рацион ксиланазы в дозе 2500 U/кг вызывало снижение общего числа микроорганизмов в слепой кишке, при этом возрастало количество бифидобактерий, пропионовокислых и бактероидов. На численность лактобацилл добавление фермента не повлияло. Параллельно проводились замеры концентраций летучих жирных кислот в слепой кишке. У птиц, получавших ксиланазу, отмечаено повышенное содержание уксусной и пропионовой кислот, а также пониженное содержание масляной.
Хук с соавт., изучали влияние ксиланазы («Bio Feed Wheat», Novo Nordisk), отдельно или в сочетании с цинк-бацитрацином на состав микрофлоры подвздошной и слепой кишок цыплят-бройлеров (Hock et al. 1997). Добавление к рациону ксиланазы в количестве 300 мг/кг вызвало снижение численности всех определяемых групп микроорганизмов тонкого кишечника: E.coli, pp. Enterococcus, Lactobacillus, Clostridium. Изучение микробного состава содержимого слепой кишки показало, что применение ксиланазы индуцировало снижение численности бактерий pp. Enterococcus и Clostridium. При этом возросла численность Lactobacillus, Bacteroides и анаэробных кокков, количество E.coli не изменилось. При совместном использовании фермента и антибиотика изменения в численности микрофлоры были более выражены, а продуктивность птиц этой группы была выше остальных.
Абсолютно противоположные данные, относительно продуктивности, приводят Вранжес и Венк, изучавшие совместное влияние ферментного комплекса Роксазим F («Hoffmann-La Roche»), выделенного из Trichoderma viridae, и антибиотика флавофосфолипол, на продуктивность кур несушек (Vranjes & Wenk, 1996). Наилучшие показатели переваримости компонентов рациона и продуктивности отмечены у птиц, получавших фермент. В опытной группе, где применялась смесь Роксазима с антибиотиком, результаты были самыми низкими. Авторы объясняют это созданием неблагоприятных условий для кишечной микрофлоры. К сожалению, в своей работе они не приводят количественных данных по этому вопросу.
При использовании экзогенной фитазы, с одной стороны повышается усвояемость фосфора, за счёт расщепления фитатов (Sohail, Roland, 1999), одновременно с этим лучше усваиваются кальций, магний, цинк, повышается уровень азотистого питания, (Ravindran et al., 2001; Sebastian et al., 1996; Zanini, Sazzad, 1999; Околелова и др., 2001) объясняется это устранением хелатирующего действия фитиновой кислоты и её солей (Пирс, 2002).
В настоящее время ясно, что влияние ферментов на процессы пищеварения и микрофлору многогранно, понимание этого процесса постоянно претерпевает изменения и совершенствуется. Как уже упоминалось, введение в желудочно-кишечный тракт животных и птицы бактерий, обладающих известной ферментативной активностью, порой приносит не менее интересные результаты. На этом основано внимание к созданию микробных препаратов, способных оптимизировать процессы пищеварения и поддерживать гомеостаз кишечника. Таким препаратам посвящен следующий раздел работы.
В главе, посвященной механизмам действия пробиотиков, было указано на коррекцию ими процессов пищеварения. На сегодня существует ряд препаратов, для которых этот механизм является одним из основных. В состав их не входят штаммы «классических» пробиотических бактерий, поэтому хочется поговорить о них отдельно. Подобные микробиологические добавки совмещают в себе свойства, как кормовых ферментов, так и пробиотиков.
На основе бактерий из pp. Clostridium, Ruminococcus, Bacillus, способных разлагать целлюлозу, созданы препараты, повышающие переваримость последней животными с однокамерным желудком (Эрнст и др., 1991; Лаптев, 1994; Тараканов и др., 1999; Киселёва и др., 2000).
Наибольшую популярность, из числа бактерий, используемых в данном направлениии, приобрели эндоспорообразующие бактерии p. Bacillus, и это не случайно. В Японии с их помощью уже тысячу лет из соевых бобов получают пищевой продукт, называемый «натто» (Нага, Veda, 1982). На протяжении нескольких столетий различные виды Bacillus, используют для ферментации бобов какао (Сагг, 1983).
Имеется ряд работ, где показаны положительные результаты полученные от применения целлюлозолитических бацилл при заготовке грубых кормов (Саубенова, 1998, Смирнова, Саубенова, 2001). Ушакова с соавт. (2003) приводят сведения о штаммах Bacillus, выделенных из толстого кишечника позвоночных.
Методы изучения устойчивости микроорганизмов к термообработке в лабораторных и промышленных условиях
Параллельно на базе лаборатории электронной микроскопии ГНУ ВНИИСХМ были сделаны фотографии 1 и 5-суточной культуры штамма. Для этого каплю суспензии исследуемой культуры наносили на медные сетки, покрытые формваровой плёнкой-подложкой, и окрашивали фосфорновольфрамовой кислотой (ФВК) в концентрациях от 0,1 до 1% в течение различных промежутков времени. Затем изучали образцы в трансмиссионном электронном микроскопе Н-300 (Hitachi, Япония) при ускоряющем напряжении 70 кВ. Наиболее удачные результаты удалось получить при окрашивании культуры 0,1% раствором ФВК в течение 15 секунд. Рост штаммов изучали на таких питательных средах как мясопептонный бульон, мясопептонный агар, целлюлозный агар Омелянского №19. О способности микроорганизмов ферментировать глюкозу и сахара длинного диагностического ряда судили по изменению цвета питательных сред с индикатором, а также по образованию газа. Полученные данные использовали для проведения родовой идентификации отобранного штамма, при этом пользовались определителем бактерий Берги (под ред. Дж. Хоулта, 9-е изд., 1997). Вид определяли, руководствуясь частотной матрицей и методикой, предложенными Беркли с соавт. (Berkeley et al., 1984). Целлюлозолитическую активность штаммов, отобранных из коллекции ГНУ ВНИИСХМ, определяли по методу Хендерсона, Хорвата и Блока в модификации Чюрлиса (Чюрлис, 1958; Тараканов, 1977). Суть этого метода заключается в определении весовой убыли целлюлозы после инкубирования с тест-культурами на модифицированной питательной среде. В качестве источника целлюлозы использовали фильтровальную бумагу «Filtrak» №88. Перед началом эксперимента, нарезанные полосками, бумажные фильтры высушивали в бюксах до постоянного веса при 105С и взвешивали с точностью до 0,001 г. Далее их помещали в стерильные пробирки и заливали 15,0 мл питательной среды №7.
В подготовленные таким образом пробирки вносили по 10,0 мл суточной культуры тестируемого штамма, выращенного на МПБ с добавлением мела и целлюлозы. Пробирки закрывали резиновыми пробками с вставленными в них дефлегматорами, заполненными дистиллированной водой, и помещали в термостат при 38С. Каждый штамм высевали в девяти повторностях. Учёт убыли субстрата проводили через 24, 48, 72 часа инкубации, отбирая каждый раз по три пробирки. Для этого при помощи пинцета из пробирок извлекали фильтры, осторожно промывали их слабой струёй дистиллированной воды и высушивали до постоянного веса при 105С. Показателем целлюлозолитическоЙ активности тест-штаммов служила величина изменения веса целлюлозы, выражаемая в процентах от её исходного значения.
Для определения количества жизнеспособных микроорганизмов в твёрдых и жидких средах, пользовались стандартным методом высева десятикратных разведений исследуемого материала на плотные питательные среды (метод Коха) («Практикум по микробиологии», 1976).
Исследуемый материал в количестве 1,0 г помещали в стерильные пробирки, добавляли по 9,0 г стерильного 0,9% раствора хлорида натрия и подвергали их содержимое периодическому встряхиванию в течение 1 часа. Полученная суспензия соответствовала разведению 10"1, из неё готовились последующие разведения (10 2 - 10 8). Из каждого разведения стерильной пипеткой переносили по 1 мл суспензии в стерильные чашки Петри (по 3 чашки на каждый вариант), после чего их заливали питательной средой, состав которой зависел от конкретного опыта. Учёт выросших колоний вели при помощи аппарата для подсчёта колоний. Исследовали чашки с числом колоний около 100. Полученные результаты обрабатывали при помощи стандартных статистических методов, в результате чего находили наиболее вероятное значение количества микроорганизмов, содержащихся в 1,0 г исходного субстрата, при уровне достоверности Ро,95. (Лакин, 1980).
В лабораторных условиях влияние температурного воздействия на жизнеспособность микроорганизмов препарата целлобактерин изучали следующим образом: навески препарата помещали в стерильные пробирки, добавляли около 0,1 мл водопроводной воды и выдерживали на водяной бане в соответствии со схемой опыта (табл. №8). Затем определяли в них количество живых бактерий и сравнивали его с таковым до прогревания.
Изучение влияния температурного воздействия на жизнеспособность микроорганизмов препарата целлобактерин в лабораторных условиях
Прежде чем включать целлобактерин в корма, подвергающиеся экспандированию и гранулированию, необходимо было изучить влияние действующих при этом физических факторов на микробиологическую составляющую препарата в лабораторных условиях.
При экспандировании и гранулировании все компоненты кормовой смеси увлажняются и испытывают воздействие высокой температуры. В экспандере, например, влажность за счёт обработки насыщенным водяным паром, составляет 16-18%, а температура поднимается до 170С. Однако, чаще всего комбикорма экспандируются при 90 и 105С. При гранулировании условия более щадящие, кормовая смесь нагревается обычно до 70 - 75С (Афанасьев, 2002).
При такой обработке гибнет большая часть вегетативных клеток бактерий и грибов, споровые формы затрагиваются в зависимости от времени экспозиции и температуры.
Первоначально мы попытались смоделировать в лаборатории условия близкие к таковым при гранулировании корма, и проанализировали их воздействие на препарат пробиотик целлобактерин.
В качестве опытного образца использовали препарат выпущенный ООО «Биотроф». Его подвергли исследованиям на содержание жизнеспособных микроорганизмов ассоциации №1-33 до и после температурных воздействий. Навески целлобактерина помещали в стерильные пробирки, добавляли около 0,1 мл водопроводной воды и выдерживали на водяной бане в течение различных промежутков времени.
Полученные результаты суммированы в таблице №12. Из них можно заключить, что нагревание ассоциации 1-33 в течение 1 минуты до температуры 70С приводит к значительному снижению числа жизнеспособных молочнокислых бактерий (с 8,53 до 3,24 lg КОЕ/г), количество целлюлозолитических микроорганизмов при этом снижается в пределах одного порядка (с 8,67 до 7,32 lg КОЕ/г). Дальнейшее повышение температуры, а также увеличение экспозиции приводит к более заметным потерям жизнеспособных бактерий ассоциации. Так уже после воздействия 80С, в течение 1 минуты, из исследуемого образца не удавалось выделить молочнокислых, а при двухминутной экспозиции также и целлюлозолитических бактерий.
Проведённые ранее балансовые опыты на бройлерах, на базе опытного хозяйства ГНУ ВНИИТИП показали, что оптимальной концентрацией микроорганизмов ассоциации №1-33 в корме является 4 lgKOE/r. Исходя из этой величины, были регламентированы нормы ввода целлобактерина в состав комбикормов.
Результаты, полученные в настоящем лабораторном эксперименте, свидетельствуют о значительной гибели микроорганизмов препарата целлобактерин при нагревании. Можно заключить, что его использование в составе кормовых смесей, подвергающихся воздействию температуры около 80С, будет неэффективным. Для подтверждения этого факта необходимо провести опыты в условиях производства.
Руководствуясь данными предыдущего эксперимента, мы решили проверить сохранность микроорганизмов препарата, включив его в состав комбикорма, подвергающегося термической обработке в изученном диапазоне. Такие условия были обнаружены на АО «Невская Мельница», где побочные продукты мукомольного производства - ржаные отруби и различные зерновые отходы подвергаются гранулированию. Смесь обрабатывается насыщенным водяным паром, температура при этом достигает 70 - 75С, а время воздействия составляет не более 15 секунд.
В эксперименте использовали два варианта целлобактерина: обычный и препарат, микроорганизмы которого обладают устойчивостью к антибиотику рифампицин. Оба варианта целлобактерина смешивались с зерновой массой, полученная смесь гранулировалась, пробы отбирались в начале и в конце обработки. Микробиологические исследования образцов проводились по схеме, изложенной в методическом разделе. Варианты исследованных образцов представлены в таблице №9. Полученные результаты приведены в таблице №13.
