Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Протеазы, продуцируемые бактериями рода Bacillus 9
Глава 2 Диссоциация бактерий рода Bacillus 17
Глава 3 Генетические основы получения штаммов бактерий рода Bacillus - продуцентов ферментов 23
Собственные исследования 38
Глава 4 Материалы и методы исследований 38
4.1 Материалы исследований 38
4.2 Методы исследований 38
Глава 5 Получение штамма - суперпродуцента нейтральной протеазы из бактерии Bacillus subtilis 43
5.1 Селекция штамма бактерии рода Bacillus - продуцента протеазы 43
5.2 Изучение продукции протеазы диссоциативными R- и S-формами исходного штамма В. subtilis и его антибиотикоустойчивых мутантов 45
5.3 Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма В. subtilis Р-1 49
5.4 Изучение чувствительности штамма В. subtilis Р-1 к антибиотикам 54
5.5 Изучение безвредности штамма В. subtilis Р-1 58
5.6 Исследование генетических особенностей штамма В. subtilis Р-1 63
5.7 Генетическая паспортизация штамма В. subtilis Р-1 63
5.8 Изучение влияния ингибиторов на активность продуцируемого фермента 67
Глава 6 Разработка технологии получения нейтральной протеазы на основе штамма B.subtilis Р-1 72
6.1 Оптимизация питательной среды для культивирования штамма B.subtilis Р-1 72
6.2 Подбор параметров культивирования штамма B.subtilis Р-1 77
6.3 Разработка многоциклического (отъёмно-доливного) процесса культивирования штамма B.subtilis Р-1 83
Заключение 87
Выводы 100
Список литературы 101
- Диссоциация бактерий рода Bacillus
- Селекция штамма бактерии рода Bacillus - продуцента протеазы
- Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма В. subtilis Р-1
- Изучение влияния ингибиторов на активность продуцируемого фермента
Введение к работе
Существенным стимулом для разработки новых способов получения протеолитических ферментов является растущее использование их в народном хозяйстве. Важнейшей областью применения протеолитических ферментов является медицина. Нейтральная протеаза широко используется в лечении болезней желудочно-кишечного тракта [Резник СР., 1995], сердечно-сосудистой системы [Егоров Н.С, 1996], в хирургии для обработки гнойных ран, ожоговых и обмороженных поверхностей [Салаганик Р.И. и др., 1993; Глянцев СП., Саввина Т.В., 1996], а также для лечения некоторых опухолей [Гулько Л.Б. и др., 2000].
Применение в медицине щелочной протеазы ограничено из-за её специфической активности, т.е. она является поверхностноактивным веществом и обладает гемолитическими свойствами [Смирнов В.В., 1982]. Щелочные протеазы используют в качестве добавок к стиральным порошкам, в лёгкой и пищевой промышленности [Харвурд К., 1992; Mala В. et al, 1998]. Кроме того, щелочные протеазы способствуют колонизации грамотрицательных бактерий на поверхности слизистой и коже [Бондаренко В.М. и др., 2002].
В медицине до настоящего времени, в основном, используются протеолитические ферменты животного происхождения [Белоусова Е.А. и др., 2003]. Однако, природное сырьё может включать в себя инфекционные агенты, проонкогены, нуклеиновые кислоты, прионы. Протеолитические ферменты микробного происхождения лишены этих недостатков. Короткий цикл развития бактерий, длительное хранение фермента без потери его активности и отсутствие затруднений при очистке, всё это делает микроорганизмы перспективными продуцентами ферментов.
Растущее применение протеолитических ферментов микробного происхождения в народном хозяйстве и медицине выдвигает важную задачу поиска удобных и экономичных продуцентов протеаз. Помимо уровня продукции у штаммов продуцентов немаловажное значение придаётся
5 исследованиям, направленным на изучение токсигенности и токсичности этих штаммов с целью исключения вредного воздействия метаболитов, продуцируемых наряду с протеолитическими ферментами [Хотимченко С.А., 2003].
Одним из важнейших объектов современной биотехнологии, как продуцентов ферментов, благодаря их многим положительным факторам, в том числе ферментативной активности, а также производственной технологичности и безопасности для человека являются бактерии Bacillus subtilis. В научной литературе имеются сообщения о природных штаммах рода Bacillus - продуцентах протеолитических ферментов, но они или недостаточно активны для производственного применения, или требуют длительного периода культивирования [Шарапов А.П. и др., 1985]. Имеются также штаммы бацилл, которые могут давать протеазу с большой активностью, но она не стабильна, так как для их культивирования требуется питательная среда, состоящая из нестандартных компонентов.
Для получения штаммов, обладающих высокой продукцией нужного метаболита, используются различные пути, в том числе методы генной инженерии, но они длительны и требуют специальных сложных приёмов. Кроме того, для генетически модифицированных штаммов необходима комплексная оценка их безопасности для внедрения в окружающую среду.
Одним из доступных способов получения суперпродуцентов ряда ферментов, таких как протеаза, щелочная фосфотаза является получение антибиотикоустойчивых мутантов природных штаммов методом направленной селекции, у которых в результате приобретения плейотропной мутации устойчивости к антибиотикам, часто увеличивается синтез экзоферментов [Дебабов В.Г., Лившиц В.А., 1988; Шарипова М.Р. и др., 1994; Буланцев А.Л. и др., 1995, 1998; Нехотяева Н.В., 1995; Кругликов В.Д. и др., 1996; Ito S. et al., 1991; Gileadi О. et al., 1992].
Цель исследования
Получение производственного штамма на основе бактерий рода Bacillus - суперпродуцента нейтральной протеазы методом селекции антибиотикоустойчивого мутанта и разработка способа его культивирования.
Задачи исследования
1 Получить штамм бактерий рода Bcillus - суперпродуцент
нейтральной протеазы методом направленной селекции
антибиотикоустойчивого мутанта.
2 Изучить биологические и культуральные свойства
селекционированного штамма.
Изучить генетические особенности селекционированного штамма в сравнении с исходным штаммом.
Разработать научные основы технологии культивирования штамма с целью получения промышленных объёмов протеазы.
5 Изучить влияние высоких концентраций протеазы на штамм -
продуцент в процессе культивирования.
Научная новизна
Получен и запатентован новый штамм В. subtilis Р-1-суперпродуцент нейтральной протеазы, являющийся S-формой стрептомицинустойчивого мутанта коллекционного природного штамма В. subtilis 534.
Впервые разработаны научные основы многоциклического процесса культивирования штамма В. subtilis Р-1 с целью получения ферментсодержащей культуральной жидкости, включающие оптимизацию состава питательной среды, технологических параметров процесса культивирования, построение фазового портрета оптимизированного периодического процесса культивирования и прогнозирование на его основе многоциклического процесса и его осуществление, изучение влияния высоких концентраций протеазы на штамм - продуцент.
7 Впервые выявлено адаптивное изменение морфологии и физиологии клеток штамма продуцента В. subtilis под влиянием высоких концентраций протеазы в процессе культивирования.
Начно-практическая значимость работы
Получен производственный штамм В. subtilis Р-1 - суперпродуцент нейтральной протеазы.
Разработана схема получения суперпродуцентов протеазы из природных штаммов бактерий рода Bacillus.
Показана возможность геномной паспортизации штаммов -прдуцентов бактерий рода Bacillus.
Разработаны способы культивирования штамма В. subtilis Р-1 для получения промышленных объёмов нейтральной протеазы - периодический и многоциклический.
Внедрение результатов исследования в практику
По материалам диссертации получено два патента Российской Федерации.
Нейтральная протеаза, получаемая при культивировании штамма В. subtilis Р-1, может быть использована для ферментолиза мозговой ткани в производстве препарата «Церебролизат» наряду с применяемым в настоящее время.
Основные положения, выносимые на защиту
1 Новый штамм В. subtilis Р-1 - суперпродуцент нейтральной
протеазы.
2 Разработанная схема получения штаммов - суперпродуцентов
протеазы, которая включает: получение антибиотикоустойчивого мутанта
на основе природного штамма В. subtilis в R-форме, проведение
гомогенного глубинного культивирования и выделение из популяции S-
формы с наибольшей зоной гидролиза казеина.
3 Штамм В. subtilis Р-1, отличающийся от исходного штамма
В. subtilis 534 внутрихромосомной перестройкой генетического материала.
4 Технология культивирования штамма В. subtilis Р-1 периодическим
или многоциклическим способом на стадартизованных по составу
питательных средах, являющаяся оптимальной для промышленного
получения нейтральной протеазы.
Апробация работы
Основные результаты работы были представлены на общероссийской научной конференции «Актуальные вопросы диагностики, терапии и профилактики инфекционных заболеваний» (Москва 1997), Всероссийской научной конференции « Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» (Уфа, 2000), Международной научно-практической конференции памяти Галины Ивановны Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва, 2002), Всероссийской научной конференции молодых учёных «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004). Диссертационная работа доложена и обсуждена на заседании Учёного совета Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ (протокол № 1 от 3. 02. 2005 г.)
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 8 работ, получено 2 патента РФ.
Объём и структура диссертации Диссертация изложена на 118 страницах, содержит 18 таблиц и 12 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы (3 главы), собственных исследований (3 главы), заключения, выводов. Библиографический список включает 153 источников (124 отечественных и 29 зарубежных).
Диссоциация бактерий рода Bacillus
Диссоциация - это расщепление однородной популяции бактерий на варианты, различающиеся генетическими, физиолого-биохимическими и морфологическими свойствами, в том числе и по способности к синтезу практически ценных метаболитов. Основные диссоцианты, различающиеся по морфологии колоний, следующие, R (rough) имеют шероховатый тип колоний, S (smooth) - гладкий тип колоний, М (mucoid) - слизистый, а также промежуточные варианты - I (intermedius). Морфофизиологические типы спонтанно переходят один в другой в силу геномных перестроек с частотой 10"2 - 1(Г4 на одно клеточное деление [Иванов П.Л. и др., 1990; Николаев Ю.А., Милько Е.С., 2000].
Из анализа многих работ сформулированы основные положения изменчивости бактерий: а) гетероморфизм - нормальное проявление приспособительных свойств развивающихся бактериальных популяций; б) гетероморфизм реализуется в образовании разнообразных морфологических вариантов, изменении механизма деления и т.д.; в) в процессе роста бактерий «старение» культуры сопровождается возникновением в ней гетероморфных особей; г) гетероморфизм усиливается под влиянием разнообразных факторов.
К настоящему времени накоплен обширный материал, освещающий проблему микробного полиморфизма на примере самых разных групп бактерий, в том числе и у бактерий рода Bacillus. Гетероморфизм нарастает по мере старения культур и усугубляется действием неблагоприятных факторов. Различными методами электронной микроскопии подтверждается точка зрения, согласно которой культурам патогенных и сапрофитных бактерий свойственно ассоциативное развитие, обеспечиваемое морфологически различными межклеточными связями. У грамположительных бактерий В. subtilis основным отличием S- и R форм первоначально считалось наличие слизистой капсулы. Позднее был обнаружен и картирован морфоген, определяющий морфологию колоний. Спонтанные мутации в этом гене происходят с относительно высокой частотой. Описано спонтанное вытеснение S-формы R-формами в процессе пересевов штамма сенной палочки [Прозоров А.А., 1966]. В классических микробиологических работах нитевидный рост бактерий (филаментообразование) рассматривали как один из признаков R-фазы микробной диссоциации, которая отличалась от S-фазы шероховатой морфологией колоний, неоднородностью суспензии клеток, повышенной проницаемостью клеточной стенки, иной реакцией на заражение бактериофагами, большей электрофоретической подвижностью клеток и другими свойствами. Указывалось на возможность вызвать R-S-переход неблагоприятными внешними воздействиями (излучения, температура, фенол и т.д.).
Большое число исследований посвящено выявлению и описанию морфологической дифференциации у бацилл. Bond (1975), выращивая бациллы на агаре с мясным экстрактом, на соевом и глюкозном агаре, наблюдал образование колоний следующих типов: плоские, распростертые, блестящие; плоские, тусклые, слегка морщинистые; округлые, поднимающиеся над агаром, маслянистые; морщинистые с приподнятой складчатостью; ризоидальные. В. licheniformis (продуцент бацитрацина) при моноспоровом рассеве на МПА образует три типа колоний, отличающихся по биосинтетической активности: 1-й тип - морщинистые, тусклые, с неровным краем; 2-й тип - плоские, тусклые, с блестящим более светлым центром, с неровным краем; 3-й тип - слабо выпуклые, тусклые, с волнистым краем. По данным литературы, у В. subtilis насчитывается от 5 до 10 типов колоний на различных агаризованных средах. Форма и консистенция колоний чаще всего определяются при выращивании бацилл на мясо 19 пептонном агаре [Стронгин А.Я. и др., 1977; Смирнов В.В. 1985; Выборных С.Н. и др, 1990,1991; Блохина Т.П. и др., 1992]
В основе диссоциации бацилл на R- и S-формы лежит строение клеточной стенки. При хемостатировании культуры В. thuringiensis s.g. 69-6 диссоциирует на R- и S-варианты. Преимуществом клеток S-варианта оказалась их резистентность к имеющемуся в хемостате бактериофагу. Электронно-микроскопические данные указывают, что причина фагоустойчивости заключена в структурной организации клеточной стенки бактерии S-варианта, пептидогликановый компонент которой истончен и отличается повышенной разрыхленностью. Методом отрицательного контрастирования обнаружено, что если для клеток R-варианта характерной является тетрагональная упаковка белковых субъединиц поверхностного Т-слоя клеточной стенки, свидетельствующая о правильной ориентации в нем фагорецепторов, то в Т-слое стенки клеток S-варианта происходит перераспределение белковых макромолекул, что препятствует адсорбции бактериофага на поверхности бактерий. Адсорбция фагов на поверхности бактерий R-варианта наблюдается довольно часто, это влечет за собой разрушение пептидогликана, протопластообразование и лизис [Блохина Т.П. и др., 1992].
Селекция штамма бактерии рода Bacillus - продуцента протеазы
Один из путей создания производственных штаммов продуцентов ферментов на основе бактерий, является получение антибиотикоустойчивых мутантов с повышенным синтезом экзоферментов в (к/ж). В литературе широко обсуждается вопрос об увеличении продукции ферментов, в том числе и протеазы, у антибиотикоустойчивых бактериальных штаммов [Ito S. et al, 1991; Шарипова М.Р. и др., 1994; Кругликов В.Д. и др., 1996; Буланцев А.Л. и др., 1998].
Стрептомицин является одним из часто используемых антибиотиков для получения штаммов микроорганизмов-сверхпродуцентов ферментов [Балабан Н.П. и др., 2003]. При воздействии стрептомицина у микроорганизмов изменяются 30S субъединицы рибосомы, в результате этого происходит нарушение координации процессов транскрипции и трансляции белка на рибосомах или увеличение проницаемости внешней мембраны для некоторых метаболитов [Знаменская Л.В., 1986; Дебабов В.Г., 1988]. Целью наших исследований явилось получение путём селекции стрептомицинустойчивого штамма В. subtilis -суперпродуцента нейтральной протеазы.
Получение штаммов бактерий рода Bacillus, устойчивых к стрептомицину, требует длительного времени и селективный отбор необходимо проводить многоступенчато, начиная с очень низких его концентраций из-за высокого бактериостатического действия на бациллы.
На первой ступени селекции для достижения поставленной цели суспензию культуры В. subtilis 534, находящейся в R-форме на плотной питательной среде, смывали физиологическим раствором до концентрации (2-3)-109 кл/мл и пересевали последовательно в МПБ и МПА (скошенный) с концентрацией стрептомицина 10 мкг/мл. Продолжительность выращивания на МПБ и на МПА составляла до (72±2) часа. Потребовалось провести 10 таких пассажей чтобы получить антибиотикоустойчивые популяции дающие рост на среде с 10 мкг/мл стрептомицина при 37 С за 24 ч.
На последующих ступенях селекции ступенчато увеличивалась концентрация антибиотика на 10 мкг/мл и доводилась до 2000 мкг/мл. Со второй ступени селекции количество пассажей, с МПБ на МПА с одной концентрацией антибиотика проводилось двукратно. В результате ступенчатой селекции с возрастающей концентрацией стрептомицина, начиная с 10 мкг/мл, с чередованием жидкой и твёрдой питательной среды и шагом антибиотика 10 мкг/мл был получен стрептомицинустойчивый мутантный штамм В. subtilis str+. Для оценки уровня продукции протеазы популяции исходного В. subtilis 534 и полученного В. subtilis str+ штаммов высевали на 1% казеиновый агар моноспоровым рассевом и измеряли в миллиметрах диаметр зоны просветления среды вокруг колоний через (18±1) часов выращивания при (37±1) С. Для исследования брались чашки, на которых вырастало не более 10 колоний.
В результате выявлено, что эти штаммы имеют разный уровень продукции протеазы, т.е. образуют отличающиеся по диаметру зоны гидролиза казеина: штамм B.subtilis 534 - (6,0±0,5) мм, штамм В.subtilis str+ - (13,0±2,0) мм.
Признак стрептомицинустойчивости был стабильным при пассажах культуры клеток штамма B.subtilis str+ на твёрдой питательной среде и не утрачивался популяцией в течение 10 пассажей при поверхностном культивировании на питательных средах, без добавления стрептомицина с сохранением свойства повышенной продукции протеазы.
При выращивании бактериальной популяции клеток стрептомицинустойчивого мутанта в бутылях, на жидкой питательной среде без стрептомицина, в течение 3 суток с принудительной аэрацией, происходила диссоциация популяции на R- и S-формы. R-форма стабильно сохраняла признак стрептомицинустойчивости, в то время как S-форма утрачивала свойство стрептомицинустойчивости, но приобретала устойчивость к антибиотикам р-лактамного ряда.
Из литературных источников известно, что уровень продукции протеазы бацилл в S-форме бывает выше чем в R-форме [Бурцева 3. И. и др., 1991; Нефёдова Л. И. и др., 1996].
При изучении способности продуцировать протеазу R-, S-формами штамма B.subtilis str+ выше описанным методом было выявлено, что R- и S-формы имели разный уровень продукции протеазы, причём S-формы имели зоны гидролиза казеина больше чем R-формы (рисунок 1).
Для установления закономерности выявленного свойства повышенной продукции протеазы S-формой, по сравнению с R-формой, проведено сравнительное изучение уровня продукции протеазы диссоциативными R-, S-формами исходного штамма В. subtilis 534 и его антибиотикоустойчивых мутантов, В. subtilis rif1", В. subtilis str+ и В. subtilis реп+ (таблица 1).
Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма В. subtilis Р-1
Из рисунка 3 следует, что в результате воздействия антибиотика на исходный природный штамм бактерий рода Bacillus в R-форме получают антибиотикоустойчивый мутант в R-форме, из которого выделяют в результате проведения гомогенного глубинного культивирования S-форму -суперпродуцент протеазы. В данном конкретном случае исходным являлся штамм В. subtilis 534, а в качестве антибиотика использовали стрептомицин, в результате получен суперпродуцент протеазы штамм В. subtilis Р-1.
Выявленная способность штамма В. subtilis Р-1 к повышенной продукции протеазы явилась основанием для его размножения и изучения физиолого-биохимических и генетических особенностей.
Изучение морфологических свойств исследуемых штаммов показало, что исходный штамм - В. subtilis 534 и полученный - В. subtilis Р-1 имеют некоторые различия: штамм В. subtilis 534 имеет размеры (0,3-0,7) 1,8 мкм. Размеры штамма В. subtilis Р-1 - (0,5-0,7) 1,3 мкм. Установлено, что штамм В. subtilis Р-1 аспорогенен (в популяции могут иногда встречаться лишь единичные споры), тогда как штамм В. subtilis 534 является на 100% спорообразующей палочкой. Остальные морфологические свойства сравниваемых штаммов аналогичны друг другу и характерны для первой группы рода Bacillus подгруппы Б: клетки не раздуваются при спорообразовании, споры элипсовидные, расположены центрально, не образуют глобул в цитоплазме клеток при выращивании на глюкозном агаре. Оба штамма аэробы, грамположительные, обладают подвижностью, оптимальный рост при температуре 37 С и рН 6,0-7,5. Сравнительный анализ морфологии колоний штамма В. subtilis str+- (R-форма) и В. subtilis Р-1 - (S-форма) на 1 % казеиновом агаре показал, что штамм В. subtilis Р-1 представлен белыми крупными, круглыми колониями с ровными краями (рисунок 1). На (МПА) колонии штамма В. subtilis Р- 1 плоские, слегка блестящие, белого цвета с ровными краями (рисунок 4). Колонии исходного штамма в R-форме на мясопептонном агаре (МПА) шероховатые с фестончатыми краями бело-серого цвета (рисунок 5). При культивировании штамма В. subtilis Р-1 на мясопептонном бульоне (МПБ) при температуре 37 С через 18 - 24 ч наблюдается равномерное помутнение бульона. Полученный штамм - суперпродуцент нейтральной протеазы отличается от исходного не только морфолого-культуральными признаками, но и некоторыми биохимическими свойствами, отражёнными в таблице 2. Как следует из представленных данных, штамм В. subtilis Р-1 отличается от исходного штамма В. subtilis 534 и В. subtilis str+ наличием фибринолизина, повышенной способностью к редукции нитратов, гидролизу мочевины, уровнем гиалуронидазы. Изучение чувствительности к антибиотикам у штамма В. subtilis Р-1 показало, что она отличается как от исходного штамма В. subtilis 534, так и от R-формы штамма В. subtilis str+ , из которого получен штамм В. subtilis Р-1. При изучении антибиотикочувствительности штамма В. subtilis Р-1, было проведено сравнение с антибиотикочувствительностью мутантных вариантов штамма В. subtilis 534, устойчивых помимо стрептомицина, также к действию рифампицина, и пенициллина.
Мутации устойчивости к антибиотикам, как правило, имеют плейотропный характер, поэтому для изучения перекрестной устойчивости у полученных мутантов была изучена чувствительность к широкому ряду антибиотиков (таблица 3). Из приведенных в таблице данных следует, что мутанты, обладающие устойчивостью к пенициллину, становились устойчивыми только к полусинтетическим пенициллинам: оксациллину и ампициллину. Мутанты, устойчивые к рифампицину, приобретали устойчивость к пенициллину, карбенициллину и ампициллину. Мутанты, устойчивые к стрептомицину, становились устойчивыми к канамицину (аналогу стрептомицина), к рифампицину, а также к пенициллину и его аналогам: карбенициллину, ампициллину и оксациллину. Варианты, устойчивые к пенициллину, не обладали устойчивостью к стрептомицину и рифампицину.
Изучение влияния ингибиторов на активность продуцируемого фермента
Для выявления их содержания в культуральной жидкости штамма В. subtilis Р-1 мы воспользовались свойством ингибиторов по разному влиять на эти протеазы. Инактивацию металлосодержащих нейтральных протеаз осуществляли обработкой двунатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), а щелочные сериновые протеазы ингибировали диизопропилфторфосфатом (ДФФ).
Нами проведено изучение воздействия разных концентраций ЭДТА и ДФФ на протеолитическую активность культуральной жидкости, получаемой при культивировании штамма В. subtilis Р-1. С этой целью в культуральную жидкость с исходной протеолитической активностью 24 ПЕ/мл добавляли ингибиторы в концентрациях от 10 М до 10" М. Варианты реакционной смеси выдерживали при температуре (22±2) С в течение 30 минут, после чего определяли остаточную протеолитическую активность. Контролем служила исходная культуральная жидкость без ингибитора.
Протеолитическую активность выражали в (%) по отношению к контролю. Каждый вариант опыта ставился в 5 повторностях. Полученные данные представлены в таблице 9. Из полученных результатов следует, что добавление ингибитора нейтральных протеаз - ЭДТА в концентрации 1x10"5 М подавляет протеолитическую активность к/ж на 70 %. Увеличение концентрации ингибитора до 1x10 3 М приводит к потере 90 % активности, а при дальнейшем увеличении концентрации ЭДТА, протеолитическая активность культуральной жидкости почти полностью исчезает. Остаточная протеолитическая активность составляет около 1%. ДФФ - ингибитор сериновых протеаз, практически не оказывает влияния на протеолитическую активность культуральной жидкости. Полученные данные позволили установить, что штамм В. subtilis Р-1 продуцирует на 99 % металлосодержащую нейтральную протеазу и около 1% сериновой щелочной протеазы - аналога субтилизина. Субтилизин является антибиотическим веществом и обладает гемолитической активностью, в то же время нейтральная протеаза не обладает выраженной биологической активностью. Поскольку у исходного штамма В. subtilis 534 активность щелочной протеазы составляла до 50 % общей протеолитической активности (по казеину) [Холодная Ж.В., 1999], мы сделали вывод, что под влиянием мутации устойчивости к стрептомицину у штамма В. subtilis Р-1 увеличилась продукция преимущественно нейтральной протеазы. Определение значений рН, в пределах которых протеаза проявляет свою активность, подтвердило преимущественное содержание нейтральной протеазы и минорное содержание щелочной протеазы (таблица 10). Из таблицы 10 следует, что протеолитическая активность культуральной жидкости наблюдалась в интервале значений рН от 5,0 до 9,2, наиболее была выражена при рН от 7,0 до 7,4, с максимумом при рН=7,4, что свидетельствует о наличии одной протеазы с действием в нейтральной области рН - нейтральной протеазы. Полученные данные показывают, что штамм В. subtilis Р-1 является продуцентом нейтральной протеазы. Необходимым условием хранения и успешной работы со штаммами -продуцентами является правильное поддержание культуры с целью сохранения её свойств. Поддержание культуры регулярными пересевами имеет ряд существенных недостатков. Основной из них - возможная утрата некоторых морфологических и физиологических признаков. Кроме того, частые пересевы повышают опасность инфицирования штамма посторонней культурой и вероятность возникновения спонтанных мутантов. При регулярных периодических пересевах штамма В. subtilis Р-1 на плотные питательные среды свойство повышенного синтеза протеазы сохраняется не более 2-х недель (5-7 пассажей), так как происходит постепенный переход S-формы в R-форму. Хранение на жидких средах невозможно из-за старения культуры. Хранение лиофильно-высушенных бактериальных клеток широко распространённый метод длительного сохранения микроорганизмов. Лиофильно-высушенные клетки сохраняют в ампулах, запаянных под вакуумом. Применение этого метода позволяет в течение 10 - 20 и более лет сохранить без заметных изменений жизнеспособность, морфологические, культуральные, физиологические свойства, а также способность продуцировать экзопродукты [Рубан Е.Л., 1989]. Популяцию штамма В. subtilis Р-1 размножили путем посева на матрасы с МПА, смыли сахарозо-желатиновой средой, разлили в ампулы и лиофильно высушили. Изучили стабильность высушенного штамма В. subtilis Р-1 в процессе хранения. Результаты исследования представленые в таблице 11 показали, что штамм является стабильным в течение 3 лет при температуре хранения (6±2) С (количество R-форм не превышает 7 %). При других температурах хранения происходила постепенная реверсия S-формы в R-форму и снижение продукции протеазы. Наблюдения за изменением параметров штамма при хранении продолжаются.
