Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Культурально-морфологические, биологические и иммунологические свойства возбудителя некробактериоза 10
1.2. Значение питательных сред при выращивании возбудителя некробактериоза 18
1.3. Современные подходы к культивированию микроорганизмов 26
Собственные исследования 38
2. Материалы и методы исследований 38
3. Результаты исследований 48
3.1. Разработка технологии получения питательной среды на основе ферментативного гидролизата маточно-плацентарно -эмбриональ ной массы (ФГМПЭМ) крупного рогатого скота для культивирования F. necrophorum 48
3.2. Сравнительная оценка эффективности питательной среды на основе ФГМПЭМ для получения биомассы F. necrophorum при различных условиях культивирования 51
3.3. Разработка оптимальных условий для глубинно-суспензионного способа культивирования возбудителя некробактериоза 54
3.4. Влияние глюкозы нарост и выход бактериальной массы F.necrophorum при глубинно-суспензионном способе культивирования 57
3.5. Изучение культурально-морфологических и биологических свойств взятых в опыт штаммов F. necrophorum, при культивировании их разными способами и на различных питательных средах 60
3.5.1. Изучение свойств F. necrophorum, выращенных в бульоне Хоттингера 60
3.5.2. Изучение биологических свойств F. necrophorum, культивированных в питательной среде на основе ФГМПЭМ глубинно-суспензионным способом 64
3.6. Испытание иммунологической эффективности полиштаммовой формол-эмульсионной вакцины против некробактериоза, изготовленной из биомассы и экзотоксина, полученных в среде на основе ФГМПЭМ
при глубинно- суспензионном способе культивирования 68
Обсуждение результатов исследований 74
Выводы 86
Практические предложения 88
Список литературы 89
Приложение 110
- Культурально-морфологические, биологические и иммунологические свойства возбудителя некробактериоза
- Значение питательных сред при выращивании возбудителя некробактериоза
- Разработка технологии получения питательной среды на основе ферментативного гидролизата маточно-плацентарно -эмбриональ ной массы (ФГМПЭМ) крупного рогатого скота для культивирования F. necrophorum
- Изучение культурально-морфологических и биологических свойств взятых в опыт штаммов F. necrophorum, при культивировании их разными способами и на различных питательных средах
Введение к работе
Актуальность темы. Некробактериоз крупного рогатого скота широко распространенное инфекционное заболевание, наносящее значительный экономический ущерб скотоводству. В связи с этим, предотвращение возникновения и распространения некробактериоза среди сельскохозяйственных животных является актуальной проблемой ветеринарной науки и практики (Д.Н. Бондаренко, 1980; И.А. Калашник и др., 1983; Ю.Г., Анакина 1988; СИ., Братюха, 1988; Т.Е Какоулин, 1997; Х.Н. Макаев, Д.А. Хузин и др., 2001).
Заболеваемость крупного рогатого скота некробактериозом отмечается в последние годы по РФ в среднем от 12 до 25 % от общего восприимчивого поголовья скота. В отдельных хозяйствах этот показатель достигает до 40 %. Заболевание носит хронический характер, спорадически обостряясь при ослаблении общей резистентности организма животных (А.А Самойлов, 1991; И.Г. Тириков, 1996; Д.А. Хузин, 2001).
К F.necrophorum наиболее восприимчивы высокопродуктивные животные, первотелки и бычки во второй половине откорма. В неблагополучных по некробактериозу хозяйствах сохранность приплода не превышает 62-75 %, так как телята рождаются с первичным иммунодефицитом, вследствие внутриутробной интоксикации продуктами жизнедеятельности возбудителя некробактериоза (В.А. Балабанов, 1971; А.А. Самоловов и др., 1997, 1998; Х.Н. Макаев и др., 2001).
В последние годы широкое применение в борьбе с некробактериозом в животноводстве нашли варианты вакцин, для изготовления которых необходимо получение значительного количества бактериальной массы (Г.Х. Камалов, 1991; А.А. Самоловов, А.А. Сидорчук, С.Д. Панасюк, 1994; Д.А. Хузин, 1996,1997; Х.Н. Макаев и др. 2004). С целью получения биоматериала при производстве вакцинных препаратов широко используют питательные
среды, приготовленные на основе отвара мышечной ткани, однако, мясо-сырье является ценным и дефицитным пищевым продуктом. В связи с этим, снижение себестоимости вакцинных препаратов возможно при использовании в качестве источников для приготовления питательных сред более доступных и дешевых компонентов.
Из значительног о количества различных наименований бактериальных
биопрепаратов, производимых отечественной биологической
промышленностью, лишь небольшая часть их изготавливается получением биомассы глубинно-суспензионным способом (И.В. Звягин, 1978; Виестур, 1980; В.И. Заерко, 1996; В.В. Меньшенин, 1997).
Вопросы, связанные с глубинным культивированием различных микроорганизмов, рассматривались многими исследователями. Несмотря на это к настоящему времени технология крупномасштабного глубинно-суспензионного выращивания F. necrophorum с использованием дешевой питательной среды из непищевого сырья недостаточно изучена. Не определен компонентный состав питательной среды, недостаточно данных о влиянии качества посевного инокулята и углеводного субстрата на рост и размножение F. necrophorum в условиях глубинно-суспензионного культивирования.
Решение этих вопросов остается актуальной проблемой биологической науки и практики.
Цель и задачи исследований. Целью наших исследований явился поиск дешевой питательной среды и разработка оптимальных условий крупномасштабного культивирования F. necrophorum для получения биомассы и экзотоксина при производстве вакцины против некробактериоза.
В связи с этим перед нами были поставлены следующие задачи:
1. Изготовить питательную среду на основе ферментативного гидролизата непищевого сырья - маточно-плацентарно-эмбриональной массы
7 крупного рогатого скота (ФГМПЭМ) - для культивирования F. necrophorum и
сравнительно изучить ее эффективность.
Разработать технологию глубинно-суспензионного способа культивирования F. necrophorum изучив при этом влияние качества, количества посевного материала и углеводного субстрата на выход бакмассы и экзотоксина.
Изучить возможное влияние среды на основе ФГМПЭМ на кулыурально-морфологические и биологические свойства F. necrophorum при выращивании глубинно-суспензионным способом.
Изготовить и испытать вакцину против некробактериоза с использованием биомассы и экзотоксина F. necrophorum, полученных глубинно-суспензионным способом культивирования данного микроба в среде на основе ФГМПЭМ.
Научная новизна. Впервые разработана методика изготовления питательной среды на основе ферментативного гидролизата непищевого сырья - маточно-плацен гарно-эмбриональной массы крупного рогатого скота для выращивания F. necrophorum.
Отработан глубинно-суспензионный способ культивирования F. necrophorum в реакторных условиях и изучена при этом роль качества, количества посевного материала и углеводов (глюкозы) на рост и развитие данных бактерий.
Установлено, что глубинно-суспензионный способ культивирования F. necrophorum в реакторных условиях в среде на основе ФГМПЭМ не изменяет свойства данных бактерий, а вакцина, изготовленная из биомассы и экзотоксина, полученных в этих условиях, не уступает по иммуногенности вакцине, изготовленной из биомассы и экзотоксина, полученных в бульоне Хоттингера.
Практическая значимость работы заключается в том, что разработанная нами питательная среда на основе ФГМПЭМ и отработанный
8 режим крупномасштабного культивирования возбудителя некробактериоза в
условиях биореактора значительно удешевляют получение биомассы
экзотоксина F. necrophorum при производстве высокоиммуногенной вакцины
против некробактериоза животных.
Разработанные «Методические рекомендации по изготовлению питательной среды для культивирования возбудителя некробактериоза» (2005) одобрены Научно-методическим советом ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» и внедрены в технологию производства полиштаммовой формол-эмульсионной вакцины против некробактериоза животных.
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены: на ежегодных заседаниях ученого совета ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (1999-2005); Республиканских научно-производственных конференциях (Казань): Международной научной конференции, посвященной 125-летию Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана (Казань, 1998); Юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ «Биотехнология. Ветеринария» (Киров, 1998); Всероссийской конференции молодых ученых «Молодые ученые - агропромышленному комплексу» (Казань); Международной научно-практической конференции «Ветеринарная биотехнология - настоящее и будущее (Щелково, 2004); Международного симпозиума посвященного 45 летию ФГУ «ФЦТРБ» (Казань, 2005).
Основные положения, выносимые на защиту:
-эффективность питательной среды, приготовленной на основе ферментативного гидролизата маточно-плацентарно-эмбриональной массы (ФГМПЭМ) для культивирования F. necrophorum;
-оптимизация условий глубинного культивирования возбудителя некробактериоза с использованием питательной среды на основе ФГМПЭМ;
9 -кулыурально-морфологические и биологические свойства возбудителя
некробактериоза при выращивании глубинно-суспензионным способом в
среде на основе ФГМПЭМ;
-иммунологическая эффективность вакцины против некробактериоза рогатого скота, изготовленной из биомассы и экзотоксина, полученных при культивировании F. necrophorum в питательной среде на основе ФГМПЭМ глубинно-суспензионным способом.
Публикация. По материалам диссертации опубликованы 11 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на ПО стр. Состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Иллюстрирована 15 таблицами. Список использованной литературы включает 183 источников, в том числе 39 иностранных.
Культурально-морфологические, биологические и иммунологические свойства возбудителя некробактериоза
Некробактериоз - инфекционное заболевание всех видов сельскохозяйственных животных, характеризующееся гнойно-некротическими поражениями кожи, подлежащих тканей, слизистых оболочек и внутренних органов (Я.Р. Коваленко, 1954; В.Д. Сосов, Р. Ведерников, 1969; В.А. Балабанов, 1971; А.А. Волкова, 1973; А.А, Самоловов, 1993; А.А. Сидорчук, С.Д. Панасюк, 1994; Х.Н. Макаев (1997, 2001, 2002) и другие.
Этиология заболевания в нашей стране долгое время оставалась не выясненной, хотя возбудитель некробактериоза, по сообщению Я.Р. Коваленко (1948), выделен и определен Р. Кохом еще в 1881 году, а по данным B.L. Langworth (1977), впервые описан Ф. Леффлером в 1884 году.
В силу того, что получение и поддержание анаэробных микроорганизмов на тот момент еще не было разработано, а обмен выделенных штаммов для сравнения между учеными был просто невозможен, многие исследователи проводили описание морфологии микроба, основанное лишь на микроскопии (М.М. Capcia et, al. (1945). В связи с этим, в ходе таксономического определения микроорганизму дали различные названия. Описание бактерий, относящихся к общепризнанному определению Fusobacterium necrophorum, имели следующие названия: Actinomices necrophorus, Bacillus fundibuliforms, Bacillus necrosus, Bacterium necrophorum, Fusiformis hemoliticus, Proactimices necrophorus, Spheroformis fundiliformis и др. (R.E. Buchonon, N.F. Cibbons, 1974).
Впервые возможность получения колоний культур на агаре и их описание появилось только в 1950 году, когда R.E. Hungate разработал метод обработки и культивирования анаэробных микроорганизмов путем помещения их в поток углекислого газа (J.N. Berg, 1982; СМ. Scanlon, 1982).
В 1929 году А.Г. Ревнивых экспериментально доказал роль F. necrophorum в этиологии гнойно-некротических поражений конечностей, выделил чистую культуру данного микроба от больных оленей и воспроизвел болезнь на здоровых животных (А.Г. Ревнивых, 1932, 1935).
Согласно современной классификации зоопатогенных микроорганизмов (М.А. Сидоров и др., 1995) возбудитель некробактериоза -F. necrophorum, относится к роду Fusobacterium (веретенообразные), входящему в состав семейства Bacteriodaceae (Методические рекомендации, 1997; А.А. Самоловов, 1999; О.И. Соломаха, 2000).
Возбудитель некробактериоза - Fusobacterium necrophorum представляет собой грамотрицательные полиморфные палочки (0,5-10 мкм длиной), нити (до 300 мкм длиной) и кокковидные формы. Спор и капсул не образует, является облигатным анаэробом, неподвижен. Он довольно хорошо окрашивается по Муромцеву, Романовскому-Гимза, Леффлеру и Граму (Д.А. Хузин и др., 1997; А.А. Самоловов, 1999; О.И. Соломаха, 2000).
Морфология возбудителя зависит от типа используемой среды и возраста культуры. Нитевидные формы наиболее часто наблюдаются в молодых культурах, а палочковидные и кокковидные - в старых. Вдоль нитей или на одном конце моїут быть утолщения (Б.В. Маслухина, 1972; А.А. Пилипенко и др., 1972; Г.Х. Камалов и др., 1991; С. Turowsky, 1959).
L-формы F. necrophorum впервые выделил и описал в 1947 году Klieneberger-Nobel. Имеется сообщение об этом также в работах К.А. МсКеу, М.М. Careia (1973). В нашей стране обнаружение и описание L-формы возбудителя некробактериоза принадлежит А.А. Самоловову с соавт. (1993). При пересеве на агаровые среды с пенициллином нередко отмечали образование коккоподобных форм, сходных со сферобластами L-форм бруцелл. Все попытки исследователей получить данную форму в чистом виде оказались безуспешными. При последующих пересевах она реверсировала в исходную палочковидную форму.
Данные по биохимическим свойствам возбудителя некробактериоза достаточно противоречивы. По сведениям Л.М. Борисовой (1976), сахаролитические свойства культур F. necrophorum не постоянны и часто слабые, хотя некоторые штаммы активно ферментируют глюкозу, фруктозу, лактозу, маннозу, сахарозу, левулезу и галактозу.
В опытах J. Tagoe (1975), из 53 штаммов ферментировали глюкозу 100 %, левулезу - 94,6 %, мальтозу 94,6 %, маннозу - 88,7 % и галактозу -86,9 % с образованием индола. Только один штамм не образовывал индол, все были негативны по отношению к декстрину , инулину, дульциту, глицерину и эскулину, образовывали сероводород, 9,3 % вызывали гемолиз.
В противоположность этому, по данным Т. Shinjo et.al. (1981), исследовавших 18 штаммов возбудителя некробактериоза, установлено, что все они расщепляли углеводы, но были индолопозитивными и гемолизировали эритроциты лошади. Последние свойства оставались стабильными даже после 100-кратного пассирования.
На различные биохимические свойства возбудителя некробактериоза указывали также другие исследователи. Если по сообщению Б.В. Маслухиной (1972), изученные штаммы не образовывали сероводород, не свертывали и не пептонизировали молоко, обладали различными сахаролитическими свойствами, то в опытах Д.Н. Бондаренко и А.И. Цыро (1980), отмечено образование сероводорода и индола, все культуры разлагали глюкозу, лактозу, левулезу, мальтозу, рамнозу и сахарозу.
Значение питательных сред при выращивании возбудителя некробактериоза
В полужидких средах с содержанием 0,25-0,75 % агар-агара рост анаэробов достигается благодаря коллоидному состоянию среды и наличию в ней углеводных соединений. При культивировании микроорганизмов на таких средах особых условий для защиты посевов от атмосферного воздуха не требуется.
Твердые среды, такие как, сахарный агар, желатин, свернутая сыворотка, сывороточный агар наливаются до 2/3 объема пробирки и при застывании среды в нижней части пробирки создаются анаэробные условия или же анаэробиоз получают посредством анаэростатов.
Для культивирования возбудителя некробактериоза необходимы соответствующие питательные среды и условия роста: t - 37-38С, анаэробиозные условия с рН среды 7,2-7,6. Наиболее часто при работе с Fusobacterium necrophorum применяются следующие жидкие питательные среды: мясо-пептонно-печеночный бульон, среда Китт-Тароцци, бульон Мартена, поскольку в них содержится достаточное количество питательных веществ для анаэробов (белки, углеводы). Данные среды удобны для всех таких манипуляций, как посевы, пересевы, приготовление мазков, заражение опытных животных и не требуют особых приспособлений для удаления воздуха. Редукция кислорода происходит, главным образом, за счет глютатиона, содержащегося в кусочках печени животного организма и в экстракте из мышц. При изготовлении питательных сред целесообразно использовать печень крупного рогатого скота, так как она не так ломка, не крошится, а также придает прозрачный цвет бульону. В процессе роста F. necrophorum через сутки происходит снижение рН среды с 7,6 до 7,4, а у некоторых штаммов до 7,1. До 9-Ю дня идет постепенное снижение рН в кислую область, после чего реакция культуральной суспензии всех штаммов становится нейтральной и на этом уровне держится в течение 2-3 суток. При дальнейшем культивировании реакция среды смещается в слабо-кислую сторону и на этом стабилизируется. При культивировании F. necrophorum на печеночном бульоне активный рост микроорганизмов наблюдается через 18 24часа. Свежевыделенная культура возбудителя некробактериоза из организма животного, а также полученная из патологического материала, дает рост в питательных средах через 2-4 суток, а иногда значительно позже. Кинетика роста культуры в жидких питательных средах (типа Китт-Тароцци) включает следующие повременные фазы роста микроорганизмов: лаг-фаза 4-5 часов, экспоненциальная фаза - 10-13 часов, фаза замедленного роста - 7 11 часов (Методические рекомендации, 1987).
Для выделения отдельных колоний микроба и получения чистой культуры возбудителя некробактериоза в основном используют такие плотные питательные среды, как печеночный агар, сывороточный агар, кровяной агар Цейсслера, глюкозо-кровяной агар и другие (А.А. Самоловов, 1985; В.В. Меныпенин и др., 1997; М.М. Carcia, К.А. McKay, 1973; Р.С. Simon, 1974). При высеве на плотные питательные среды рост отмечается через 48-72 часа появлением мелких точек-росинок диаметром менее 1 мм. Через 4-5 суток колонии становятся хорошо различимы невооруженным глазом и имеют серовато-белый или зеленоватый цвет, ровные или слегка зазубренные края, в центре колонии образуются небольшие углубления. На глюкозном агаре с эритроцитами кролика некоторые штаммы образуют зону а- или (3-гемолиза. В столбике с сывороточным или глюкозным агаром на 4-5-е сутки образуются мелкие, около 1 мм в диаметре, чечевицеобразные, мелкозернистые с радиальными отростками, серовато-белые колонии.
При получении высокоактивных препаратов в условиях промышленного производства важное значение имеет подбор питательных сред, которые обеспечивали бы значительное накопление бактериальной массы для приготовления вакцины, а также тщательно отработанный технологический режим их приготовления, с учетом изученных метаболических процессов культивирования. В связи с этим, научные исследования были направлены на модификацию существующих питательных сред и методов лабораторной диагностики.
Для выращивания культур возбудителя некробактериоза предложен сравнительно небольшой набор сложных питательных сред: среда Розенау с цистеином, WL-среда, бульон Вейнберга, мозговая среда Гиблера, среда 105 К, среда Вернера (А.А. Пилипенко, 1972).
Для улучшения роста микробов А.А. Волкова и Р.С. Галиев (1962), А.А. Волкова с соавт (1965), предложили вносить в МППБ фурацилин и производить пересев с бульонной культуры в глубину ГСА.
Н.И. Писаренко с соавт. (1973), Л.М. Борисова (1976) изучали влияние различных источников углеводов и мясных переваров на рост и развитие возбудителя некробактериоза.
По сообщениям многих авторов F. necrophorum лучше росли в жидких и на плотных питательных средах при добавлении к ним 10 % сыворотки крови крупного рогатого скота или лошадей (Р.А Кадымов., Э.М. Агаева 1984;Д.А.Хузин2002идр.).
За рубежом постоянно происходил поиск сред, способов выделения и культивирования возбудителя некробактериоза. Н.Е. Calkins, L.H. Schivner (1967) предложили проводить высев из абсцессов печени в жидкую тиогликолевую среду методом серийных 10-кратных разведений. W.H. Fales, G.W. Teresa (1982) разработали селективную агаровую среду на основе желтка куриного яйца, используя для ингибирования роста посторонней микрофлоры кристаллвиолет и спирт.
М.М. Garcia, К.А. McKay (1973) сообщали об отсутствии подходящих сред для культивирования F. necrophorum. Авторы провели модификацию среды Джонса и Клифтона и разработали методику выращивания возбудителя в больших объемах.
Разработка технологии получения питательной среды на основе ферментативного гидролизата маточно-плацентарно -эмбриональ ной массы (ФГМПЭМ) крупного рогатого скота для культивирования F. necrophorum
На первом этапе исследований по выполнению этой работы изготовили ферментативный гидролизат из маточно-плацентарно-эмбриональной массы (ФГМПЭМ) крупного рогатого скота. При этом осуществляли ферментативный гидролиз панкреатином (или используя фарш поджелудочной железы) измельченной маточно-плацентарно-эмбриональной массы, согласно «Методической рекомендации по изготовлению гидролизата мышечной ткани», утвержденной ГУВ МСХ СССР (1980). С целью улучшения качества получаемого гидролизата нами в процессе работы были введены некоторые изменения в технологию гидролиза маточно-плацентарно-эмбриональной массы.
Наша модификация заключается в том, что мы изменили соотношение фарша маточно-плацентарно-эмбриональной массы и фарша поджелудочной железы (1:3) и удлинили сроки гидролиза до 8 суток и отстаивания после окончания процесса гидролиза до 30 суток.
Введенные изменения в процессе изготовления гидролизата способствовали увеличению содержание общего и аминного азота в гидролизате и облегчению первичной фильтрации гидролизата перед приготовлением питательной среды на его основе.
Всего за время выполнения диссертационной работы по модифицированной технологии было изготовлено 10 серий основного гидролизата в объеме 2500 л.
Результаты исследований, приведенные в таблице, свидетельствуют что, использованный режим гидролиза обеспечивает получение ФГМПЭМ с приблизительно сходными свойствами и указывает на возможность его стандартизации по этим показателям. При этом, содержание общего азота в основном гидролизате варьировало от 700 до 750 мг%, аминного азота - 450-500 мг%, триптофана-150-175 мг, количество пептидов составляло 1,1-1,5%, рН - 7,0-7,8. Все приготовленные серии ФГМПЭМ имели темно-коричневый цвет и специфический запах, индол во всех сериях отсутствовал.
За время исследований изготовлено нами 10 серий питательной среды на основе ФГМПЭМ в количестве 7500 литров, согласно разработанных нами «Методических рекомендаций по изготовлению питательной среды для культивирования возбудителя некробактериоза» (2005). Во всех сериях количество аминного азота составило 120-130 мг%, рН среды от 7,3 до 7,42.
Все приготовленные среды были стерильными. Ни в одном случае при посеве проб питательной среды на диагностические и элективные среды: МГТА, МПБ, Китта-Тароцци, Сабуро, пророста не регистрировали.
При контроле ростовых качеств питательной среды, изготовленной по разработанной технологии, концентрация м.к. F. necrophorum через 18 часов культивирования составляла от 9,46±0,28 до 15,1±0,18 млрд. м.к./мл, при начальной концентрации в пределах 0,53 - 0,66±0,15 млрд. м.к./мл.
По этим показателям питательная среда на основе ФГМПЭМ имеет сходство с основным показателем питательной среды из мышечной ткани по Хоттингеру, которая широко используется в микробиологии.
К питательным средам предъявляется целый ряд требований: прежде всего они должны обеспечить высокий выход целевого продукта в максимально короткий срок культивирования. Сырье для питательных сред должно быть по возможности стандартным, дешевым, а источники его постоянными.
Обобщенные данные трехкратно повторенных опытов по оценке эффективности использованных опытных сред при стационарном культивировании в 2-х литровых колбах через 18 часов культивирования приведены в таблице 3 .
Из таблицы 3 видно, что после 18 часов инкубации самую высокую концентрацию микробных клеток 5,69±0,14 и 5,70±0,15 млрд.м.к/мл регистрировали в питательной среде на основе ФГМПЭМ и бульоне Хоттингера, что в 9 раз выше, чем на средах ГЛА, 1,5 раза чем в ТПС и 1,2 раза, чем в ГМЯК, при концентрации белка в культуральной жидкости на уровне 5,50 и 5,51 мг/мл, соответственно.
Полученные результаты свидетельствуют, что питательные среды на основе ФГМПЭМ и Б.Х. превышают по всем основным параметрам питательные среды ГЛА, ТПС, ГМЯК и дают нам основание активно использовать эти среды для выращивания возбудителя некробактериоза в условиях биореактора.
Исходя из результатов стационарного культивирования F.necrophorum в колбах, мы провели изучение динамики роста культуры некробактерий и накопления бактериальной массы и экзотоксина в питательных средах на основе ФГМПЭМ и Б.Х. при отъемно-доливном методе культивирования в 36 литровом биореакторе в анаэробных условиях при первоначальном объеме 15-16 литров питательной среды. После коррегирования рН среды до 7,2-7,4, вносили адаптированный посевной материал культуры некробактерий из расчета 0,5-0,7 млрд. м.к. на мл среды. Перемешивание культуральной суспензии осуществляли при 200-300 об/мин и поддерживали постоянную температуру в пределах 37-38 С. В процессе культивирования данных бактерий через каждые 3 часа осуществляли отбор проб для определения концентрации микробных клеток, белка и контроля рН, а чистоту роста культуры - микроскопией окрашенных мазков. Результаты опытов обобщены и представлены в таблице 4.
Изучение культурально-морфологических и биологических свойств взятых в опыт штаммов F. necrophorum, при культивировании их разными способами и на различных питательных средах
Испытуемые штаммы F. necrophorum при выращивании в бульоне Хоттингера, вырастают в виде помутнения столбика среды с последующим оседанием светло-бежевого осадка микробных клеток на дно пробирки, который при встряхивании легко разбивается с образованием равномерной мути. Максимальное накопление бактериальной массы регистрировали через 22-24 часа. У всех культур отмечалось газообразование, интенсивность которого варьировала в зависимости от штамма. На плотных питательных средах рост культуры проходил в течение 36-96 часов в виде мелких (менее 1 мм), россинчатых, гладких, плоских, хорошо очерченных колоний желто-серого цвета с углублением в центре. Рост на кровяном агаре характеризовался зоной А- и В-гемолиза.
В мазках штаммы представляли собой грамотрицательные полиморфные микроорганизмы, располагающиеся хаотично в виде палочек разной длины, переплетения нитей. У некоторых нитей наблюдались чечевицеобразные утолщения и зернистость. Спор и капсул не образовывали.
Анализ полученных результатов показал, что все штаммы расщепляли: глюкозу, лактозу, галактозу, маннит и сахарозу. Раффинозу и дульцит расщепляли 8, 12 и КОН, арабинозу ферментировал только штамм 8, мальтозу не расщепляли штаммы 8 и 12, и ни один из штаммов не ферментировал глицерин.
При изучении биохимических свойств установили, что все исследуемые штаммы возбудителя некробактериоза продуцировали индол и сероводород.
Таким образом, на основании результатов изучения морфологических и биохимических свойств установлено, что исследуемые штаммы относятся к характерным представителям рода F. necrophorum.
Антигенные свойства тест-культур F.necrophorum изучали с помощью серологического типирования - в перекрестных реакциях иммунофлюоресценции (РНИФ) и иммуноферментного анализа (ИФА) с гипериммунными кроличьими сыворотками, полученными на каждый штамм. Результаты изучения антигенных свойств, обобщены в таблице 9.
Из данных таблицы 9 видно, что при исследовании сывороток в РНИФ наиболее широкой активностью обладал антиген из штамма 8, а при исследовании сывороток в ИФА наиболее широкой активностью обладал антиген из штамма КОН.
При сравнительном анализе результатов исследований сывороток в ИФА и РНИФ установлено, что результаты ИФА коррелировали с таковыми РНИФ, однако по чувствительности ИФА превосходил РНИФ в 5-Ю раз.
С целью изучения степени вирулентности тест-культур возбудителя некробактериоза проводили заражение белых мышей различными дозами бактериальной взвеси. Для чего оттитрованную по белку (мг/мл) суточную культуру вводили белым мышам подкожно и внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл/гол. Результаты определения вирулентных свойств исследуемых штаммов представлены в таблице 10.
Результаты определения вирулентных свойств штаммов возбудителя некробактериоза представленные в таблице 10 свидетельствуют о том, что при подкожном введении бактериальной суспензии минимальная ЛДюо по белку у штамма 8 составила 1,5±0,1; у штамма 12 -1,7±0,2; у штамма ВУП -1,5±0,1 и у штамма КОН -1,6±0,1 мг/мл. После подкожной инъекции бактериальной суспензии гибель животных отмечали на 7-Ю день заражения с признаками анорексии, атаксии задних конечностей и изъязвления места инъекции.
К внутрибрюшинному способу введения белые мыши оказались наиболее чувствительными. При этом способе заражения минимальная ЛД)0о по белку у штамма 8 составляла - 0,9±0,1;у штамма 12 -0,6±0,1; у штамма ВУП - 0,8±0,2; а у штамма КОН - 0,9±0,1 мг/мл. Гибель зараженных белых мышей наступала на 2-3 сутки и выражалась общим угнетением, мышечной дрожью, параличами.
Сравнительный анализ результатов заражения подопытных животных показал, что при внутрибрюшинном введении вирулентность штаммов была выше в 1,7-2,8 раза, чем при подкожном введении.
С целью изучения возможного влияния среды на основе ФГМПЭМ и глубинно-суспензионного способа культивирования F. necrophorum на их культурально-морфологические и биологические свойства использованных в опытах штаммов провели сравнительное изучение этих показателей с аналогичными показателями после культивировании этих штаммов в бульоне Хоттингера.
Наблюдениями установлено, что начальная стадия роста бактерий в среде на основе ФГМПЭМ происходила в нижних слоях, а затем перерастала в верхние слои питательной среды. У всех культур отмечалось газообразование, интенсивность которого варьировала в зависимости от штамма. Максимальное накопление бактериальной массы регистрировали через 18 часов культивирования.
В мазках тест-культуры представляли собой грамотрицательные полиморфные микроорганизмы, располагающиеся хаотично в виде палочек разной длины. К концу культивирования (к 18 часам) в мазках появлялись нити с веретенообразными утолщениями и зернистостью. Спор и капсул не обнаруживали.
При изучении биохимических свойств установили, что все исследуемые штаммы возбудителя некробактериоза продуцировали индол и сероводород.
Похожие диссертации на Разработка оптимальных условий глубинно-суспензионного способа культивирования Fusobacterium necrophorum
