Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Источники и причины поступления НП в почву 12
1.2. Распределение НП по почвенному профилю 14
1.3. Изменение физических и химических свойств почв после загрязнения НП .16
1.4. Влияние нефти и НП на биологическую активность почвы 20
1.4.1. Изменение состояния почвенного микробоценоза 20
1.4.2. Изменение состояния альгоценоза почв .23
1.4.3. Изменение состояния педобионтов – почвенных беспозвоночных .24
1.4.4. Изменение ферментативной активности загрязненной почвы .25
1.5. Реакция растений на загрязнение почвы НП .29
1.6. Трансформация НП в почве 32
1.6.1. Механизмы трансформации углеводородов .34
1.6.2. Основные этапы трансформации УВ 35
1.6.3. Скорость очищения почвы от НП 36
1.7. Диагностика нефтезагрязненных почв .37
1.8. Нормирование загрязнения почвы НП .39
1.9. Методы рекультивации нефтезагрязненных почв 43
1.9.1. Механическая очистка 43
1.9.1.1. Сорбенты .43
1.9.1.2. Структураторы 44
1.9.2. Биоаугментация .44 1.9.
2.1.Микроорганизмы-нефтедеструкторы 45 1.9.
2.2. Биопрепараты нефтеокисляющего действия .45
1.9.3. Биостимуляция 46
1.9.3.1. Минеральные удобрения .46
1.9.3.2. Органические удобрения .49
1.9.4. Фиторемедиация 49
2. Объекты и методы исследования .51
2.1. Характеристика района проведения исследования .51
2.1.1. Местоположение .51
2.1.2. Климатические условия 51
2.1.3. Почва 53
2.2. Описание полевых модельных опытов 53
2.2.1. Полевой модельный опыт 2010 года .53
2.2.2. Полевой модельный опыт 2011 года .55
2.2.3. Полевой модельный опыт 2012 года .56
2.3. Методы химического анализа почвы .59
2.3.1. Определение массовой доли НП 59
2.3.2. Определение влажности почвы .59
2.3.3. Определение актуальной кислотности почвы 60
2.4. Методы биологического анализа почв .60
2.4.1. Определение численности микроорганизмов 60
2.4.2. Определение ферментативной активности почвы .61
2.4.2.1. Определение активности инвертазы 61
2.4.2.2. Определение активности дегидрогеназы .61
2.4.2.3. Определение активности каталазы .62
2.4.3. Определение эмиссии СО2 почвой полевым камеро-статическим методом .62
3. Динамика содержания нефтепродуктов в почве и изменение некоторых физико-химических свойств почв .64
3.1. Динамика содержания углеводородов в почве при загрязнении светлыми НП 64
3.2. Динамика содержания углеводородов в почве при загрязнении темными НП .65
3.3. Изменение актуальной кислотности при загрязнении почвы НП .66
3.4. Изменение влажности почвы при загрязнении НП 67
4. Биологическая активность загрязненных почв 69
4.1. Изменение численности основных трофических групп бактериальной микробиоты при
загрязнении почвы НП .69
4.1.1. Сапротрофные бактерии .69
4.1.2. Углеводородокисляющие бактерии 70
4.2. Изменение численности и видового состава почвенных микромицетов при загрязнении почвы НП 73
4.3. Ферментативная активность загрязненных почв 75
4.3.1. Активность инвертазы 75
4.3.2. Активность каталазы 76
4.3.3. Активность дегидрогеназы 76
4.4. Интенсивность эмиссии CO2 загрязненной почвой 77
4.5. Фитотоксичность загрязненной почвы 78
5. Практические аспекты биоремедиации почв при загрязнении нефтепродуктами .80
5.1. Использование минеральных и органических удобрений для стимуляции углеводородокисляющих микроорганизмов при загрязнении почвы НП 80
5.1.1. Динамика содержания углеводородов в почве при загрязнении ДТ после внесения удобрений .80
5.1.2. Динамика содержания углеводородов в почве при загрязнении темными НП после внесения удобрений .81
5.1.3. Изменение актуальной кислотности загрязненной почвы после внесения удобрений .83
5.1.4. Изменение влажности загрязненной почвы после использования удобрений .84
5.1.5. Изменение численности основных трофических групп бактериальной микробиоты после внесения удобрений в загрязненную ДТ почву 85
5.1.6. Изменение численности основных трофических групп бактериальной микробиоты после внесения удобрений в загрязненную темными НП почву .86
5.1.7. Изменение численности почвенных микромицетов после внесения удобрений в загрязненную ДТ почву 88
5.1.8. Изменение численности почвенных микромицетов после внесении удобрений в загрязненную темными НП почву .88
5.1.9. Ферментативная активность загрязненной почвы после использования удобрений .89
5.1.10. Интенсивность эмиссии CO2 загрязненной почвой после использования удобрений .91
5.1.11. Фитотоксичность загрязненной почвы после внесения удобрений .92
5.2. Использование биопрепаратов для восстановления загрязненных почв .95
5.2.1. Разработка бактериального препарата 95
5.2.2. Динамика содержания углеводородов в почве при загрязнении ДТ после внесения бактериальных препаратов .96
5.2.3. Динамика содержания углеводородов в почве при загрязнении темными НП после внесения бактериальных препаратов 98
5.2.4. Изменение актуальной кислотности загрязненной почвы после использования бактериальных препаратов .99
5.2.5. Изменение влажности загрязненной почвы после использования бактериальных препаратов 101
5.2.6. Изменение численности основных трофических групп бактериальной микробиоты при загрязнении ДТ после внесения бактериальных препаратов 102
5.2.7. Изменение численности основных трофических групп бактериальной микробиоты при загрязнении темными НП после использования бактериальных препаратов 104
5.2.8. Изменение численности почвенных микромицетов в загрязненной ДТ почве после применения бактериальных препаратов .106
5.2.9. Изменение численности почвенных микромицетов в загрязненной темными НП почве после применения бактериальных препаратов 107
5.2.10. Ферментативная активность загрязненной почвы после применения бактериального препарата 108
5.2.11. Интенсивность эмиссии CO2 загрязненной почвой после применения бактериальных препаратов .109
5.2.12. Фитотоксичность загрязненной почвы .110
5.3. Использование сорбента при рекультивации загрязненных почв .114
5.3.1. Динамика содержания углеводородов в почве при загрязнении НП и применении сорбента 116
5.3.2. Изменение актуальной кислотности загрязненной почвы при использовании сорбента 116
5.3.3. Изменение влажности загрязненной почвы при использовании сорбента .116
5.3.4. Изменение численности основных трофических групп бактериальной микробиоты при загрязнении ДТ и использовании сорбента 117
5.3.5. Изменение численности основных трофических групп бактериальной микробиоты при загрязнении темными НП и использовании сорбента .118
5.3.6. Изменение численности почвенных микромицетов в загрязненной почве при использовании сорбента .119
5.3.7. Интенсивность эмиссии CO2 загрязненной почвой при использовании сорбента 120
5.3.8. Фитотоксичность загрязненной почвы .121
5.4. Фиторемедиация загрязненных почв .123
5.4.1. Проведение этапа фиторемедиации при загрязнении почвы смесью мазута и ДТ 123
5.4.2. Проведение этапа фиторемедиации при загрязнении почвы мазутом и ДТ в различных концентрациях 127
Заключение 133
Выводы .136
Список литературы .137
- Реакция растений на загрязнение почвы НП
- Методы биологического анализа почв
- Изменение актуальной кислотности при загрязнении почвы НП
- Использование минеральных и органических удобрений для стимуляции углеводородокисляющих микроорганизмов при загрязнении почвы НП
Введение к работе
Актуальность темы. Нефть и нефтепродукты (НП) на сегодняшний день являются одним из приоритетных загрязнителей окружающей среды в России. Мурманская область в настоящее время не относится к регионам, осуществляющим добычу и переработку нефти, однако загрязнение окружающей среды данным типом поллютантов является актуальным и для нашего региона. В число потенциально опасных источников загрязнения почвы относятся нефтебазы, объекты топливно-энергетического комплекса, крупные промышленные предприятия, имеющие в своей структуре автотранспортные подразделения, автозаправочные станции др. Определенную роль в общий объем загрязнения вносят объекты Министерства обороны РФ. При этом нельзя исключать достаточно высокий износ оборудования, на котором осуществляются операции с НП (хранение, транспортировка, отгрузка, бункеровка) на данных объектах.
За последнее время увеличились объемы морской транспортировки нефти по Баренцеву и Белому морям. За 2010 г. береговыми и рейдовыми терминалами порта Мурманск было перевалено 17,6 млн. тонн нефтеналивных грузов. За тот же период из морского порта Витино (Белое море) было отправлено на экспорт 4,4 млн. тонн различных НП. При этом большая часть светлых НП и мазута транспортируется до прибрежных терминалов железнодорожным транспортом по территории Мурманской области. В перспективе также вовлечение в хозяйственный оборот крупного района нефтяной и газовой промышленности – шельфа Баренцева моря. Увеличение объемов транспортировки НП влечет за собой рост возможности возникновения аварийных ситуаций, в том числе связанных с загрязнением почвы. Почвы Кольского полуострова обладают низкой биогенностью, а, следовательно, и низким потенциалом самоочищения, что делает их довольно уязвимыми в случае возможного загрязнения (Евдокимова, 1995; Евдокимова, Мозгова, 2001).
Цель и задачи исследований. Цель – разработка способов повышения эффективности биоремедиации почв Кольского Севера при загрязнении НП.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Оценка возможности применения различных методов ремедиации загрязненных почв в природно-климатических условиях Кольского полуострова.
-
Изучение динамики содержания углеводородов в почве и изменения биологической активности почвы при загрязнении НП в условиях полевого модельного эксперимента.
-
Оценка влияния различных технологий биоремедиации на биологическую активность загрязненной почвы и остаточное содержание НП в почве в условиях полевого модельного эксперимента.
-
Разработка эффективной технологии биоремедиации, позволяющей с наименьшими затратами проводить очистку и восстановление почв, загрязненных НП, в условиях Кольской Субарктики.
Научная новизна. В результате проведенной работы впервые определены периоды самоочищения Al-Fe-гумусового агрозема от НП и разработана технология очищения и восстановления этих почв. Исследовано влияние дизельного топлива и мазута в различных концентрациях на биологическую активность окультуренного подзола в природно-климатических условиях Кольского полуострова. Определен уровень содержания НП в почве, при котором возможно ее самоочищение, и уровни загрязнения, требующие применения методов биоремедиации для восстановления почвы. Впервые в условиях Кольского полуострова для фиторемедиации почв, загрязненных НП, использовали многолетние злаки: двукисточник тростниковидный (Phalaroides arundinacea (L.) Rausch.), овсяница луговая (Festuca pratensis Huds.) и рожь многолетняя (Secale cereale L.).
Основные положения, выносимые на защиту
-
Период, за который происходит самоочищение почв Кольского Севера от нефтяных углеводородов до значений ниже ОДК длится от 3-х месяцев до 3-х и более лет в зависимости от исходного количества и индивидуальных свойств НП, при этом светлые НП разлагаются значительно быстрее темных НП, оказывая более острое токсичное воздействие на растения.
-
Внесение минеральных и органических удобрений, использование микробных препаратов-нефтедеструкторов ускоряют процесс ремедиации загрязненных почв в условиях Кольского Севера. Из них наиболее эффективен метод биостимуляции, основанный на использовании минеральных и органических удобрений для усиления активности аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов, позволяющий сократить срок очищения почвы в 1,5-2 раза.
-
Загрязнение почв НП в концентрациях до 5% стимулирует размножение УОБ и их активность, а также вызывает изменение видового состава сообществ почвенных микромицетов.
-
Al-Fe-гумусовые агроземы Кольского полуострова при загрязнении НП становятся источником дополнительной эмиссии в атмосферу диоксида углерода, образующегося в результате деструкции нефтяных углеводородов.
Практическая значимость работы. Разработанный способ позволит повысить эффективность очистки и восстановления почв, загрязненных НП, в условиях Евро-Арктического региона. Предлагаемый подход к восстановлению загрязненных почв может быть использован в качестве базовой технологии при внедрении на предприятиях, осуществляющих операции с НП.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на трех Международных конференциях: III и IV Международная научная конференция «Современные проблемы загрязнения почв» (Москва, 2010 г., 2013 г.); XII Международная научная конференция студентов и аспирантов «Проблемы арктического региона» (Мурманск, 2012 г.); шести Всероссийских конференциях: III и IV Всероссийская научная конференция с международным участием «Экологические проблемы северных регионов и пути их решения» (Апатиты, 2010 г., 2012 г.); IV Всероссийская научная конференция с международным участием «Экологические функции лесных почв в естественных и нарушенных ландшафтах» (Апатиты, 2011 г.); Юбилейная научно-практическая конференция «Генетические ресурсы, селекция и семеноводство сельскохозяйственных культур в условиях Европейского Севера» (Апатиты, 2013 г.); ХI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Актуальные проблемы региональной экологии и биодиагностика живых систем» (Киров, 2013 г.); XXI Всероссийская молодежная научная конференция «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2014 г.); одном форуме: Межрегиональный форум «Международное сотрудничество молодых ученых: северное измерение» (Архангельск, 2011 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 2 – в изданиях, рекомендованных ВАК, и 2 – в зарубежных рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на 167 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц, 93 рисунка. Список литературы включает в себя 241 наименование.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность и благодарность профессору Г.А. Евдокимовой, под чьим руководством выполнялась данная работа, сотрудникам лаборатории экологии микроорганизмов за всестороннюю поддержку и проведение микробиологических исследований, а также директору Полярной опытной станции ГНУ ВНИИР им. Н.И. Вавилова РАСХН Е.М. Ахтуловой и ее заместителю И.В. Михайловой за предоставление участка и помощь в проведении полевых исследований.
Исследование выполнено при финансовой поддержке международного гранта Kolarctic № КО 187.
Реакция растений на загрязнение почвы НП
НП оказывают влияние на растения как непосредственно в результате прямого воздействия, вызывая ожоги в месте контакта или токсические реакции, так и косвенно, изменяя почвенные условия в результате увеличения гидрофобности и анаэробности, что
приводит к образованию на поверхности семян и корней гидрофобной пленки, затрудняющей газообмен и поступление в них воды (Полонский, Полонская, 2013). Гибель растений может вызывать развитие микромицетов-токсинообразователей в ризосфере (Салангинас и др., 2003; Назаров, Иларионов, 2005). Помимо непосредственного токсического эффекта углеводороды нефти могут оказывать тератогенный и мутагенный эффекты на растения (Петухова, 2000, 2007; Аниськина и др., 2004).
За последнее время проведено множество исследований по этой проблеме как в природных условиях на территориях нефтяных разливов, так и в условиях лаборатории с использованием различных тест-растений. Показано как положительное, так и отрицательное, но разное по силе, влияние нефти и НП на растения, зависящее от концентрации и типа нефтепродуктов, продолжительности и условий воздействия, вида растений, почвенно-климатических условий и др.
Обнаружено, что невысокие концентрации нефти и НП в почве (по разным данным до 5%) не оказывают достоверного влияния или даже стимулируют рост растений, увеличивая такие показатели как всхожесть, биомассу, длину надземной и подземной части, ассимиляционную поверхность, содержание хлорофилла в листьях (Оборин и др., 1988; Медведева, 2003; Киреева, 2006; Леднев, 2008; Маслова, Табаленкова, 2010; Зейферт, Гамерова, 2012; Насибуллин и др., 2013; Полонский, Полонская, 2013). При увеличении содержания нефти в почве начинает оказываться ингибирующее влияние НП – снижение скорости прорастания семян и их количества, торможение роста растения и смещение фаз развития (Алехин и др., 1998; Киреева и др., 2001; Седых, Игнатьев, 2002; Андреева, 2005; Киреева, 2006; Евдокимова и др., 2007; Леднев, 2008; Васильконов, 2009; Казиахмедова, 2009).
При попадании нефти на поверхность растений происходит растворение углеводородов и эфиров с поверхности листьев и адгезия смолистых веществ, что приводит к закупорке устьиц и нарушению обмена веществ (Елин, 2002). При изучении физико-биохимических показателей двукисточника тростниковидного в условиях нефтяного загрязнения было установлено уменьшение содержания хлорофилла b и каротиноидов в листьях растения, снижение содержание общего азота и аминокислот в листьях и корнях, снижение активности пероксидазы в листьях, возможно, вследствие нарушения работы мембран хлоропластов и деструкции фотосинтетических пигментов. При этом в тканях корневищ активность пероксидазы увеличилась, что, при отсутствии накопления в тканях продукта окисления – малонового диальдегида, говорит об активной антирадикальной защите (Маслова, Табаленкова, 2010). Снижение содержания хлорофилла наблюдали в листьях и других растений (Заушинцена и др., 2013). Влияние нефти на растения приводит к накоплению в клетках флуоресцирующих кумаринов, которые в норме там не присутствуют, что свидетельствует о деструктивных процессах в клетках (Григориади, 2010).
На основании проведенных исследований были установлены пороговые значения концентрации НП в почве, при которых проявляется острая – 10,4% и хроническая – 3,5-6,8% фитотоксичность (Зейферт, Гамерова, 2012).
Различные растения в равных условиях по-разному реагируют на действие одних и тех же загрязнителей. В результате многочисленных исследований удалось установить наиболее устойчивые к нефтяному загрязнению виды растений, которые в последствии можно использовать на этапе фиторемедиации загрязненных почв. Среди таких растений встречаются как дикорастущие, так и окультуренные виды – кукуруза, подсолнечник, зеленые бобы, соя, рожь многолетняя, овсяница луговая, волоснец песчаный, двукисточник тростниковидный, кострец безостый, бодяк щетинистый (Dominguez-Rosado, 2004; Надыкта, Негри, 2006; Евдокимова и др., 2007; Евдокимова и др., 2009; Маслова, Табаленкова, 2010; Денисова и др., 2011; Маслобоев,
Евдокимова, 2011; Заушинцева и др., 2013).
Нефтяные углеводороды разной химической природы оказывают различное влияние на растения. Наибольший токсический эффект оказывают ароматические углеводороды, например кумол и псевдокумол. Даже кратковременный контакт семян пшеницы с данными веществами приводил к снижению всхожести в среднем в 2 раза по сравнению с контролем. Углеводороды алифатического ряда (н-гексан, н-декан и н-тридекан) ингибировали всхожесть семян в гораздо меньшей степени, однако с увеличение длины их углеродной цепи токсичность углеводородов алифатического ряда повышалась. С увеличение продолжительности обработки семян углеводородами возрастал и токсический эффект. Одной из причин различного токсического эффекта углеводородов авторы считают намного более высокую растворимость ароматических углеводородов в почвенной воде, в результате чего они оказывают более сильное воздействие на семена растений. (Кулагин и др., 2011). Наибольшее влияние на степень фитотоксичности оказывают легкие фракции нефти, содержащие преимущественно алканы, циклоалканы и ароматические соединения, которые подавляют рост и развитие растений (Водопьянов, 2008; Васильконов, 2009).
Не меньший интерес представляют и работы, направленные на изучение влияния загрязнения нефтью и нефтепродуктами на растительные сообщества в естественных условиях. Показано, что сохранение напочвенного покрова определяется глубиной проникновения нефти в почву, а так же глубиной размещения в почве органов вегетативного размножения растений. Авторы установили, что при уровне загрязнения 1,5 л/м2 нефть проникает в лесную подстилку на глубину не более 2 см, что вызывает гибель лишайников, всходов сосны и кедра. Внесение нефти в количестве 5 л/м2 приводит к полному замазучиванию лесной подстилки и вызывает гибель не только мхов и лишайников, но и кустарничков – брусники и черники. При дозах 10 и 20 л/м2 нефть проникает в почву на глубину до 20 см. Все представители напочвенного покрова испытывают сильное угнетение, сохраняются лишь отдельные особи. Дозы нефти от 50 до 100 л/м2 приводят к отмиранию тровяно-мохового покрова более чем на 98%. После воздействия таких доз восстановление на участках не наблюдается в течение как минимум 9 лет (Чижов и др., 1998).
В результате нефтяного загрязнения уменьшается число видов растений, общее проективное покрытие видов и продуктивность фитомассы напочвенного покрова (Лапина и др., 2007), происходит перестройка в видовой структуре живого напочвенного покрова, изменяется соотношение видов и групп растений (Казанцева, Размахнина, 2012).
На основе проведенных исследований были выделены наиболее устойчивые дикорастущие травянистые растения – вейники, осоки, канареечник тростниковидный, хвощ лесной, багульник болотный, брусника, кипрей болотный, иван-чай, рогоз широколистный, тростник обыкновенный, пушица, ситник лягушачий, частуха (Чижов и др., 1998; Кулакова, 2007; Казиахмедова, 2009). Наиболее устойчивым к нефтяному загрязнению видом мхов является сфагнум узколистный (Казиахмедова, 2009). Из древесных растений более устойчивы
лиственные породы, нежели хвойные, однако это справедливо только при средней степени загрязнения. По снижению устойчивости подроста древесные растения образуют следующий ряд: береза бородавчатая, кедр сибирский, сосна обыкновенная, ель сибирская, пихта сибирская, лиственница Сукачева и сибирская (Чижов и др., 1998).
В литературе встречаются сведения о возможном поступлении компонентов нефти в корневую систему растения в результате процесса фитоэкстракции (Метаболизм…, 2005; Григориади, 2010). Доказано, что с ростом концентрации НП в почве увеличивается содержание бенз[а]пирена в тканях растения, при этом определенные виды способны к гипераккумуляции ПАУ (Метаболизм…, 2005; Киреева, 2006; Яковлева, 2009; Григориади, 2010).
В процессе деструкции нефть и НП в почве подвергаются влиянию различных факторов, среди которых можно выделить физические (испарение, вымывание), химические (фотолиз, биохимическое разрушение) и биологические (микробное разрушение) (Басюл, 2007; Чижов и др., 2007; Сазыкин и др., 2010; Хабибуллина, Ибатуллина, 2011).
Испарение, вымывание и фотоокисление под действием ультрафиолета наиболее эффективны на поверхности почвы и в верхних генетических горизонтах, где воздействию данных факторов подвержены в основном легкие фракции (с температурами кипения до 250С). В толще почвы окисление НП преимущественно осуществляется за счет действия микроорганизмов и ферментов неорганизменной локализации (биохимическое разрушение) (Елин, 2002; Басюл, 2007).
Исследования, направленные на определение эффективности испарения различных НП из почвы, показали, что нефтешлам и дизельное топливо испаряются медленнее (в 10 раз и более), чем бензины различных марок. Максимальное испарение наблюдается в течение первых 4 суток, особенно в первые 30-90 мин после загрязнения. При этом степень самоочищения почв от НП, используемых в опыте, за счет испарения не превышала 2% (Кокорина, 2010). В другой работе было показано, что разложение нефти за счет испарения и фотохимических эффектов составляет 20-25%, теоретически рассчитанное значение – 20-22% (Водопьянов, 2008).
Растворимость НП зависит от их углеводородного состава. Так, при прочих равных условиях наибольшей растворимостью обладают углеводороды с меньшей молекулярной массой, т.е. с меньшим числом углеродных атомов. Углеводороды с одинаковым числом атомов углерода образуют следующий ряд по уменьшению растворимости: арены – нафтены – алканы (Одинцова, 2003).
Процесс микробиологического разложения углеводородов происходит внутри бактериальной клетки, что делает необходимым перенос этих веществ через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану. При контакте бактерий с пленкой углеводородов проникновение через клеточную стенку происходит за счет пассивной диффузии через всю ее поверхность. Основную роль при этом играют липиды и миколовые кислоты клеточной стенки. Проникая через клеточную стенку, углеводороды достигают цитоплазматической мембраны, где могут накапливаться в неизменном виде. Затем происходит активный перенос углеводородов через цитоплазматическую мембрану и последующее их окисление с участием ферментных систем (Рачинский и др., 1971; Коронелли, 1996).
Среди компонентов нефти и НП более доступны для микроорганизмов алканы и циклоалканы, которые практически полностью подвергаются биодеструкции (Холоденко и др., 2001; Елин, 2002; Айткельдиева, Файззулина, 2007; Галиулин и др., 2010). Наименее подвержены биодеструкции углеводороды со сложной молекулярной структурой: смолы, асфальтены, арены, полициклические арены и нафтеноарены, тяжелые ароматические фракции. Среди углеводородов одного класса наиболее подвержены микробиологической деструкции соединения с меньшим числом атомов углерода (Ибрагимова, 2009). Углеводороды с разветвленной цепью потребляются хуже, чем н-парафины (Лизунов, 2002). Скорость биодеградации углеводородов уменьшается в ряду: н-алканы, ароматические углеводороды (бензол, толуол, бензойная кислота и др.), разветвленные алканы, циклоалканы, изопреноиды, ПАУ (Серебренникова, 2014). Главным фактором деградации ПАУ в окружающей среде является фотолиз, инициированный ультрафиолетовым излучением, а в почве этот процесс может происходить только на ее поверхности (Пиковский, 1993).
Методы биологического анализа почв
Выявление и учет микроорганизмов в почве проводили методом поверхностного посева на плотную питательную среду. Для учета численности УОБ использовали синтетическую среду минерального состава (г/л): K2HPO4 – 1, NH4Cl – 2, MgSO4 – 0,5, NaCl – 0,5, CaCO3 – 1, ДТ – 10 мл, агар-агар – 18 г, FeSO4 – следы, дистиллированная вода – 1 л. Для учета численности сапротрофных бактерий применяли МПА следующего состава (г/л): пептон – 10, NaCl – 5, агар-агар – 18 г, мясная вода – 1 л. Учет численность микромицетов проводили на сусло-агаре с добавлением молочной кислоты из расчета 4 мл на 1 л среды для ингибирования роста бактерий. Приготовленные питательные среды разливали в колбы, закрывали ватными пробками и стерилизовали. Стерилизацию проводили насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе в течение 25 минут при температуре 121С и давлении 1 атм. (минеральная среда для УОБ и МПА) и 0,5 атм. (сусло-агар).
Расплавленную питательную среду разливали в стерильные чашки Петри. После полного ее застывания пластинки подсушивали в стерильном сушильном шкафу при температуре 50-60оС. На поверхность агара в чашке наносили 0,1 мл почвенной суспензии и равномерно распределяли по поверхности всей чашки стеклянным шпателем. Чашки помещали в термостат при температуре +27 на время, необходимое для роста культуры (Практикум по микробиологии, 2004).
Определение активности ферментов проводили по методам, описанным Ф.Х. Хазиевым (1976).
Метод основан на колориметрическом измерении окрашенных соединений, образующихся при реакции продуктов гидролиза сахарозы с фосфомолибденовым комплексом (метод Гоффманна и Паллауфа).
Навеску (1 г) почвы помещали в колбу емкостью 100 мл, добавляли 10 мл 20%-ной сахарозы и 10 мл ацетатного буфера, обрабатывали толуолом, тщательно перемешивали и инкубировали в течение 18 часов при 37С. Контроль – почва с водой вместо сахарозы. После инкубации раствор фильтровали. Для определения количества сахаров 1 мл фильтрата смешивали с 4 мл медного реактива в мерной колбе емкостью 50 мл и ставили на 20 мин в кипящую водяную баню. Затем колбу охлаждали водопроводной водой до комнатной температуры и последовательно добавляли 2 мл раствора двухзамещенного фосфорнокислого натрия и 5 мл 2,5%-ного раствора молибденовокислого аммония. После тщательного перемешивания до полного улетучивания углекислого газа реакционную смесь оставляли на 1 час для проявления окраски. Затем колбу заполняли дистиллированной водой до метки, перемешивали содержимое и через 15 мин на фотоколориметре КФК-2 измеряли интенсивность окраски при = 590 нм. По стандартной кривой, составленной из равных смесей глюкозы и фруктозы, находили количество инвертированных сахаров (в мкг).
Разница между содержанием инвертного сахара в опытах и контролях дает сахаразную активность почвы, которую выражают в микрограммах глюкозы на 1 г почвы за 18 часов.
Для количественного определения активности дегидрогеназной реакции применяли метод А.Ш. Галстяна, основанный на восстановлении бесцветной соли 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ) до окрашенных соединений трифенилформазана (ТФФ). По интенсивности окраски колориметрическим способом измеряли количество формазана. В почве определяют потенциальную дегидрогеназную активность с использованием субстрата дегидрирования – глюкозы или актуальную – глюкозы.
Навеску (1 г) воздушно-сухой почвы помещали в пробирку емкостью не менее 25 мл, добавляли 10 мг углекислого кальция и тщательно перемешивали. Затем прибавляли 1 мл 0,1 М раствора глюкозы и 1 мл 1%-ного раствора ТТХ. Определение проводили в анаэробных условиях, для чего подготовленные пробирки помещали в анаэростат, из которого медленно в течение 2-3 мин удаляли воздух, достигая разряжения 0,9-1 атм. (10-12 мм рт. ст.). Анаэростат ставили в термостат при 37С на 24 ч. После инкубации в колбы добавляли 23 мл этилового спирта и встряхивали 5 мин. Полученный окрашенный раствор ТФФ фильтровали и анализировали на фотоколориметре с синим светофильтром ( = 540 нм). Количество ТФФ в миллиграммах рассчитывали по стандартной кривой. Активность дегидрогеназы выражали в миллиграммах формазана на 10 г почвы за 24 часа.
Определение каталазной активности почв осуществляли методом, основанном на способности перекиси водорода реагировать в кислой среде с сульфатом титана с образованием пероксодисульфотитановой кислоты, имеющей желтую и желто-оранжевую окраску. Интенсивность окраски зависит от количества перекиси (метод Штефаника и Думитру).
Навеску почвы (5 г) помещали в колбу Эрленмейера емкостью 100 см3. Контрольные навески почвы для инактивации каталазы заливали по 5 мл 10%-ной серной кислотой и 10%-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Колбы, как с инактивированными, так и с неинактивированными почвами помещали в ледяную баню (0о). Через 15 мин. в каждую колбу добавляли по 10 мл 1%-ного раствора перекиси водорода, смесь тщательно перемешивали и оставляли при той же температуре на 1 час. Затем в опытные колбы для прекращения действия каталазы вносили по 5мл 10%-ной серной кислоты и 10%-ной ТХУ. Колбы взбалтывали и содержимое фильтровали. Для каждой пробы готовили пробирку, содержащую по 2 мл сульфата титана. В пробирку вносили 1 мл фильтрата и 9 мл дистиллированной воды – жидкость приобретала желто-оранжевую окраску. Плотность окраски измеряли на фотоколориметре с синим светофильтром ( = 400). Количество перекиси водорода находили по эталонной кривой. Разница концентрации Н2О2 (в мкг/мл) между инактивированными и активными вариантами определения показывает количество перекиси водорода, расщепленное под действием каталазы. Активность каталазы выражали в микрограммах на 1 г почвы за 1 час.
Методика основана на измерении количества СО2, выделившегося из почвы за определенный промежуток времени, и состоит в следующем. Почву изолировали с помощью пластикового сосуда, края которого заглубляли на 1,5-2 см. Внутри этого сосуда на пластмассовой подставке устанавливали фарфоровую чашечку с 5 мл поглощающей щелочи и выдерживали 2 ч. В качестве поглотителя СО2 использовали 0,1 н раствор КОН. Сосуд тщательно закрывали, промазывая крышку герметиком, и оставляли на 2 ч. Затем проводили титрование щелочи 0,1 н раствором HCl с индикатором – 1% спиртовой раствор фенолфталеина. Для определения количества СО2, содержащегося в воздухе сосуда-изолятора, его устанавливали в поддон, заполненный водой, для предотвращения газообмена с почвой, закрывали и выдерживали 2 ч (Рисунок 5).
Изменение актуальной кислотности при загрязнении почвы НП
Проведенные исследования показали, что внесение ДТ и мазута в различных концентрациях не оказало достоверного влияния на значение кислотности водной суспензии почвы.
Загрязнение почвы ОММ привело к достоверному снижению величины рН относительно незагрязненной почвы через 60 и 90 суток (t=4,71 и t=3,01 при =0,95 и df=4) (Рисунок 10).
. Значения рН водной суспензии почвы: 1 – без загрязнения; 2 – ОММ.
Таким образом, ДТ и мазут, а также смесь этих НП в исследуемых концентрациях не оказали влияния на величину рН водной суспензии почвы. Внесение ОММ в количестве 7,5 л/м2 привело к снижению рН на 0,15 ед. относительно чистой почвы, что обусловлено его химическим составом.
Загрязнение почвы ДТ в низкой и средней дозе достоверно не повлияло на влажность почвы. Внесение загрязнителя в количестве 10 л/м2 привело к тому, что в конце вегетационного периода влажность в слое почвы 0-10 см была выше, чем в чистой почве (t=5,29 при =0,95 и df=4) (Рисунок 11). Возможно, причиной переувлажнения поверхностного слоя почвы стал затрудненный дренаж воды в нижележащие гидрофобные слои почвы, которые спустя 3 месяца оказались более загрязненными в силу замедленных процессов окисления углеводородов в подповерхностных слоях.
Темные НП оказали иное влияние на влажность почвы. Мазут в количестве 1,3 и 2,6 л/м2 достоверно не повлиял на влажность почвы. Внесение более высоких доз мазута и ОММ привело к снижению влажности верхних слоев почвы (Рисунок 12). При этом в варианте с ОММ снижение наблюдали уже через 10 сут после загрязнения (t=7,36 при =0,95 и df=4), в то время как внесение мазута в высокой дозе привело к достоверному снижению влажности почвы только через 90 суток (t=5,67 при =0,95 и df=4).
В результате проведенного исследования показано, что низкие дозы НП не оказали влияния на влажность почвы. Загрязнение ДТ в количестве более 10 л/м2 привело к увеличению влажности верхних слоев почвы в конце вегетационного периода. Мазут, ОММ и смесь НП в количестве 7,5 л/м2 и более вызвали снижение влажности верхнего слоя почвы в течение первых месяцев после загрязнения.
Таким образом, максимальную скорость самоочищения почвы при загрязнении ДТ наблюдали в течение первого вегетационного периода при всех исследованных концентрациях загрязнителя. Содержание НП в слое почвы 0-10 см снизилось на 76-89% за счет испарения, фотохимического окисления, просачивания вглубь почвенного профиля и биологического разложения. При минимальной степени загрязнения большая часть углеводородов испарилась и деградировала в течение первых 10 сут. При увеличении степени загрязнения снижение содержания НП в верхнем слое почвы происходило равномерно на протяжении всего вегетационного периода. Самоочищение почвы до содержания НП ниже ОДК при внесении низких и средних доз ДТ произошло в течение трех летних месяцев, при этом загрязнению подвергся верхний слой почвы до глубины 10-15 см. Более высокая степень загрязнения привела к просачиванию углеводородов вглубь почвенного профиля и увеличению срока самоочищения. В конце вегетационного периода содержание НП в верхнем слое почвы после загрязнения высокой дозой ДТ превышало значение ОДК в 1,6 раза.
Для почв, загрязненных темными НП, характерна более низкая степень самоочищения за вегетационный период, не превышающая 62% от исходного уровня. Самоочищение почвы до содержания НП ниже ОДК при загрязнении мазутом в низкой дозе произошло в течение трех летних месяцев. В результате загрязнения мазутом, ОММ и смесью НП в более высокой дозе содержание НП в почве в конце вегетационного периода превышало ОДК в 7-12 раз.
Использование минеральных и органических удобрений для стимуляции углеводородокисляющих микроорганизмов при загрязнении почвы НП
Обеспеченность почв биогенными элементами – азотом, фосфором и калием – важный фактор, определяющий интенсивность разложения нефти и продуктов ее переработки. Недостаток биогенных элементов необходимо восполнять путем внесения в почву минеральных удобрений. Практически во всех случаях внесение биогенных элементов в виде минеральных удобрений стимулирует разложение углеводородов в почве. Считается, что наиболее интенсивно разложение углеводородов протекает при ежегодном внесении комплекса NPK-содержащих удобрений в сочетании с органическими удобрениями (Алехин и др., 1998; Природоохранные работы…, 2006; Евдокимова и др., 2007; Колбасов, 2010).
Использование минеральных и органических удобрений для стимуляции углеводородокисляющих микроорганизмов при загрязнении почвы НП
В полевых модельных опытах с загрязнением почвы ДТ и смесью мазута и ДТ в количестве 10 л/м2 доза внесения минеральных удобрений составила 130 г/м2 (N200P200K200), что соответствовало максимально рекомендуемым дозам внесения при проведении рекультивационных работ (Алехин и др., 1998; Технологии восстановления…, 2001; Леднев, 2008). В качестве органического удобрения вносили препарат «Радогор» (экстракт навоза крупного рогатого скота). Удобрения вносили через 1 сут после загрязнения, после чего верхний слой почвы перемешивали на глубину до 10 см.
В опыте с загрязнением почвы ДТ в количестве 1,4, 2,8 и 14 л/м2, мазутом в количестве 1,3, 2,6 л/м2 и ОММ – 7,5 л/м2 доза внесения минеральных удобрений была уменьшена в два раза и составила 60 г/м2 (N100P100K100). В качестве органического удобрения использовали препарат «Радогор». Удобрения вносили дважды через 1 и 30 сут после загрязнения, после чего верхний слой почвы перемешивали на глубину до 10 см.
Динамика содержания углеводородов в почве при загрязнении ДТ после внесения удобрений
Внесение удобрений в почву, загрязненную низкой дозой ДТ, не оказало достоверного влияния на скорость убыли НП. Использование удобрений при увеличении дозы ДТ в два раза привело к достоверному снижению содержания НП через 30 сут и далее в течение всего эксперимента (t=2,86-3,89 при =0,95 и df=4) (Рисунок 32). В конце вегетационного периода в почве с удобрениями содержание НП было на 41% ниже, чем без удобрений.
Внесение удобрений в почву, загрязненную ДТ в количестве 10 л/м2, способствовало достоверному снижению содержания НП по сравнению с вариантом без удобрений через 30 сут после начала опыта (t=2,87 при =0,95 и df=4) и далее в течение эксперимента. В конце вегетационного периода остаточное содержание НП в варианте с применением удобрений было на 30% ниже, чем без удобрений. Использование удобрений при максимальной для данных исследований степени загрязнения привело к ускорению процесса убыли НП через 60 сут после загрязнения и далее в течение эксперимента (t=3,23-5,50 при =0,95 и df=4). В конце вегетационного периода содержание НП в этом варианте было на 48% ниже, чем в варианте без удобрений (Рисунок 33).
Динамика содержания углеводородов в почве при загрязнении темными НП после внесения удобрений
Внесение удобрений в почву, загрязненную мазутом в низкой дозе, не оказало достоверного влияния на скорость убыли НП. Использование удобрений при увеличении количества мазута в два раза привело к достоверному снижению содержания НП на 60-е сут и далее в течение эксперимента (t=2,97-3,08 при =0,95 и df=4). В конце вегетационного периода в почве с удобрениями содержание НП было на 20% ниже, чем без использования удобрений (Рисунок 34).
В условиях загрязнения почвы ОММ применение удобрений показало свою эффективность через 30 суток после начала эксперимента (t=3,33-3,78 при =0,95 и df=4). В конце вегетационного периода содержание НП снизилось по сравнению с вариантом без удобрений на 33%. При внесении удобрений в почву, загрязненную смесью мазута и ДТ, достоверное снижение содержания НП наблюдали на 60-е сут и в дальнейшем в ходе эксперимента (t=5,29-7,64 при =0,95 и df=4). В конце вегетационного периода содержание НП в этом варианте было на 54% меньше, чем в варианте без удобрений (Рисунок 35).
Содержание НП в слое почвы 0-10 см при загрязнении ОММ (А) и смесью НП (Б): 1 – без удобрений; 2 – с удобрениями.
Изменение актуальной кислотности загрязненной почвы после внесения удобрений Использование удобрений привело к подкислению почвы, загрязненной ДТ, в среднем на 0,3-0,4, а почвы, загрязненной темными НП – на 0,3-0,6 ед. при различных дозах (Рисунки 36, 37).
