Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Механизмы поддержания гомеостаза организма 10
1.2. Адаптивные формы, связанные с формированием резистентности к неблагоприятным воздействиям среды обитания 15
1.3. Резистентность живых организмов к дискомфортным условиям при острых и хронических воздействиях 26
1.4. Типы терморегуляторных адаптации млекопитающих 29
1.5. Механизмы регуляции метаболизма при действии на организм экстремальных факторов 34
1.6. Функциональная роль витамина Ев организме млекопитающих 38
1.6.1. Природные источники токоферолов 39
1.6.2. Физико-химические свойства токоферолов 41
1.6.3. Превращение и транспорт токоферолов в организме млекопитающих 42
1.6.4. Основные проявления недостаточности витамина Е у млекопитающих 43
1.6.5. Влияние токоферола на репродуктивную функцию животных 46
1.6.6. Вклад а-токоферола в развитие иммунной реакции организма 47
1.6.7. Основные аспекты антиоксидантного действия а-токоферола 47
1.6.8. Адаптогенные свойства токоферолов 50
1.6.9. Роль а-токоферола в формировании устойчивости организма млекопитающих к действию низких температур 53
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 54
2.1 Объект исследований 54
2.2. Условия содержания белых лабораторных крыс 54
2.3. Методика забора крови у белых лабораторных крыс: 55
2.4. Подсчет форменных элементов крови подопытных животных 55
2.4.1. Подсчет количеств а эритроцитов 56
2.4.2. Подсчет общего числа лейкоцитов 56
2.5. Определение цветового показателя эритроцитов 57
2.6. Определение количества гемоглобина 58 в крови лабораторных животных
2.7. Измерение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) 58
2.8. Определение самопроизвольного гемолиза эритроцитов in vitro 59
2.9. Определение интенсивности биохемилюминесценции в сыворотке крови лабораторных крыс 60
2.10. Определение концентрации а-токоферола в сыворотке крови 61
2.11. Построение калибровочного графика 62
2.12. Статистическая обработка экспериментальных данных 62
ГЛАВА 3. ЭТОЛОРИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ В УСЛОВИЯХ НОРМО- И ГИПОТЕРМИИ 66
3.1. Материнское поведение, гнездостроительная активность и взаимодействие с детенышами белых крыс 66
3.1.1. Устройство гнезд лабораторных грызунов при разном температурном режиме содержания 66
3.1.2. Забота о потомстве у белых крыс в связи с температурным фактором 72
3.1.3. Поведенческие реакции детенышей лабораторных крыс в ходе индивидуального развития в условиях нормо- и гипотермии 75
3.2. Агрессивное поведение лабораторных крыс при разнорежимном температурном содержании 78
3.2.1. Склонность животных к каннибализму и инфантициду в условиях нормо- и гипотермии 82
3.2.2.Степень выраженности назо-назальных и назо-анальных контактов в период формирования групп животных 85
ГЛАВА 4. ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ БЕЛЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ КРЫС В УСЛОВИЯХ НОРМО- И ГИПОТЕРМИИ 86
4.1. Основные показатели системы крови млекопитающих 86
4.1.1. Количество гемоглобина в крови экспериментальных животных в условиях нормо- и гипотермии 87
4.1.2. Количество эритроцитов в крови белых крыс в условиях нормо- и гипотермии 92
4.1.3. Динамика сезонных изменений цветового показателя эритроцитов 95
4 1.4. Самопроизвольный гемолиз эритроцитов в условиях нормо- и гипотермии 100
4.1.5. Скорость оседания эритроцитов в условиях нормо- и гипотермии 103
4.1.6. Общее количество лейкоцитов в периферической крови лабораторных грызунов в разные сезоны года 107
ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ТОКОФЕРОЛСОДЕРЖАЩЕЙ ДИЕТЫ НА ФОРМИРОВАНИЕ АДАПТИВНЫХ МЕХАНИЗМОВ ПОДОПЫТНЫХ ЖИВОТНЫХ В НОРМЕ И ПРИ ГИПОТЕРМИИ 114
5.1. Концентрация а-токоферола в сыворотке крови лабораторных крыс при действии термального стресса 114
5.2. Интенсивность процессов свободнорадикального окисления в сыворотке крови белых крыс при кратковременном холодовом воздействии
5.3. Сезонная репродуктивная активность крыс 124
5.4. Динамика сезонных изменений массы тела лабораторных животных 126
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ 130
ВЫВОДЫ 136
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ
ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ 138
ПРИЛОЖЕНИЕ 161
- Механизмы поддержания гомеостаза организма
- Определение цветового показателя эритроцитов
- Устройство гнезд лабораторных грызунов при разном температурном режиме содержания
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение формирования адаптационных процессов привело к накоплению огромного количества данных о феноменологии и механизмах приспособлений к отдельным экологическим факторам и различным типам природной среды на разных уровнях организации живой материи: от молекулярно-биологического и биохимического до биоценотического и экосистемного (Шкорбатов, 1971; Хлебович, 1981; Хочачка, Сомеро, 1988; Озернюк, 2000). Постоянный интерес к данной проблеме связан прежде всего с тем, что способность к адаптации рассматривается как одно из основных свойств живых систем на всех уровнях организации.
Известно, что состояние внутренней среды организма (системы крови) является объективным и достоверным показателем общего состояния, а также основой резистентности и адаптации организма. Адаптация к неблагоприятному температурному режиму представляет собой сложный процесс динамичной последовательной перестройки системной организации функций, направленной на поддержание устойчивого адекватного состояния гомеостатического статуса организма. У гомойотермных животных поддержание термического баланса при значительных отклонениях температуры воздуха от оптимума осуществляется ценой высокого напряжения терморегулирующих реакций.
Различия в особенностях терморегуляции у теплокровных находят отражение прежде всего в изменениях функций системы крови, находящейся в тесной связи с экологической специализацией животного. Адаптация к действию стресс-факторов может сопровождаться значительными изменениями физических, химических, морфологических и других свойств плазмы крови и форменных элементов. Наряду с этим, по мнению ряда авторов (Мошкин, Колосова, 1994), существует тесная связь между устойчивостью организма к низким температурам, эффективностью адаптивных преобразований при длительном воздействии холода и механизмом антистрессорных эффектов некоторых компонентов антиоксидантной системы организма, в частности, <х-токоферола Накопленные к настоящему времени экспериментальные данные о механизмах действия а-токоферола позволяют утверждать, что его вклад в функционирование клетки не ограничивается антиоксидантным действием. Не исключено участие токоферола в регуляции внутриклеточных процессов биосинтеза различных веществ и поддержании гомеостатического статуса организма в изменяющихся и экстремальных услоаиях внешней среды, в частности, при изменении термального режима. В связи со скудностью эколого-физиологических и эколого-биохимических сведений относительно откликов организма на гипотермию при обеспечении его витамином Е и при гиповитаминной диете, актуальным является выяснение механизма формирования указанных реакций на гематологическом фоне организма. Будучи вовлеченным в процессы функционирования клеточного ядра и митохондрий, а-токоферол способствует поддержанию гомеостатического статуса организма в изменяющихся условиях внешней среды.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось исследование формирования адаптивных механизмов—("тп гсппггтиу. фти"і"гич" "vhv биохимических) млекопитающих (на г рШёр&ЫМШРАгКЫрёйЬтых крыс) при
воздействии низких температур в условиях эксперимента В связи с целью работы были поставлены следующие задачи:
-
Выявление особенностей этологии белых крыс при разнорежимном температурном содержании.
-
Исследование гематологических показателей лабораторных крыс в условиях нормо- и гипотермии.
-
Оценка вклада вводимого в пищевой рацион животных а-токоферола в формирование адаптации к неблагоприятному температурному режиму.
4. Разработка модели взаимодействия механизмов, обеспечивающих
терморегуляцию млекопитающих в условиях холодового стресса
Научная новизна.
-
Установлено, что сочетанное воздействие иммобилизационного и холодового стрессов корректируют этологические реакции подопытных животных.
-
Подтверждена теория о наличии коллективной терморегуляции у грызунов в условиях гипотермии;
-
Установлена сезонная динамика комбинированного влияния низкой температуры и токоферола на гематологические показатели лабораторных животных.
4 Выявлены основные параметры биохемилюминесиенции сыворотки
крови подопытных животных в условиях модельного эксперимента по созданию
острого холодового стресса.
5. Разработана концептуальная модель поддержания температурного
гомеостаза организма млекопитающих при воздействии термического фактора.
Теоретическое значение работы. Полученные результаты вносят вклад в развитие Теории адаптации организмов и учения об общем адаптационном синдроме.
Практическая значимость работы Результаты исследований применимы в клинической практике при оценке иммунного статуса организма после пребывания в экстремальных условиях.
Параметры мониторинга реакций экспериментальных белых крыс в разнорежимных температурных условиях используются при разведении и содержании лабораторных животных.
Полученные результаты исследований используются в учебном процессе при проведении Большого практикума на кафедре теоретической и медицинской зоологии биолого-почвенного факультета ВГУ
Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на 8-й и 9-й Пушинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21го века» (Пушино, 2004, 2005), международной научной конференции «Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики» (Саранск, 2005), ежегодных научных отчетных конференциях преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2003, 2005).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в б публикациях - 4 статьях и 2 тезисах.
На защиту выносятся следующие положения:
-
При снижении температуры среды до 0 С изменяются этологические реакции лабораторных грызунов, касающиеся гнездостроения, материнского поведения, взаимодействий между отдельными особями сформированных групп.
-
Введение токоферола в пищевой рацион экспериментальных животных оказывает влияние на выживание особей при кратковременном и пролонгированном холодовом стрессе.
-
Витамин Е способствует повышению общего метаболического уровня организма, что находит свое отражение в показателях массы тела лабораторных животных, их репродуктивной активности, гематологических характеристиках.
4 Полученные данные позволяют построить модель взаимосвязи процессов, возникающих при сочетанном действии на организм холода витамина Е.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа представлена на 171 странице текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов экспериментальных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы (252 источника), приложения. Иллюстративный материал включает 28 рисунков, 22 таблиц.
Механизмы поддержания гомеостаза организма
Одной из. важнейших особенностей живого организма является его способность поддерживать относительное: постоянство физиологических и биохимических констант при широком диапазоне изменений: условий внешней среды, хотя скорость тысяч различных одновременно протекающих реакций меняется в соответствии с характером действия окружающей среды. Впервые вопрос о значении гомеостаза в деятельности организма поставил французский ученый:Клод Бернар (1878). Он показал, что внутренняя;среда живого организма должна сохранять постоянство при изменениях внешней среды- Сам же термин «гомеостаз» 50 лет спустя предложил выдающийся американский; физиолог Уолтер Б. Кеннон для обозначения состояния скоординированных физиологических процессов, которые поддерживают устойчивое функционирование организма (Гаркави Квакина, 1990).
Хотя; организм животного представляет собой открытую систему, широко осуществляющую связь с окружающей средой, воздействия последней- на основные функциональные системы обычно не сопровождаются большими отклонениями- от нормы и не приводят к серьезным нарушениям их деятельности: Это достигается автоматической саморегуляцией, которая ограничивает возникающие в организме колебания различных физиологических и биохимических параметров сравнительно узкими; пределами. Вместе с тем следует отметить, что в физиологии термин «гомеостаз» означает не просто постоянство химических и физико-химических:параметров организма, а так называемое подвижное равновесие. Согласно А. Н. Меделяновскому (1982), основным содержанием понятия гомеостаза является оптимальное постоянство условий внутренней среды, соответствующее динамическому уравновешиванию поступления и расходования в процессе обмена в организме потоков материи и энергии. Оптимальное постоянство внутренней среды обеспечивается эволюционно выработавшимися, наследственно закрепленными регуляторными механизмами организма.
Как подчеркивал П. К. Анохин (1980), каждый организм представляет собой динамическое сочетание устойчивости и изменчивости, в котором: последняя служит его адаптивным реакциям- и, следовательно, защите его: наследственно закрепленных жизненно важных констант. Он различал три-категории физиологических констант; а) жесткие, диапазон которых между уровнем константного состояния- и предельным отклонением, несовместимым; с жизнью, очень узок; б) с менее: жестким диапазоном, имеющие определенное адаптивное значение: для других функций; в) пластические, с достаточно: широким диапазоном изменчивости. При развитии этих положений К. В. Судаков (1976) показал, что постоянство распространяется лишь на ограниченную часть наиболее значимых физиологических показателей, причем лишь в, определенной; области организма (Ливанов; Судаков, 1976).
Живой; организм,, будучи ультрастабильной системой, осуществляет активный поиск оптимального и. наиболее: устойчивого состояния, что выражается в адаптации. При изменении условий; окружающей среды в организме включаются реакции, обеспечивающие поддержание стационарного состояния, выработку или сохранение оптимальных форм взаимодействия организма и среды в новых условиях его существования. При этом гомеостаз предполагает поддержание не только пластического, энергетического и структурного равновесия, но и равновесия информационных процессов (Бирюков, 1961; Озернюк, Нечаев, 2002):,
Все проявления гомеостаза в той5 или иной степени генетически детерминированы, хотя к настоящему времени еще не выявлены конкретные генетические механизмы, лежащие в их основе. Доказательством генетической детерминированности гомеостаза организма может служить то, что в наследственной программе индивидуального развития организма, то есть в его генотипе, формирование видоспецифических характеристик происходит не в постоянных, а в меняющихся условиях; среды. Причем организмы каждого биологического вида реагируют на конкретные изменения условий среды, в- которых протекает развитие, вполне детерминированно, в пределах наследственно обусловленной нормы, так называемой нормы реакции (Шмальгаузен, 1968). Любое конкретное проявление гомеостаза, являясь одним из элементов фенотипа, находится под генетическим контролем- поскольку как фенотип в целом, так и составляющие его элементы, есть продукты реализации наследственной информации при- определенных условиях среды (Верещагин; 1988). Чем шире наследственная норма реакции, тем больше способность организма поддерживать гомеостаз. Чем жестче и уже норма реакции, тем шире фенотипическая дисперсия и выше чувствительность к факторам среды, а также возможность развития патологии;
Определение цветового показателя эритроцитов
Для- определения интенсивности процессов свободнорадикального окисления (СРО) в сыворотке экспериментальных животных применяли метод железоиндуцированнои хемилюминесценции пероксидом водорода (Н2О2), основанный на том, что в представленной схеме происходит каталитическое разложение пероксида ионами металла с переходной валентностью - Fe по реакции Фентона. Образующиеся при этом свободные радикалы (R-, ОН., RO , R02 , 02) вступают в процесс инициации СРО в исследуемом биологическом субстрате (Косолапов, 1991;.
Протекающий свободнорадикальный процесс регистрировали в течение 30 сек. (времени наибольшей информации о его интенсивности) на биохемилюминометре БХЛ-06М с программным обеспечением. Интенсивность процессов СРО определяли по значению максимальной интенсивности сигнала (Imax) и светосуммьг (S) хемилюминесценции. На течение этого: процесса оказывает влияние: полный комплекс соединений, обладающих как антиоксиданти ым (а-токоферол), так и про оксид антным действием, т. е. данный; метод дает возможность оценить уровень компенсаторных механизмов процессов СРО в организме, Антиоксидантный потенциал пробы коррелирует с показателем tg сс2. Данный метод является высокочувсвительным на наличие патологических процессов в организме; Среда для; определения: интенсивности биохемилюминесценции имела следующий состав: 0,4 мл 0,02 моль/л калий-фосфатного буфера (рН=7,5), 0,4 мл 0,01 ммоль/л FeS04, 0,2 мл 2%-ного раствора H202, вносимого непосредственно перед измерением. Исследуемый образец сыворотки вносили в количестве 0,1 мл непосредственно перед измерением. За 30 сек. исследовали5 интенсивность максимальной вспышки хемилюминесценции, светосумму и- tg а2, которые являются, объективными показателями интенсивности процессов СРО:
Данный метод основан на фотометрировании хромогенного комплекса соединения Fe и;ортофенантролина; образующегося при взаимодействии а-токоферола с FeCl3. К 1 мл сыворотки: добавляли 1 мл 96 %-ного этанола, тщательно перемешивали стеклянной палочкой. Затем добавляли- 3 мл гексана, энергично встряхивали в течение 2 мин. и центрифугировали в течение 10 мин, при 2500.- 3000 g (об/мин.). Из образовавшегося верхнего гексанового слоя отбирали по 2 мл раствора,, переносили в химические пробирки и, инкубировали; на водяной: бане при t=50±5 G. Полученный сухой остаток растворяли в Л мл бензола, добавляли к нему 1 мл 0,025 %-ного: FeCb и выдерживали 5 мин. при комнатной температуре. В образовавшуюся смесь вносили Л мл 0,05 %-ного раствора ортофенантролина и ровно через две минуты (по секундомеру) измеряли оптическую плотность (Роп) на: спектрофотометре СФ-26 при длине волны 510 нм; против пробы, содержащей 1 мл бензола и 2 мл этанола: Контрольная проба содержала 1 мл бензола, 1 мл 0,025 %-ного FeCl3 и: 1 мл 0,05 %-ного раствора ортофенантролина. Количество а-токоферола, участвующего в реакции с РеСІз, определяли по калибровочной кривой.
Формула І для расчета: D=D0[1-DK, где Don - значение: оптической-плотности экспериментальной; пробы, DK - величина оптической плотности контрольной пробы.
Устройство гнезд лабораторных грызунов при разном температурном режиме содержания
У грызунов наблюдается большое разнообразие форм гнезда от почтиL полного его отсутствия до весьма: сложных сооружений (Меннинг, 1982). Грызуны устанавливают гнезда. и тогда,, когда у них нет детенышей,; однако моменту появления потомства гнездо усложняется; делается крупнее. Сложность конструкции гнезда зависит в значительной степени от зрелости, новорожденных детенышей? данного вида, но коррелируется; внешними, факторами, одним; из которых является температура- окружающей; среды; (Дьюсбери, 1981). Для белых крыс как вида, способного размножаться круглогодично, термический режим в- гнезде имеет важное значение ДЛЯ; выживания потомства в холодное время года.
В ходе наблюдений за гнездостроительным=поведением лабораторных крыс было отмечено, что у беременных самок повышается строительная активность, в то время как у самцов, и не: беременных самок не прослеживалось .тенденции: к устройству гнездовых убежищ. За . несколько дней до родов гнездостроительная деятельность еще более возрастала: в этот период самки: были: малоподвижны,- но продолжали строить, гнездо. Окончательно готовое: гнездо имело почти, шаровидную форму;, по мере вырастания крысят в дальнейшем оно разрушалось, превращаясь постепенно в толстую утоптанную подстилку. Было установлено также, что самки лабораторных экспериментальных крыс вообще не устраивают гнезд при температуре окружающей среды выше определенного порога. Так, при температуре выше 21 С детеныши белых крыс остаются на практически открытой поверхности, что, вероятно, способствует облегчению теплоотдачи с поверхности тела.
Температура: окружающей: среды . оказывает влияние и на стремление самки; построить гнездо в определенном месте занимаемой; группой животных клетки; Поздней осенью, в зимний период и ранней весной, когда температурные колебания отличались значительно (t = 1+12С); самки старались, расположить гнездо в, том, углу клетки, который был наиболее удален от источника холодового воздействия - открытого окна, несмотря на, очевидное неудобство (поскольку в некоторых случаях гнездо располагалось непосредственно1 вплотную к дверце клетки) подобного местоположения. Однако, по-видимому, самка в данном случае выбирала, «из двух зол» меньшее: стремление к поддержанию «внутри» выводка; относительно комфортной температуры преобладало над реакциями, связанными с защитой: крысят от потенциальных врагов; (в ходе экспериментов экспериментатор производил различного рода манипуляции именно в данной зоне).
Значение температурного фактора: в гнездовом поведении: лабораторных крыс нашло свое отражение и в; проведенных нами экспериментах с разными по величине (количеству детенышей) выводками. Известно, что важным экологическим фактором, во многом определяющим; физиологические особенности молодняка большинства имматуранатных животных, является их многочисленность в помете. Предполагается, что значительную роль в регуляции теплообмена играют поведенческие реакции, определяющие плотность непосредственных контактов между отдельными особями в гнезде в зависимости от внешней температуры; (Адольф, 1971). Чем большее количество крысят находилось.в гнезде (нередко это были выводки нескольких самок), тем раньше начали самки сокращать время пребывания с детенышами. Присутствие матери в гнезде имеет значение для поддержания температуры, тела крысят до 12-дневного возраста (Gelineo, Sokis, 1963). Нами было установлено, что при температуре воздуха 0-7С самка находится в гнезде почти все время, активно собирая крысят в плотную компактную группу (и нередко перетаскивая туда куски пищи, поедая ее, не оставляя выводок). При температуре среды выше 21С длительность пребывания ее в гнезде и контакт с детенышами резко уменьшаются. Самцы хоть и не принимают активного участия в выращивании детенышей крыс, но, находясь вместе с выводком в гнезде, также обеспечивают необходимый микроклимат. (По данным Пегельмана и Стрельникова (1966), в гнездах, где находятся помимо крысят еще 5-6 взрослых крыс, температура может превышать температуру окружающей среды на 15С и более). Регуляция теплообмена путем изменения структуры гнезда или скручивания находящихся там взрослых особей является характерной особенностью белых крыс как вида, которому свойственно гнездостроение.
