Введение к работе
Актуальность работы
Размножение патогенных бактерий внутри макроорганизма требует от них способности адаптироваться к условиям существования, кардинально отличающимся от внешней среды. Далеко не все эти факторы благоприятны для существования микроорганизма, и даже в целом к благоприятным факторам требуются эффективная адаптация. Внимание исследователей, работающих в области медицинской микробиологии, в течение многих лет было приковано к изучению продуцируемых бактериями факторов патогенности, влияющих на структуры и функции макроорганизма, исследованию молекулярных механизмов их активности и роли в развитии инфекционного процесса. Результаты многочисленных экспериментов доказывают, что, помимо продукции специфических факторов патогенности, существование внутри организма требует от бактерий существенных перестроек общего метаболизма (Chico-Calero et al., 2002; Lucchini et al., 2005; O'Riordan et al., 2003).
Изучение механизмов адаптации к условиям размножения в ходе инфекционного процесса, связанных с изменениями общего метаболизма бактерий, имеет фундаментальный интерес как само по себе, так и для понимания механизмов становления патогенности как явления. Вместе с тем, изучение перестроек метаболизма, необходимых для эффективного размножения in vivo, имеет и большое практическое значение как подход к созданию аттенуированных штаммов, обладающих высокой иммуногенностью при сохранении антигенных детерминант, но не способных индуцировать инфекционный процесс.
Грам-положительная бактерия Listeria monocytogenes вызывает листериоз - тяжелое заболевание людей и животных, связанное с поражением центральной нервной системы и/или плода у беременных (Vazquez-Boland et al., 2001; Тартаковский И.С. и др., 2002). В связи с широким распространением и высокой летальностью (до 30%) листериоз является серьезной проблемой для медицины (Тартаковский И.С. и др., 2002; Зайцева Е.А. и др., 2007). Кроме
того, листериоз является важной проблемой для ветеринарии, вызывая эпизоотии среди мелкого и крупного рогатого скота (Бакулов И.А. и др., 1994; Czuprynski, 2005).
L. monocytogenes относится к числу факультативных внутриклеточных паразитов. В процессе инфекции L. monocytogenes проникает в эукариотические клетки путем естественного или индуцированного (в случае непрофессиональных фагоцитов) фагоцитоза. Попавшая в фагосому бактерия разрушает фагосомальную мембрану и выходит в цитоплазму, где размножается с высокой эффективностью (Portnoy et al., 1992; Vazquez-Boland et al., 2001; Тартаковский И.С. и др. 2002).
Помимо факторов патогенности, влияющих на функции эукариотической клетки, таких как листериолизин О, фосфолипазы, фактор полимеризации актина ActA и др., в ходе инфекции L. monocytogenes продуцирует некоторые белки общего метаболизма, необходимые для ее адаптации к размножению внутри макроорганизма. Например, для участвующего в импорте глюкозо-1-фосфата белка Hpt доказана роль в адаптации к размножению внутри цитоплазмы и в вирулентности (Chico-Calero et al., 2002). Однако до настоящего времени роль в инфекционном процессе белков общего метаболизма изучена недостаточно, равно как и адаптационные механизмы, позволяющие бактериям колонизировать макроорганизм, эффективно используя его ресурсы и приспосабливаясь к микроокружению.
Цель работы - выявление и идентификация белков, обеспечивающих адаптацию L. monocytogenes к размножению в макроорганизме, и оценка возможности аттенуации L. monocytogenes путем делеции кодирующих их генов.
Для постижения поставленной цели необходимо было решить следующие
задачи:
- разработать критерии для проведения биоинформационного анализа и
провести анализ базы данных, содержащей последовательность генома L.
monocytogenes, с целью идентификации открытых рамок считывания
(OPC), продукты которых могут быть вовлечены в процесс адаптации к размножению в макроорганнзме;
провести инсерционный мутагенез кандидати ых ОРС для выявления мутаций, приводящих к уменьшению вирулентности L. monocytogenes, на модели экспериментального лпетерноза у лабораторных мышей;
получить и охарактеризовать мутантные штаммы L. monocytogenes с делецией генов, инсерции в которых приводят к снижению вирулентности;
оценить вирулентность и способность к внутриклеточному размножению штаммов L. monocytogenes, с делениями генов, идентифицированных в ходе данной работы.
Научная понизил и практическая значимость.
Разработаны критерии бноинформацнонного поиска, позволившие выявить ОРС. нарушение целостности которых в результате инсерции приводит к изменениям вирулентности L. monocytogenes. Впервые на модели экспериментального листериоза у лабораторных мышей показано, что инсерции в генах 1то0028 и 1то1493 приводят к уменьшению степени пораження внутренних органов при экспериментальном листериозе у лабораторных мышей линии BALB/c, а инсерции в генах 1то()961 и 1то2077 увеличивают степень поражения.
Установлено, что инсерция в опероне 1то2075 - 1то2078 приводит к увеличению вирулентности мутантпых бактерий in vivo, но снижает способность L. monocytogenes расти in vitro в аэробных условиях, которая восстанавливается при культивировании бактерий в анаэробных условиях.
Показано, что мутации в гене 1то()028, кодирующем L,D-карбокенпептидазу, приводят к появлению удлиненных (до 10 раз по сравнению с бактериями дикого типа) бактериальных клеток при выращивании лнетсрий in vitro на твердых питательных средах, но не в бульоне.
Показано, что удлинение бактериальных клеток, мутантных по гену 1то()028, коррелирует с увеличением количества генетического материала,
содержащегося в одной колониеобразующей единице, что свидетельствует о присутствии нескольких копий генома в одной бактериальной клетке. Таким образом, впервые для грам-положительных бактерий доказано участие ЦБ-карбоксипептидазы в процессе расхождения бактериальных клеток после деления.
Показано, что мутация в гене 1то0028, кодирующем L,D-карбоксипептидазу, нарушает процесс бактериального деления при размножении листерий внутри цитоплазмы эпителиальных клеток.
Показано, что инактивация гена 1то0028 приводит к снижению вирулентности L. monocytogenes на модели экспериментального листериоза у мышей линии BALB/c. При этом аттенуация не связана с изменением уровня продукции основных факторов патогенности (LLO и PlcA) и/или цитотоксичности, и, по-видимому, связана с ролью кодируемой геном 1то0028 ЬДЗ-карбоксипептидазы в бактериальном делении в процессе внутриклеточного размножения.
Полученные результаты могут быть использованы для получения аттенуированных штаммов других видов бактерий путем введения сайт-специфических мутаций в гены, кодирующие Ь,0-карбоксипептидазы, как предложено в методических рекомендациях «Получение аттенуированных штаммов бактерий в результате сайт-специфического мутагенеза гена, кодирующего Ь,0-карбоксипептидазу», утвержденных на совете по внедрению научных достижений в практику в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН «27» октября 2008 г.
Материалы диссертации представлены на IV-м Московском Международном Конгрессе: «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), на П-ой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье», (Рязань, 2007).
Материалы диссертации отмечены медалью Конгресса на конкурсе молодых ученых на IV-м Московском Международном Конгрессе: «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007).
Апробация работы
Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции отдела медицинской микробиологии и отдела природноочаговых инфекций ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН 19 июня 2008 года.
Публикации
По данной теме опубликовано 5 печатных работ. 1 статья опубликована в журнале, рекомендованном ВАК.
Структура н объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (28 отечественных и 155 зарубежных источников). Работа изложена на 119 страницах, проиллюстрирована 6 таблицами и 28 рисунками.
