Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Лабораторная диагностика синегнойной инфекции 13
1.2. Применение МкАт для изучения синегнойной палочки и ее обнаружения в различных объектах исследования... 26
Собственные исследования 31
Глава 2. Материалы и методы 31
2.1. Штаммы микроорганизмов, питательные среды 31
2.2. Лабораторные животные 31
2.3. Клеточные линии 32
2.4. Антигены 32
2.5. Схемы иммунизации животных, получение иммунных спленоцитов и антисывороток 34
2.6. Протоколы гибридизации 36
2.7. Отбор антителопродуцирующих гибридом и их клонирование 37
2.8. Накопление, очистка, изотипирование МкАт 38
2.9. Анализ специфичности МкАт 39
2.9.1. Иммуноферментный анализ 39
2.9.2. Иммуноблоттинг 39
2.10. Диагностические препараты 40
2.10.1. Антимышиный ИПК 40
2.10.2. Получение экспериментальных образцов меченых МкАт 40
2.10.3. Приготовление меченых флуорохромом антител на основе поликлональных иммуноглобулинов 41
2.11. Оценка активности и специфичности эксперимен-тальных образцов меченых флуоресцеинизотиоцианатом поли- и моноклональных антител 42
2.12. Оценка активности моноклональных ИПК и их применение в ИФА для выявления антигенов P. aeruginosa 43
2.13. Методы статистической обработки результатов опытов 43
Глава 3. Получение гибридом-продуцентов МкАт к антигенам P.aeruginosa 44
3.1. Оптимизация схем стимуляции В - лимфоцитов 45
3.2. Стабилизация свойств гибридом, условия их сохранения и накопление МкАт in vitro и in vivo 50
Глава 4. Характеристика свойств МкАт к антигенам P. aeruginosa 53
4.1. Специфическая активность МкАт 53
4.2. Иммунохимический анализ 56
Глава 5. Изучение возможности применения МкАт к антигенам синегнойной палочки в качестве основы иммунодиагностических препаратов для ИФлА и ИФА 59
5.1. Получение и оценка свойств иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих моноклональных и поликло-нальных к антигенам P.aeruginosa 59
5.2. ИФА с применением моноклональных антител 65
Глава 6. Перспективы совершенствования лабораторного анализа синегнойной инфекции 72
6.1. Обнаружение P.aeruginosa в пробах из объектов внешней среды стационаров 72
6.2, Идентификация синегнойной палочки, изолирован ной из проб клинического материала 76
6.3. Применение моноклональных иммуноглобулинов в ИФлА для изучения мазков-отпечатков при моделировании экспериментальной синегнойной инфекции 77
Заключение 79
Выводы 88
Список использованных источников 89
- Лабораторная диагностика синегнойной инфекции
- Штаммы микроорганизмов, питательные среды
- Оптимизация схем стимуляции В - лимфоцитов
- Специфическая активность МкАт
- Получение и оценка свойств иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих моноклональных и поликло-нальных к антигенам P.aeruginosa
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема внутрибольничного инфицирования приобретает все большую медицинскую и социальную значимость (21, 32, 39, 40, 48, 56). Повышение внимания к данной проблеме связано с регистрируемым в последние годы ростом тяжелых осложнений в стационарах различного профиля, обусловленных циркуляцией в них штаммов микроорганизмов с высоким уровнем резистентности к химиопрепаратам (84, 131). На смену доминировавшей прежде грампо-ложительной микрофлоре все чаще приходят грамотрицательные условно-патогенные микроорганизмы (8, 16, 26).
Изменение микробного пейзажа стационаров связано с рядом причин, среди которых наиболее значимой являются появление полирезистентных к антимикробным препаратам госпитальных штаммов (63, 69, 83, 86, 88, 121) как следствие повсеместного широкого и зачастую бесконтрольного применения антибиотиков. Отмечают также возрастание числа иммунокомпрометирован-ных лиц со сниженным уровнем резистентности. Увеличение числа пожилых лиц в возрастной структуре населения сопровождается также увеличением частоты нозокомиальных инфекций. Среди всех случаев бактериемии и менингитов вызванного грамотрицательной микрофлорой на долю лиц старше 65 лет приходится 50 % (16).
Снижение естественного антибактериального иммунитета и появление большого числа лиц с измененным иммунным статусом зачастую обусловлено интенсивной и/или нерациональной антибактериальной терапией или являются результатом проводившейся иммуносупрессивной терапии (17, 64, 118).
Синегнойная палочка - одна из наиболее частых причин возникновения внутрибольничных (нозокомиальных) инфекций: пневмоний, раневой инфекции, бактериемии, поражений мочевыводящих путей. В последние годы число больных с гнойно-септическими осложнениями синегнойной этиологии воз- росло и в ряде случаев достигает 30 % от числа госпитальных осложнений (18, 21, 23, 32, 34, 39, 41, 47, 49, 51, 53, 61,118).
Синегнойная инфекция распространена повсеместно. Мониторинг внешней среды стационаров в части циркуляции штаммов P.aeruginosa является жизненно важной проблемой практического здравоохранения.
В нашей стране госпитальные штаммы P.aeruginosa отнесены в разряд социально значимых "проблемных микроорганизмов", циркуляция которых в лечебных учреждениях требует постоянного надзора (15, 61). Pseudomonas aeruginosa занимает второе место по частоте инфицирования пациентов хирургических отделений и третье - в терапевтических стационарах (11, 41, 52, 83, 118). Смертность от синегнойного сепсиса у ожоговых больных достигает 60 - 70 %, несмотря на проводимую комплексную терапию (8, 23). Кроме того, высокий уровень внутрибольничного инфицирования си-негнойной палочкой регистрируют в отделениях урологии, травматологии, трансплантологии и неонатологии (1, 43, 51, 61, 118, 131).
Традиционные методы бактериологической идентификации патогенов обеспечивают получение ответа в сроки не ранее 2-3 суток от момента начала исследования, что тормозит проведение адекватной терапии. В связи с этим, особую значимость приобретает вопрос об использовании методов экспресс-анализа проб клинического материала и объектов внешней среды (31, 44). В нашей стране методы экспресс-обнаружения P.aeruginosa в лабораториях практически не используют. В то же время, известно, что ПНР и ИФА зарекомендовали себя как эффективные и быстрые методы исследования проб клинического материала и объектов внешней среды при поиске синегнойной палочки (72,91,106).
Перспективы совершенствования всей системы контроля микробного пейзажа медицинских учреждений напрямую связаны с разработкой и применением в повседневной работе быстрых и достоверных методов обнаружения и идентификации возбудителей госпитальных инфекций.
Необходимым условием широкого использования в практических лабораториях иммунодиагностических тестов (ИФА, ИФлА и других) является наличие препаратов и тест-систем, изготовленных на основе высокоактивного сырья, предназначенных для обнаружения P.aeruginosa в различных объектах исследования.
На сегодняшний день наиболее совершенной основой для производства высокоактивных иммунодиагностических препаратов признаны МкАт. Их использование в диагностических тест-системах обеспечивает существенное повышение чувствительности и специфичности, а стабильность свойств МкАт является определяющим фактором изготовления стандартных образцов препаратов.
Ввиду отсутствия отечественных диагностических систем для выявления P.aeruginosa и перспективностью использования в них МкАт были определены цель и задачи работы.
Цель работы: получение МкАт к диагностически значимым видоспеци-фичным антигенам синегнойной палочки и изучение возможности создания на их основе высокоэффективных препаратов, пригодных для экспресс-анализа проб из объектов внешней среды и клинического материала.
Задачи исследования.
При выполнении работы необходимо было решить следующие задачи:
Подобрать схемы иммунизации мышей антигенными препаратами P.aeruginosa оптимальные для получения гибрид ом-продуцентов ан-тисинегнойных антител.
Разработать систему скрининга гибридных культур для отбора продуцентов антител к антигенам P.aeruginosa.
Провести эксперименты по слиянию иммунных спленоцитов с клетками мышиных миелом P3-X63-Ag8.653 и Sp 2/0 и оценить эффек- тивность гибридизации и количество образующихся при этом культур-продуцентов антител.
Провести клонирование гибридных культур и на основе отбора технологичных клонов создать коллекцию стабильных гибридом, синтезирующих антитела к антигенам P.aeruginosa.
Оценить специфическую активность МкАт в отношении типовых штаммов P.aeruginosa и гетерологичных псевдомонад в ИФА и ИФ-лА и выявить природу комплементарных лигандов.
Наработать в препаративных количествах МкАт к эпитопам, экспонированным на клеточной стенке P.aeruginosa.
На основе антисинегнойных МкАт приготовить экспериментальные образцы иммунодиагностических препаратов для ИФлА и ИФА и оценить их специфичность и активность.
Провести сравнительный анализ эффективности применения ФИТЦ-меченых препаратов моно- и поликлональных антител для экспресс обнаружения P. aeruginosa в пробах клинического материала и из объектов внешней среды.
Научная новизна.
Создана первая отечественная коллекция стабильных гибридом-продуцентов МкАт к антигенам P. aeruginosa, локализованным на поверхности микробных клеток. С помощью МкАт уточнена структурная организация иммунореактивных компонентов P.aeruginosa, имеющих диагностическое значение.
Представлены доказательства преимущества применения монокло-нальных иммуноглобулинов по сравнению с поликлональными при изготовлении диагностических средств, предназначенных для обнаружения и идентификации P.aeruginosa в клиническом материале от больных и пробах из объектов внешней среды.
11 Впервые с применением МкАт исследованы пути и скорость дис-семинации микробных клеток при моделировании экспериментального синегнойного сепсиса.
Практическая значимость.
Создана и сохраняется в криобанке ВолгБИПЧИ панель клонов гиб-ридом-продуцентов антител к диагностически значимым антигенам P.aeruginosa.
Созданные на основе моноклональных антител иммуноферментный и иммунфлуоресцентный диагностикумы позволяют в течение 4-6 часов от момента взятия материала на исследование с высокой специфичностью и чувствительностью выявлять и идентифицировать P.aeruginosa в клиническом материале от больных и пробах из объектов внешней среды. Разработанные экспресс методы анализа служат основой для изменения общепринятой тактики лабораторных исследований, направленных на выявление внутрибольничных штаммов P.aeruginosa и проведение профилактических мероприятий по санации помещений.
Разработаны и утверждены Ученым советом ВолгНИПЧИ (протокол № 6 от 25.06.2003 г.) «Методические рекомендации по применению метода флуоресцирующих антител для экспресс обнаружения синегнойной палочки в пробах из объектов внешней среды стационаров».
3. Особенности экспериментов по получению моноклональных антител к антигенам P.aeruginosa отражены в одобренных Ученым советом Волг НИПЧИ «Методических рекомендациях по получению гибридом-продуцентов МкАт к антигенам синегнойной палочки» (протокол № 14 от 27.12.2000 г.), и «Методических рекомендациях по получению гибридом-продуцентов МкАт к ЛПС и экзотоксину А синегнойной палочки» (протокол № 6 от 5.06.2002 г.), предназначенных для сотрудников специализированных биотехно логических лабораторий.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Создана первая отечественная коллекция технологичных гибридом- продуцентов моноклональных антител к диагностически значимым водорас творимым антигенам микробных клеток и ЛПС P.aeruginosa.
2. Разработанные на основе использования моноклональных антител реагенты для иммуноферментного и иммунофлуоресцентного методов анализа позволяют без выделения чистой культуры ускоренно выявлять синегнойную палочку и её антигены в клиническом материале от больных и пробах из объ ектов внешней среды. По показателям специфичности и чувствительности разработанные тесты существенно превосходят тесты, основанные на исполь зовании поликлональных антител.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 103 стр. машинописного текста, иллюстрирована 16 таблицами и одним рисунком. Состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения и выводов. Библиографический указатель включает 61 отечественных и 70 зарубежных источников.
Апробация работы:
Материалы, изложенные в диссертации, обсуждены на конференции молодых ученых (Москва, НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, 1998г.), юбилейной конференции, посвященной 30 - летию ВолгНИПЧИ, проходившей 28 - 29 ноября 2000 г., IV научной конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000", проходившей 23-25 мая 2000г.
Публикации результатов исследований:
Основные положения диссертации отражены в 12 печатных работах.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1.1. Лабораторная диагностика синегнойной инфекции
Синегнойная палочка, с 70-х годов, стала одним из ведущих возбудителей как местных, так и генерализованных гнойно-воспалительных процессов (32, 34, 40, 49, 53). Гнойно-септические заболевания, обусловленные этим возбудителем, проявляются наиболее часто в ожоговых, онкологических, пульмонологических, урологических клиниках и в отделениях реанимации (19, 23, 41, 56,61,64,131).
Установлено, что риск заражения больных в стационаре очень высок и пропорционален продолжительности их пребывания в клинике и частоте использования инструментальных вмешательств - катетеризации, цистоскопии, трахеостомы, внутривенных манипуляций (23, 49, 56, 61).
Вопросы совершенствования методов экспресс-обнаружения P.aerugi-nosa во внешней среде стационаров и ранней диагностики синегнойной инфекции привлекают все большее внимание специалистов служб надзора за внутрибольничными инфекциями.
На сегодняшний день лабораторные исследования, направленные на раннее обнаружение и идентификацию синегнойной палочки в пробах с объектов внешней среды стационаров и патологическом материале от больных, проводят в учреждениях службы Госсанэпиднадзора и в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений, согласно ряду инструктивно-методических документов, утвержденных МЗ РФ (30, 35, 37).
Основным методом лабораторной диагностики синегнойной инфекции по-прежнему остается бактериологическое исследование.
При проведении исследования по унифицированной схеме (30, 35), применяемой для своевременного решения вопросов профилактики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний и осложнений у стационарных больных, данные о родовой принадлежности изолируемых микроорганизмов могут быть получены через 1-2 суток от момента начала исследования. Однако идентификация выделенной культуры бактерий завершается, как правило, только через трое суток. Применение для первичного посева клинического материала селективных сред с целью выделения синегнойной палочки, позволяет сократить время, необходимое для идентификации выделенной культуры, до двух суток. При наличии характерного роста на селективной среде и морфологии колоний, сине-зеленого пигмента, положительного цитохромоксидазного теста и специфического запаха жасмина или земляничного мыла возможна идентификация 75 % выделяемых культур синегнойной палочки. В то же время, в случае преобладания в условиях конкретного стационара атипичных штаммов P. aeruginosa, быстрая идентификация данного вида микроорганизмов бывает затруднена. Время исследования удлиняется ввиду необходимости постановки большего числа тестов, подтверждающих как видовую принадлежность изолятов, так и обеспечивающих дифференциацию P.aeruginosa от других видов псевдомонад.
Анализ исследований целого ряда авторов подтверждают факт неуклонного роста числа беспигментных штаммов P.aeruginosa (7, 15, 49, 55). Определенные трудности возникают и при обнаружении и идентификации безжгутиковых, меланиногенных, апиоцианиногенных вариантов P.aeruginosa (7, 9, 49).
В повседневной бактериологической работе целенаправленный поиск синегнойной палочки проводят по схемам выявления группы грамотрицатель-ных неферментирующих бактерий (38), бактериологической диагностики синегнойной инфекции или идентификации беспигментных штаммов (30). Во всех этих случаях выполнение требуемых этапов бактериологического исследования материала требует не менее трех суток.
Длительность бактериологического исследования влияет на темпы принятия своевременных адекватных мер по борьбе с инфекцией и ее профилактике.
Синегнойная палочка встречается, как правило, в ассоциации с другими возбудителями, где ее долевое участие может быть незначительным, подчас неадекватным патогенетической роли (8). При проведении бактериологического анализа возможны диагностические ошибки (46).
Разработка экспрессных и ускоренных методов обнаружения и идентификации потенциально патогенных бактерий - возбудителей внутрибольнич-ных инфекций, в том числе синегнойной палочки, требует внимания специалистов ввиду востребованности тестов, которые позволяют дать ориентировочный ответ о наличии или отсутствии в исследуемых пробах искомого микроорганизма в течение первых часов от момента начала исследования.
За рубежом разработаны и внедрены в практику автоматизированные системы ускоренного обнаружения бактерий API-20E, Oxi/Ferm и BIOTEST MHK/1D, а также коммерческие наборы для идентификации (Auto-Microbic System и MS-2), на основе показателей биохимической активности микроорганизмов, позволяющие получить точный бактериологический ответ за относительно небольшой промежуток времени в 95,8 - 97 % случаев.
Эти тесты просты в исполнении и учете результатов. Однако в нашей стране их применение во многих клинических лабораториях ограничено из-за отсутствия финансовых средств для их приобретения. Подавляющее большинство клинико-диагностических лабораторий различного уровня не располагают подобными возможностями и проводят исследования по выявлению и идентификации синегнойной палочки в рамках традиционной схемы бактериологического анализа.
Важным этапом воспроизведения данной схемы исследования в полном объеме является этап проведения внутривидовой дифференциации с целью эпидемиологического анализа микробного пейзажа конкретного лечебно-профилактического учреждения на момент исследования различных проб из объектов внешней среды и клинического материала от больных стационара. Выяснение источников возникновения инфекции и ее распространения в таких
16 ситуациях приобретает очень важное значение и в этом случае значительная роль отводится различным методам типирования выделенного штамма возбудителя синегнойной инфекции.
Большинство исследователей, занимающихся типированием штаммов синегнойной палочки, используют системы биологического типирования, типирования с помощью моноспецифических типовых сывороток, бактериофагов и пиоцинов. Чаще всего применяют метод серотипирования, вследствие относительной простоты постановки реакции агглютинации на стекле, четкости получаемых результатов, воспроизводимости метода и возможности дифференциации штаммов по признаку принадлежности к определенному серологическому типу.
Существует несколько систем серогруппирования штаммов синегнойной палочки, предложенные H.Kleinmaier (1957), O.Sandvic (1960), E.Verder и J.Evans (1961), M.Veron (1961), T.Meitert (1964), B.Lanyi (1970), I.Habs (1975), Н.С.Акатовой и Н.Е.Смирновой (1976). Чаще всего используют Международную классификацию серотипирования, разработанную подкомитетом по Pseu-domonadaceae и родственными организациями Международного комитета по систематической бактериологии Международной ассоциации микробиологических обществ (IATS - International Antigenic Typing Scheme).
Серотипирование применяют для: 1) выявления наличия или отсутствия штаммов синегнойной палочки преобладающих сероваров; 2) обнаружения идентичности штаммов, выделенных от больных и из окружающей среды стационаров; 3) выявления доминирующих штаммов специфических сероваров в определенный период времени в конкретном лечебном учреждении.
Ранее в нашей стране применение серотипирующих сывороток для реакции агглютинации на стекле было доступно, поскольку наборы производились Днепропетровским институтом бакпрепаратов. В настоящее время данные диагностические наборы отсутствуют на отечественном рынке. Потребности рынка по производству серотипирующих сывороток обеспечивают такие известные фирмы как Difco, Bio Rad.
Установлено, что чаще всего на территории России циркулируют штаммы серогрупп Об (10-20-24 %), 03, 02 и 05 (10-20 %), 04 (45 %), 011 (12, 25, 42).
От того, насколько быстро будет осуществляться последовательное проведение всех этапов лабораторного исследования, во многом зависит как правильное и своевременное назначение терапии, а, следовательно, и исход заболевания, так и выявление эпидемически опасной ситуации в стационаре, требующей проведения профилактических мероприятий.
Характерной особенностью синегнойной палочки является ее природная резистентность в отношении большинства антибактериальных препаратов. Положение усугубляется развитием еще большей устойчивости, вследствие эмпирического применения антимикробных препаратов при решении вопросов лечения тяжелых больных
Невзирая на очевидные биологически детерминированные ограничения бактериологического метода исследования, предоставляющего диагностические заключения в сроки, зачастую несовместимые с требованиями клинической практики, его роль в разработке стратегии рациональной антибиотикоте-рапии, в широком смысле, остается решающей.
В тоже время, вопросы разработки альтернативных методов обнаружения патогенов, позволяющих в короткие сроки и достоверно установить этиологический фактор инфекционного процесса остаются открытыми. В качестве методов экспресс-анализа различных проб наиболее перспективными являются иммунодиагностические тесты, направленные на выявление как микробных клеток, так и их антигенов.
В качестве таких экспресс-методов были апробированы реакция непрямой гемагглютинации (6, 36) и иммуноферментный метод (5, 6, 21, 69).
Ряд исследователей предпринимали попытки конструирования имму-ноглобулиновых эритроцитарных диагностикумов, предназначенных для обнаружения антигенов P.aeruginosa (20). В качестве сенситина они использовали антитела к экзотоксину А P.aeruginosa. Чувствительность иммуноглобулиново-го эритроцитарного диагностикума обеспечивала выявление 1нг экзотоксина А в 1 мл. Однако невозможность использования РНГА в практической работе связана с отсутствием стандартизированного иммуноглобулинового эритроцитарного диагностикума.
К агглютинационным методам экспресс-диагностики синегнойной инфекции относятся также реакция латекс-агглютинации (РЛА) и коагглютинации (РКА). Уступая по чувствительности РНГА, эти методы имеют преимущество в скорости получения ответа: с их помощью можно в течение 3-5 минут с большой достоверностью идентифицировать культуру выделенного возбудителя инфекционного заболевания без использования дорогостоящего оборудования и реактивов.
Изучена возможность использования отечественных образцов монодисперсных полистироловых латексов в качестве носителей при изготовлении антительных диагностикумов, предназначенных для выявления водорастворимых антигенов слизи штаммов синегнойной палочки наиболее распространенных серотипов методом латекс-агглютинации. Показана серологическая специфичность таких реагентов (4).
Наиболее разработанным и высокочувствительным методом обнаружения антигенного материала синегнойной палочки является ИФА в различных его вариантах.
Иммуноферментный метод использовали с целью раннего выявления антигенов синегнойной палочки в жидких биологических субстратах. С его помощью определяли ЛПС восьми сероваров P.aeruginosa, к которым относятся 85 % штаммов данного вида микроорганизма. Сэндвич-вариант ИФА позволял выявлять ЛПС в количестве ОДнг/мл. При этом метод оказался высокоспеци- фичным и не давал перекрестных реакций с антигенами других видов микроорганизмов (94).
Эффективность применения ИФА подтверждена исследованиями, направленными на обнаружение одного из факторов патогенности P.aeruginosa -эластазы этого микроорганизма. Высокая чувствительность метода позволяла выявлять 0,01 мкг/мл эластазы (90).
Возможность использования различных вариантов ИФА была изучена при выявлении синегнойной палочки в образцах клинического материала. По данным ВбНт R. (120), чувствительность анализа составила 10-10 КОЕ в пробе, а специфичность подтверждена отсутствием перекрестных реакций с 11 штаммами гетерологичных видов микроорганизмов. Niederwohrmeir В. (112) описан вариант ИФА для быстрого обнаружения P.aeruginosa, воспроизведение которого занимало около пяти часов. В качестве твердой фазы в данном варианте ИФА были использованы полистироловые шарики с адсорбированными на них специфическими кроличьими IgG. При этом чувствительность метода составляла 104 КОЕ.
Высокая эффективность dot-варианта ИФА была продемонстрирована при использовании иммуноферментной тест-системы для выявления экзотоксина А P.aeruginosa при скрининге проб клинического материала. В качестве твердой фазы была использована нитроцеллюлозная мембрана. Установлено, что данный метод позволяет выявлять 5 нг экзотоксина А. С его помощью была выявлена способность 88,5 % клинических штаммов P.aeruginosa продуцировать экзотоксин А (10).
Разработаны две тест-системы, основанные на конкурентном варианте ИФА, предназначенные для диагностики гнойно-септических осложнений, обусловленных синегнойной палочкой и протеем. Показано, что повышение уровня антигена синегнойной палочки в первые трое суток развития осложнений и увеличение титров антител через семь суток свидетельствует об этиологической роли данного возбудителя при гнойно-септическом осложнении. Отмечена высокая корреляция результатов бактериологических и серологических методов диагностики (14).
Метод гибридизации in situ позволяет выявить бактерии в циркулирующих фагоцитах и идентифицировать вид микроорганизма. При септицемии циркулирующие полиморфноядерные нейтрофилы несут как жизнеспособные бактерии, так и метаболизированные бактериальные ДНК и РНК (в течение определенного промежутка времени). Поэтому данный метод диагностики значим для выявления большинства видов микроорганизмов (105).
Помимо иммунохимических тестов в последние годы в практическую работу постепенно внедряют молекулярно-биологические методы исследования, в частности полимеразную цепную реакцию (91,106).
Достаточно перспективно использование ПЦР для диагностики и эпидемиологического исследования образцов внешней среды. Чувствительность метода составляет 5-Ю м.к. в 10 мл воды или 0,1 пг ДНК P.aeruginosa (91).
Имеются данные об использовании ПЦР для обнаружения синегнойной палочки у больных с кистозным фиброзом, при содержании 10 м.к. в мокроте, загрязненной другими видами микроорганизмов, включая S.aureus, H.influenzae (106). Данный метод является высокочувствительным и специфичным на ранних стадиях колонизации легких P. aeruginosa.
Предложен быстрый метод лабораторной диагностики инфекций, вызываемых Pseudomonas aeruginosa, основанный на определении методом гель -хромотографии специфических метаболитов возбудителя. Авторами метода установлено, что обнаружение в исследуемых образцах или культуральной среде метилкетонов (2-нонанона или 2-ундеканона) и/или метилмеркаптана позволяет диагностировать синегнойную инфекцию (95).
Для раннего установления диагноза синегнойной инфекции апробированы варианты исследований, направленные на обнаружение не только специфичных антигенов, но и на выявление антител к ним.
Одним из недостатков в подобных опытах было использование не всегда достаточно очищенных антигенов, что приводило к выявлению ограниченного спектра специфических антител. Другим недостатком было отсутствие четкого критерия в понятии "условно-диагностический титр", поскольку имеются сообщения о выявлении антител к P.aeruginosa в сыворотках практически здоровых людей, что и создает трудности при интерпретации результатов (45, 57, 59). Обнаружение противомикробных антител в сыворотке крови может свидетельствовать и о предшествовавшем контакте с синегнойной палочкой. Следует заметить, что у больных с крайне тяжелым течением гнойно-воспалительных заболеваний не происходит увеличения титров антител к возбудителю. Отсутствие высокого титра антител может служить причиной ошибок при диагностике синегнойной инфекции. Petras Gy (117) экспериментально установил, что естественные антитела к P.aeruginosa у обследованных больных относились главным образом к классу IgM, в 10 % случаев - к IgG.
Так же, как и в опытах по обнаружению антигенного материала в исследуемых образцах, для установления антительного ответа на синегнойную палочку пригодны методы, с помощью которых можно быстро диагностировать синегнойную инфекцию до получения результатов бактериологического анализа. Такими методами являются ИФА, РНГА и метод иммуноблоттинга.
Наиболее простым и в то же время достаточно надежным и воспроизводимым методом определения антител является РНГА.
Большое количество работ по получению и применению поливалентного синегнойного эритроцитарного диагностикума в клинической практике было опубликовано сотрудниками института им. Н.Ф.Гамалеи под руководством д.м.н., профессора Антонины Федоровны Мороз. Ими были получены синег-нойные диагностикумы на основе антигенов слизи, липополисахарида и экзотоксина АР.aeruginosa. Оказалось, что одновременное определение активности антител к используемым антигенам, повышало эффективность серодиагностики синегнойной инфекции (6, 10). Оптимальной оказалась постановка реакции пассивной гемагглютинации с диагностикумом из ЭТА и смеси ЛПС штаммов, наиболее распространенных серогрупп возбудителя (24). В то же время использование липополисахаридных антигенов в реакции связывания комплемента (РСК) не увенчалось успехом из-за их выраженной антикомплементарной активности, в отличие от экстрактов разрушенных ультразвуком бактерий (126).
И.И. Олейник с соавторами (36) при исследовании парных сывороток от больных острой гнойной деструктивной пневмонией с помощью РНГА выявили значительное нарастание уровня антител к О-антигену P.aeruginosa. При параллельно проводившемся бактериологическом исследовании было отмечено совпадение большинства данных серологического обследования с бактериологическими высевами. Но дальнейшее исследование титров антител в динамике заболевания не совпадало с результатами бактериологического анализа. В ряде случаев наблюдающееся увеличение титров О-специфических антител сопровождалось отрицательными результатами бактериологического исследования. Авторы считают, что повышение уровня специфических антител является важнейшим диагностическим тестом, на основании которого допустимо назначение ранней рациональной антибиотикотерапии. Более того, по результатам РНГА можно не только быстро и достоверно установить этиологию инфекционного заболевания и/или имеющегося осложнения, но и в ряде случаев прогнозировать исход.
В качестве сенситинов (серологически активных компонентов) для создания эритроцитарного диагностикума целесообразно использовать антигены слизи P.aeruginosa, препараты липополисахарида клеточной стенки, протеазу, эластазу, эндотоксин и экзотоксин А. Источником антигенов должны служить штаммы тех сероваров данного вида микроорганизмов, которые наиболее часто выделяют от больных с гнойно-воспалительными заболеваниями.
Для обнаружения специфических антител к синегнойной палочке в сыворотке крови был использован ИФА, на основе препарата антигена слизи. С помощью него можно выявить специфические антитела у 76,6 % больных с на- гноительными заболеваниями легких синегнойной этиологии, с бактериологически подтвержденным позже диагнозом. Были выявлены достоверно более высокие титры антител к антигенам слизи синегнойной палочки по сравнению с уровнем антител у здоровых доноров, причем в 20 % случаев диагноз может быть установлен за 5-6 дней до его бактериологического подтверждения (22).
При определении уровня антител в сыворотках здоровых и больных, колонизированных или инфицированных P. aeruginosa с помощью ИФА, использовали препараты четырех очищенных экстрацеллюлярных белков синегнойной палочки (экзотоксина А, эластазы, щелочной протеазы и фосфолипазы С) (79).
Сравнительный анализ эффективности применения ИФА и РИГА выявил преимущества ИФА в связи с его более высокой чувствительностью - 84,6 % и специфичностью - 86,9 % (46).
Наряду с определением общего уровня антител методом ИФА для установления факта инфицирования синегнойной палочкой, проводили определение уровня IgA в сыворотке и мокроте (слюне) больных с хроническими заболеваниями дыхательных путей. Оказалось, что при диагностике респираторного инфицирования P.aeruginosa возможно выявление антисинегнойных IgA (113).
Изучение антительного ответа на септицемию, вызванную P.aeruginosa, проводили методом иммуноблоттинга. При этом было установлено, что у всех исследованных пациентов повышался уровень антител подклассов IgA или IgG, распознающих антигенную детерминанту с м.м. 35 кДа, которая тождественна пориновому белку F наружной мембраны. (103).
При сравнительном анализе преимуществ обнаружения антител к синегнойной палочке с помощью ИФА и вестерн-блотта, выявлено явное преимущество последнего, поскольку ИФА позволял выявлять сывороточные IgG против смеси растворимых антигенов, а вестерн-блотт - IgG против белков наружной мембраны (119).
Сравнительный анализ данных трех различных методов обнаружения антител к антигенам синегнойной палочки (ИФА-ЭТА, western - blott, ИФА - фосфолипаза-С), выявил преимущества ИФА-ЭТА, вследствии хорошей воспроизводимости результатов этого метода, получаемых иногда до момента бактериологического подтверждения (72).
С помощью иммуноэлектрофореза проведено изучение антительного ответа у больных с заболеваниями респираторного тракта и мочевыводящих путей (85). При определении антител к антигену, общему для целого ряда микроорганизмов (выделен D.Sompolinsky в 1980 году), показан значительный процент ложноположительных результатов (около 33,0 %). Эти данные позволили авторам сделать вывод о непригодности использования общего антигена при серодиагностике синегнойной инфекции.
Несмотря на большое количество исследований, направленных на разработку и совершенствование диагностических серологических и молекулярно-биологических методов обнаружения синегнойной палочки, ни один из упомянутых выше не внедрен в практическое здравоохранение. До сих пор еще нет однозначного ответа на вопрос, какому из методов следует отдавать предпочтение при диагностике той или иной формы синегнойной инфекции. Разработка диагностических тест-систем, направленных на обнаружение P.aeruginosa или на определение уровня специфических антител к возбудителю связана с рядом трудностей. Прежде всего - это отсутствие стандартного, стабильного поликло-нального сырья для изготовления иммунодиагностических препаратов. При его получении должны быть созданы идентичные условия иммунизации животных в течение достаточно длительных промежутков времени. В группах животных-продуцентов специфических сывороток проявляются индивидуальные особенности низкой продукции иммуноглобулинов у отдельных особей, что требует выбраковки части животных. Кроме того, отсутствуют стандарты очищенных коммерческих антигенов и наборы высокоактивных референс-сывороток.
Эти факторы активизируют поиск новых путей решения проблемы, в частности для использования сырья нового типа, получение и производство которого было бы доступным, относительно недорогим, при обязательном обеспе- чении стабильности всех свойств получаемого продукта. Всем этим требованиям удовлетворяют моноклональные антитела, применение которых снимет ряд проблем, постоянно присутствующих в случае использования поликлональных иммуноглобулинов.
Лабораторная диагностика синегнойной инфекции
Синегнойная палочка, с 70-х годов, стала одним из ведущих возбудителей как местных, так и генерализованных гнойно-воспалительных процессов (32, 34, 40, 49, 53). Гнойно-септические заболевания, обусловленные этим возбудителем, проявляются наиболее часто в ожоговых, онкологических, пульмонологических, урологических клиниках и в отделениях реанимации (19, 23, 41, 56,61,64,131).
Установлено, что риск заражения больных в стационаре очень высок и пропорционален продолжительности их пребывания в клинике и частоте использования инструментальных вмешательств - катетеризации, цистоскопии, трахеостомы, внутривенных манипуляций (23, 49, 56, 61).
Вопросы совершенствования методов экспресс обнаружения P.aerugi-nosa во внешней среде стационаров и ранней диагностики синегнойной инфекции привлекают все большее внимание специалистов служб надзора за внутрибольничными инфекциями.
На сегодняшний день лабораторные исследования, направленные на раннее обнаружение и идентификацию синегнойной палочки в пробах с объектов внешней среды стационаров и патологическом материале от больных, проводят в учреждениях службы Госсанэпиднадзора и в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений, согласно ряду инструктивно-методических документов, утвержденных МЗ РФ (30, 35, 37).
Основным методом лабораторной диагностики синегнойной инфекции по-прежнему остается бактериологическое исследование.
При проведении исследования по унифицированной схеме (30, 35), применяемой для своевременного решения вопросов профилактики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний и осложнений у стационарных больных, данные о родовой принадлежности изолируемых микроорганизмов могут быть получены через 1-2 суток от момента начала исследования. Однако идентификация выделенной культуры бактерий завершается, как правило, только через трое суток. Применение для первичного посева клинического материала селективных сред с целью выделения синегнойной палочки, позволяет сократить время, необходимое для идентификации выделенной культуры, до двух суток. При наличии характерного роста на селективной среде и морфологии колоний, сине-зеленого пигмента, положительного цитохромоксидазного теста и специфического запаха жасмина или земляничного мыла возможна идентификация 75 % выделяемых культур синегнойной палочки. В то же время, в случае преобладания в условиях конкретного стационара атипичных штаммов P. aeruginosa, быстрая идентификация данного вида микроорганизмов бывает затруднена. Время исследования удлиняется ввиду необходимости постановки большего числа тестов, подтверждающих как видовую принадлежность изолятов, так и обеспечивающих дифференциацию P.aeruginosa от других видов псевдомонад.
Анализ исследований целого ряда авторов подтверждают факт неуклонного роста числа беспигментных штаммов P.aeruginosa (7, 15, 49, 55). Определенные трудности возникают и при обнаружении и идентификации безжгутиковых, меланиногенных, апиоцианиногенных вариантов P.aeruginosa (7, 9, 49).
В повседневной бактериологической работе целенаправленный поиск синегнойной палочки проводят по схемам выявления группы грамотрицатель-ных неферментирующих бактерий (38), бактериологической диагностики синегнойной инфекции или идентификации беспигментных штаммов (30). Во всех этих случаях выполнение требуемых этапов бактериологического исследования материала требует не менее трех суток.
Штаммы микроорганизмов, питательные среды
Использовали 14 типовых штаммов синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa (Н-1, Н-2, Н-3, Н-4, Н-5, Н-6, Н-7, Н-8, Н-9, Н-10, Н-11, Н-12 по классификации Habs), РАО 1, 4000, а также 16 штаммов непатогенных псевдомонад (В. cepacia 1934, 8235, 8236, 8240, P. fluorescens 540, 1602, 2234, 4125, Р. putida 1608, 2300, P. alcaligenes 4138, P. pseudoalcaligenes BKMB 1300, P. stutzeri 4136, P. fragii 4002, P. liquefaciens BKMB 549, P. ovalis BKMB 899) из коллекции лаборатории поддержания живых культур Волгоградского НИПЧИ. Псевдомонады выращивали на плотных питательных средах: МПА с 5 % глицерина, рН 6,8 при 37 С в течение 1-2 сут и на триптиказо-соевом агаре производства (Difco) с добавлением 5 % глицерина.
Клинические штаммы из образцов проб мочи, отделяемого раневых поверхностей, стула пациентов с дисбактериозами выделяли и идентифицировали в соответствии с действующими инструктивно-методическими документами (29, 38).
В качестве источника иммунных лимфоцитов, подкормочных клеток и резервуара для наращивания клеток гибридом-продуцентов МкАт использовали мышей линии BALB/c обоего пола массой 14-16 г. Иммунную сыворотку к P.aeruginosa получали иммунизацией кроликов массой 2,5 -3 кг (табл.1). При моделировании синегнойного сепсиса использовании белых крыс.
Животных получали из питомника экспериментальных биомоделей Волгоградского НИПЧИ (табл.1).
В качестве злокачественного партнера при гибридизации использовали клетки мышиных миелом P3X63-Ag8.653 и Sp 2/0, полученные из "Банка клеточных культур" института цитологии Академии наук Российской Федерации (г. Санкт-Петербург).
Для иммунизации животных при получении иммунных спленоцитов у мышей и аятисыворотки у кроликов, а также для сенсибилизации планшетов для ИФА и приготовления референтного антигена в иммуноблоттинге использовали клетки псевдомонад, обеззараженные физическими и химическими методами, ультразвуковые дезинтеграты клеток, водно-солевые экстракты и липополисахариды P.aeruginosa.
Клеточные взвеси микроорганизмов, приготовленные в стерильном 0,15 М растворе NaCl, обеззараживали несколькими способами: 1) обработкой охлажденным до - 20 С ацетоном в соотношении 1: 4 (v/v) в течение 48 ч; 2) 1 % нейтральным формалином в течение 1 сут; 3) автоклавированием: 120 С, 30 мин. Контроль стерильности обеззараженных взвесей микробов осуществляли по стандартным методикам.
УЗ-дезинтеграцию клеток проводили на аппарате "Labsonic" (Германия) при 150 Вт с частотой 20 кГц в течение 2 мин трехкратно с 15-минутными интервалами. Во избежание перегрева взвеси микробных клеток сосуд, её содержащий, помещали в ледяную баню на весь период дезинтеграции клеток.
ВСЭ готовили из убитых ацетоном и высушенных клеток синегнойной палочки штаммов Н-2 и Н-3. Для этого к 1 г сухих клеток добавляли 60 мл 0,15 М раствора NaCl. Смесь перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре. Через 24 ч суспензию подвергали ультразвуковой дезинтеграции в течение 2 мин при 150 Вт и частоте 20 кГц на аппарате "Labsonic" (Германия). Фрагменты разрушенных клеток осаждали центрифугированием биомассы при 15000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость, содержащую смесь водорастворимых антигенов, использовали в работе как ВСЭ. Содержание белка в образцах ВСЭ определяли спектрофотометрически при 280 нм.
ЛПС получали из клеток P.aeruginosa Н-2, Н-4, Н-5, Н-6, Н-11, РАО 1 методом водно-фенольной экстракции (2). Определение концентрации белка проводили по Лоури (100), полисахаридов - по Дюбо (68), липидов - методом LazaraffVanN. (99).
Оптимизация схем стимуляции В - лимфоцитов
Для получения гибридом продуцентов МкАт различной специфичности к антигенам, локализованным на поверхности микробной клетки P. aeruginosa, а также растворимых биополимеров данного микроорганизма, были проведены две серии опытов. В первой из них (опыты 1-4) в качестве иммуногена применяли УЗ-дезинтеграты P.aeruginosa сероваров Н-1, Н-2 или ВСЭ P.aeruginosa серовара Н-2, а во второй серии (опыты 5-8) - ЛПС P.aeruginosa сероваров Н-2, Н-6,Н-11.
Сводные данные об условиях проведения опытов по гибридизации клеточных линий представлены в таблице 3.
Установлено, что последовательное введение (п/к, в/бр, в/с) УЗ-дезинтегратов клеток P.aeruginosa Н-1 или Н-2 в суммарной дозе 1,6-109 м.к./мышь согласно разработанной схеме, обеспечивает эффективную стимуляцию спленоцитов мыши-донора (опыты 1-2). Относительно более высокие показатели клонообразования в опыте 1 в течение срока наблюдения за растущими культурами были обусловлены, надо полагать, тем, что при гибридизации клеток в первом опыте использовалось большее число спленоцитов по сравнению со вторым опытом (30:1 и 12:1 соответственно). В то же время доля культур, сохранивших Ат-продукцию к 25 дню культивирования отличалась незначительно, что свидетельствует о нецелесообразности увеличения отношения спленоциты : миелома при получении гибридом.
Как в первом, так и во втором опыте, тестирование первичных гибридных культур в течение 3 мес привело к отбору относительно небольшого числа клонов-продуцентов МкАт со стабильными показателями Ат-продукции и ростовых свойств.
Увеличение Аг нагрузки и удлинение сроков иммунизации мышей - доноров приводило к угнетению продукции гуморальных антител мышами-донорами спленоцитов (опыт 3). Однако после включения в схему иммунизации мышей смеси растворимых антигенов при проведении бустирующей инъекции (опыт 4) была зарегистрирована более эффективная гибридизация клеточных линий с увеличением показателя образования Ат-продуцентов до 7 % (в отличие от 3,7% в опыте 3). Результаты предварительных опытов показали, что при получении гибридом продуцентов МкАт к биополимерам, расположенным как на поверхности клеточной стенки, так и содержащихся в водо-растворимых комплексах, изолированных из микробных клеток этого микроорганизма, необходимо: 1) использовать схемы иммунизации мышей-доноров спленоцитов, не допускающие увеличения общей антигенной нагрузки свыше 2,6-109 м.к./мышь; 2) не использовать сроки иммунизации мышей свыше 1,5-2 мес; 3) при выборе варианта бустирующей инъекции отдавать предпочтение внутриселезеночному введению антигена за 3 сут до гибридизации клеток, при получении МкАт к растворимым и клеточным Аг P.aeruginosa.
Вторая серия опытов (опыты 5-9) была проведена с целью получения МкАт к эпитопам, локализованным на ЛПС P.aeruginosa сероваров Н-2, Н-6, Н-11. Учитывая данные о способности антигенов этого типа угнетать гуморальное звено иммунитета, иммунизировали животных по схемам, предусматривающим дробное введение микродоз ЛПС (0,13-0,18 мкг в расчете на показатели полисахарида в ЛПС), в течение короткого промежутка времени. В опыте 5, несмотря на высокие показатели эффективности образования Ат-продуцентов, отмечена выраженная нестабильность признака Ат- продукции полученными гибридными культурами. В течение первых 3 мес культивирования первичных культур, несмотря на своевременно проведенные этапы их клонирования, отмечена утрата признака Ат-продукции большинством гибридом. Стабилизации всех свойств удалось достичь лишь у 2-х клонов-продуцентов МкАт (5D8 и 5D10).
Специфическая активность моноклинальные антитела
В ИФА на твердой фазе сенсибилизировали ВСЭ P.aeruginosa сероваров Н - 2 и Н - 3, УЗД P.aeruginosa сероваров Н-1,Н-2, Н-6, ЛПС P.aeruginosa сероваров Н - 2, Н-6, Н-11в концентрациях, предварительно установленных для каждой конкретной серии антигенного препарата. Условия проведения анализа в части температурных режимов, экспозиции ингредиентов в лунках планшетов, состава буферных растворов на различных этапах ИФА соответствовали стандартным требованиям. Первичной характеристикой МкАт, изолированных из культуральных жидкостей и асцитов, являлись показатели минимальных концентраций антител, взаимодействующих с тем или иным антигеном. Результаты ИФА (табл. 5) свидетельствовали о том, что только МкАт к ЛПС взаимодействуют с данным типом Аг, тогда как все остальные типы МкАт обладали активностью в отношении ВСЭ и УЗД микробных клеток P.aerugi-nosa.
Изучение свойств 12 типов МкАт, накопленных in vitro и in vivo и изолированных из среды выращивания гибридом и асцитических жидкостей, позволило установить, что все они являлись иммуноглобулинами класса IgG. Типирование МкАт показало, что 2 варианта МкАт относятся к изотипу IgG3 (1В7 и 4С11), 2 варианта - к IgGi (H-2/G3, 4G4) и 8 вариантов МкАт к IgG2b (2А2, 4Е11, 4G5, 4G8, 4G11, 5D8, 5D10, 7G4).
Определение изотипа МкАт служило основанием для предварительного прогноза о возможности использования того или иного МкАт в различных иммунологических методах исследования и особенностях методических приемов при создании на их основе диагностических препаратов (77).
Для характеристики спектра специфической активности МкАт в отношении эпитопов, экспонированных на поверхности микробных клеток типовых штаммов Raeruginosa, применяли НИФлА (табл. 6).
Получение и оценка свойств иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих моноклональных и поликло-нальных к антигенам P.aeruginosa
Экспериментальные образцы иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих противосинегнойных моноклинальных готовили на основе 11 типов МкАт. Исключение составили МкАт 7G4, которые, по данным НИФлА (табл. 6), не взаимодействовали с поверхностно локализованными биополимерами КС типовых штаммов P.aeruginosa.
Специфические иммуноглобулины метили флуоресцеинизотиоцианатом с учетом свойств поли- и моноклональных белков. Поликлональные антитела конъюгировали с ФИТЦ при рН 9,5 в соответствии с общепринятым способом (102). МкАт, будучи менее резистентными к физико-химическим воздействиям, частично теряли иммунологическую активность в случае проведения метки при таких значениях рН. Поэтому при проведении метки МкАт рН реагентной смеси поддерживали на уровне не выше 8,5. Изменение условий конъюгирования флуорохрома с белком МкАт не оказывало отрицательного влияния на специфическую активность меченых ФИТЦ антител.
После завершения этапа очистки конъюгатов от свободного флуорохрома и несвязавшихся с ним иммуноглобулинов экспериментальные образцы диагностических препаратов оценивали по параметрам качества в соответствии с требованиями, предъявляемыми к МИБП, изготовленным на основе поли- и мо-ноклональных антител.
Параметры качества конъюгатов иммуноглобулинов с флуорохромом и спектры специфической активности флуоресцирующих антител суммированы в таблицах 8 и 9.
Все образцы моноклинальных флуоресцирующих антител обладали более высокой активностью в сравнении с поликлональными аналогами. Показатели красящего титра при взаимодействии с микробными клетками типовых штаммов P. aeruginosa свидетельствовали о различной плотности эпитопов, гомологичных каждому из вариантов МкАт. Наиболее широкий спектр специфической активности зарегистрирован у препаратов, приготовленных на основе МкАт H-2/G3 и МкАт 5D10, а наиболее высокие показатели удельной активности - у препарата МкАт 1В7.
В отличие от моноклинальных препаратов поликлональные аналоги обладали более низкими показателями активности. Существенным недостатком этих препаратов являлось то, что спектры специфической активности различных серий конъюгатов не являлись величиной постоянной. Эти данные подтверждали регистрируемые многими исследователями недостатки работы с поликлональными иммуноглобулинами, варьирующим по составу специфических иммуноглобулинов в индивидуальных пробах сыворотки экспериментальных животных.
