Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Характеристика бактерий рода Salmonella 11
1.1. История открытия 11
1.2. Классификация 12
1.3. Биологическая характеристика сальмонелл 15
1.4. Антигенная структура и серологическая идентификация 16
1.5. Вирулентность 18
Глава 2. Внутривидовое типирование 23
2.1. Фенотипические методы внутривидового типирования 24
2.1.1. Биотипирование 24
2.1.2. Определение антибиотикограммы 26
2.1.3. Фаготипирование 30
2.2. Генотипические методы внутривидового типирования 33
2.2.1. Плазмидный анализ 33
2.2.2. Электрофорез в пульсирующем поле 36
2.2.3. Риботипирование 38
2.2.4. ПЦР-генетическое типирование 41
Часть 2. Собственные исследования. 44
Глава 3. Материалы и методы 44
3.1. Материалы исследования 44
3.2. Методы исследования 45
Глава 4. Фенотипическая и плазмидная характеристика S. enteritidis в Приморском крае 56
4.1. Плазмидная характеристика S. enteritidis 57
4.1.1. Плазмидная характеристика популяции S. enteritidis в различные годы наблюдения 61
4.2. Фенотипическая характеристика плазмидоваров S. enteritidis 65
4.2.1. Биохимическая активность штаммов S. enteritidis 65
4.2.2. Антибиотикорезистентность штаммов S. enteritidis 67
4.2.2.1. R-плазмиды штаммов S. enteritidis 70
4.3. Характеристика штаммов S. enteritidis, не содержащих плазмиду вирулентности 71
Глава 5. Фенотипическая и плазмидная характеристика S. typhimurium в Приморском крае 78
5.1. Плазмидная характеристика S. typhimurium 78
5.1.2. Структурная характеристика плазмиды 60 MDa штаммов S. typhimurium, выделенных при зоонозном типе инфекции 84
5.1.3. Функциональная характеристика плазмиды 60 MDa штаммов S. typhimurium, выделенных при зоонозном типе инфекции 88
5.2. Фенотипическая характеристика S. typhimurium 92
5.2.1. Биохимическая активность штаммов S. typhimurium 92
5.2.2. Вирулентность штаммов S. typhimurium, возбудителей зоонозного и нозокомиального сальмонеллеза 95
5.2.3. Антибиотикорезистентность штаммов S. typhimurium 97
5.2.3.1. R-плазмиды штаммов S. typhimurium 101
Глава 6. Фенотипическая и плазмидная характеристика штаммов редковыявляемых сероваров сальмонелл в Приморском крае 106
6.1. Характеристика штаммов редко выявляемых сероваров сальмонелл, выделенных в единичном экземпляре 106
6.2. Характеристика штаммов редко выявляемых сероваров сальмонелл, представленных несколькими культурами 109
Глава 7. Микробиологический молекулярно-генетический мониторинг за возбудителями сальмонеллеза 123
7.1. Мониторинг генетического родства штаммов S. enteritidis, на основе рестрикционного анализа криптических плазмид с малой молекулярной массой 123
7.2. Мониторинг этиологической значимости плазмидоваров S. enteritidis 127
7.3. Установление источников и факторов передачи возбудителей инфекции в процессе микробиологического мониторинга на примере редко выявляемых сероваров сальмонелл 132
7.4. Использование плазмидных характеристик в организации микробиологического мониторинга за сальмонеллезами 137
Заключение 139
Выводы 148
Список литературы 150
- Определение антибиотикограммы
- Плазмидная характеристика популяции S. enteritidis в различные годы наблюдения
- Антибиотикорезистентность штаммов S. typhimurium
- Мониторинг этиологической значимости плазмидоваров S. enteritidis
Определение антибиотикограммы
Устойчивость сальмонелл к антибиотикам определяется несколькими механизмами. Значительная часть генов устойчивости к антибиотикам, выявленных у грамотрицательных бактерий семейства Enterobacteriaceae, имеет кассетную организацию. Кассеты с генами резистентности к антибиотикам являются самыми маленькими по размеру мобильными генетическими элементами, содержащими один ген и короткую последовательность, выполняющую функцию рекомбинационного сайта. Для большинства антибиотиков найдено несколько весьма различных генов устойчивости, и в некоторых случаях механизмы устойчивости очень различаются. Например, устойчивость к хлорамфениколу представлена генами, ответственными за ацетилирование антибиотика (гены catB) и выброс антибиотика из клеток (ген cmlA); устойчивость к аминогликозидным антибиотикам — генами модификации антибиотика как ацетилированием (аасА и аасС), так и аденилированием (aadA и aadB). Р-лактамазы, кодируемые кассетами, попадают в 3 различных группы генов - группа А (гены ЫаР), группа В металло-Р-лактамаз (Ыашр) и группа D (гены оха) [38]. Генные кассеты антибиотикорезистентности часто расположены в мобильных элементах ДНК, таких, как например, плазмиды и транспозоны.
Формирование множественной лекарственной устойчивости бактерий рода Salmonella обусловлено наличием у штаммов R-плазмид. Основной механизм лекарственной устойчивости, сообщаемой бактериям R-плазмидами, - приобретение клетками: способности синтезировать энзимы, разрушающие лекарственные препараты [61, 83]. Широкое распространение множественной лекарственной устойчивости, детерминированной; R-плазмидами, обусловлено в основном селективными преимуществами, связанными с устойчивостью одновременно ко многим антибактериальным препаратам, используемым в клинической практике, а так же со способностью R-плазмид передаваться посредством; конъюгации между бактериями, принадлежащими к разным типам, видам, родам и даже семействам [ 103].
R-плазмиды могут состоять из двух активных компонентов: детерминант резистентности (г), и фактора переноса (tra), определяющего способность бактерий к конъюгации. Коньюгативные R-плазмиды имеют достаточно большую молекулярную массу, малокопийные, со строгим контролем репликации. Неконъюгативные, как правило, с небольшой молекулярной массой, многокопийные, с ослабленным контролем репликации. Информация об устойчивости к антибиотикам, химиопрепаратам, солям тяжелых металлов, может содержаться в транспозонах, входящих в состав R-плазмид. Значимость R-плазмид принято сводить к формированию устойчивых форм микроорганизмов. Вместе с тем, кроме устойчивости к антибиотикам R-плазмиды способствуют распространению ряда мигрирующих элементов (IS, Тп)[15].
В целом, наличие R-плазмид более характерно для штаммов сальмонелл, вызывающих госпитальный. сальмонеллез, характеризующийся длительным, волнообразным. течением и антропонозным типом эпидемического процесса.
Эти штаммы получили-название «госпитальных штаммов». На большинстве территорий России сероваром, вызывающим госпитальный сальмонеллез, является1 S. typhimurium. Такие штаммы обладают конъюгативной R плазмидой; с молекулярной массой около 90 MDa t [ 1, 2, 4, 3; 5,. 6]. Напротив, сальмонеллы - возбудители зоонозного сальмонеллеза, значительно реже содержат R-плазмиды. Они? являются, как правило, антибиотикочувствительными, а их резистентность чаще связана с хромосомными генами [248]1.
Кроме устойчивости сальмонелл, обусловленной. R-плазмидами, к таким антибиотикам, как хлорамфеникол; тетрациклин [174, 175], канамицищ ампициллин [189; 191,. 244], стрептомицин [193] и гентамицин [215]j в, последние годы доказана устойчивость сальмонелл к фторхинолонам [165, 182] и цефалоспоринам третьего поколения, связанная с: плазмид-кодируемыми Р-лактамазами расширенного спектра [143, 147, 243., 262].
В начале 90-х годов появились первые сообщения о полирезистентных штаммах S. typhimurium; фаготипа DT104 зоонозного происхождения. Штаммы S. typhimurium этого фаготипа содержали единственную плазмиду приблизительно 60 MDa; которая; не являлась плазмидой резистентности.
Устойчивость, к антибиотикам S; typhimurium DTI04 R-типа ACSSuT (ampicillin, chloramphenicol, streptomycin, sulphonamides и tetracyclines) носит хромосомный характер [249].
Устойчивость к антибиотикам многих сероваров рода Salmonella увеличивается из года в год. Эпидемия, вызванная S. typhis устойчивой к хлорамфениколу, впервые была зарегистрирована в 1970 году в Англии [226]. Однако, в; 1995 г. уже 34 % штаммов S. typhi, изолированных в Великобритании являлись полирезистентными. С этого: времени прогрессирующая; резистентность к ампициллину, хлорамфениколу, стрептомицину, тетрациклину и триметаприму у многих штаммов сальмонелл отмечалась широко в мире [226]; В Европе и нескольких регионах Среднего Востока в 80-годах при вспышках энтерита выделены штаммы S. wien, устойчивые к ампициллину, стрептомицину,, гентамицину и тобрамицину [205, 261]; В? США доля устойчивых к антимикробным препаратам: штаммов сальмонелл выросла с 17 % в конце 1970-х до 31 % в конце 1980-х г.г. [196].
Среди "госпитальных" штаммов S L typhimurium чаще всего была; распространена устойчивость к хлорамфениколу, тетрациклину, стрептомицину, канамицину т ампициллину с: одновременной резистентностью к нескольким препаратам (от 2 до 10). У полирезистентных штаммов выявлена способность к коньюгативному переносу маркеров? резистентности. Так, конъюгативный перенос резистентности к ампициллину выявлен у 68;% штаммов, к карбенициллину — у 53 %, стрептомицину - у 34 %, хлорамфениколу - у 26 % т тетрациклину - у 25 %. MIC ампициллина, хлорамфеникола, тетрациклина, канамицина и; гентамицина для штаммов»S. typhimurium; выделенных на территории CCCPj превышала 128-256 мкг/мл [71].
Причины формирования антибиотикорезистентности у сальмонелл связывают с повсеместным и не всегда оправданным применением антимикробных препаратов в медицине и ветеринарии [77]. В США широко используется гентамицин в качестве пищевой добавки в животноводстве и, особенно, в птицеводстве. Исследованиями было установлено, что устойчивость к гентамицину среди сероваров, связанных с домашней птицей, была шире (5,4%), чем среди других сероваров сальмонелл (1,8%, рО.01). Распространение устойчивости к гентамицину среди сероваров, связанных с домашней птицей, варьировала для различных сероваров, от 19% (S. heidelberg) до 4% (S. enteritidis). Отмечается, что в Северной Европе, где гентамицин не используется в птицеводстве, устойчивые к нему штаммы сальмонелл встречаются реже [163, 204].
Плазмидная характеристика популяции S. enteritidis в различные годы наблюдения
Анализ выделения штаммов различных плазмидоваров S. enteritidis выявил неравномерность их распределения по годам. Как видно из табл. 6, этиологическая значимость отдельных плазмидоваров варьировала. Так в 1995 г. доля штаммов плазмидовара 38 MDa составляла 49,1 % от всех исследованных штаммов. В 1996 и 1997 г.г. этиологическая значимость данного плазмидовара динамически снизилась до 26,0 %. В 1998 г. она несколько поднялась, а в 1999 г. упала до 13,2 %, перестав играть важную роль в этиологии болезни. Однако в 2000 г. доля штаммов этого плазмидовара; вновь увеличилась до 20,4 % (различия достоверны, р 0,0\). Динамики этиологической значимости других плазмидоваров S. enteritidis существенно отличаются от предыдущей. Значимость плазмидовара 38 : 1,4 MDa на протяжении этого периода неуклонно возрастала, достигнув к 1999 г. 55,1! %, но в 2000 г. роль этого плазмидовара несколько уменьшилась (различия достоверны, р 0,001). Штаммы плазмидоваров 38:2,3 MDa и 3 8 : 2,8 MDa играли значительно меньшую роль в этиологии сальмонеллеза; которая ежегодно проявлялась примерно] одинаковыми показателями. Кроме того, в 1999 г. не выделили ни одной культуры от людей с плазмидным спектром 38 : 2,8 MDa, хотя из пищевых продуктов его продолжали выделять (4 штамма). Можно сказать о его замещении в этиологии спорадической заболеваемости плазмидоваром; 38 : 2,6 MDa, вызвавшими вспышку сальмонеллеза в 1998 г. в Октябрьском районе, и продолжающем давать небольшой процент спорадической заболеваемости. Штамм плазмидовара 38 : 4,2 MDa впервые -был выделен. в 1997 г. и с тех пор доля штаммов этого плазмидовара в этиологии сальмонеллеза динамически увеличивалась, достигнув ВІ 2000 г. 5,8 %. Доля других основных плазмидоваров была небольшой и не превышала 3,5 %.
Большинство редко выявляемых плазмидоваров представлено одним-двумя штаммами микроба и изолировались они, в основном, в течение одного года (табл. 7). Так в 1995 г. дополнительно выявлено семь новых плазмидоваров, в 1996 г.-6, в 1997 г.-8, в 1998-9, в 1999 и 2000т.г. - 12 и 7 плазмидоваров: соответственно. Только? семь плазмидоваров выделялись несколько лет-70: 38 MDa (в 1995 и 1998г.г.),38 : 2,3 : 1,4 MDa и 2,3 : 1,4 MDa (1996 и 1999т.г.), 38 : 30 : 2,3 MDa и 38 : 2,6 : 1,4 MDa (в 1997 и 1999 г.г.), 50 : 38MDa(1998 и 1999 г.г.) и 50 : 38 : 2,3 MDa (1999 и 2000т.г.). Наибольшее количество штаммов объединяли плазмидовары 38 : 2,3 : 1,4 MDa, 38 : 30 : 2,3 MDa, 50 : 38 MDa, 38 : 1,9 MDa, 38 : 2,2 MDa и 38 : 26 : 2,3 MDa - от 4 до 11 штаммов.
Таким образом, гетерогенность популяции S. enteritidis, обусловлена наличием основных и редко выявляемых плазмидоваров микроба, этиологическая значимость которых варьирует по годам. Популяция S. enteritidis является достаточно стабильной, за счет наличия в ней доминирующих плазмидоваров, выделяющихся ежегодно и объединяющих 83 % всех исследованных штаммов. В процессе наблюдения отдельные плазмидные варианты микроба могут исчезать и на смену им появляться другие, то есть популяции свойственна изменчивость ее плазмидоварнои структуры. Степень гетерогенности популяции S. enteritidis определяется количеством выявленных плазмидоваров микроба - наиболее гетерогенна она была в 1999 г., когда популяция была представлена 11 основными и 17 редко выявляемыми плазмидоварами и наименее гетерогенна в 1996 г. (7 основных и 6 редко выявляемых плазмидоваров).
Антибиотикорезистентность штаммов S. typhimurium
Широко известен факт множественной устойчивости к антимикробным препаратам госпитальных штаммов [4, 6, 7, 10, 12, 13, 14]. Нами было проведено сравнительное изучение антибиотикорезистентности штаммов разных плазмидоваров выделенных при зоонозном и нозокомиальном сальмонеллезе, представленных в табл. 16. Для изучения чувствительности к антибиотикам мы воспользовались набором из 27 антимикробных препаратов, принадлежащих к группам пенициллинов, цефалоспоринов первого, второго и третьего поколений, аминогликозидам, тетрациклинам, фторхинолонам, а также полимиксин М, хлорамфеникол, фурадонин, фурагин и рифампицин. Все исследованные культуры оказались устойчивыми к бензилпенициллину, фурагину, фурадонину, рифампицину.
Госпитальные штаммы разных плазмидоваров характеризовались устойчивостью к широкому спектру антибиотиков (табл. 19). По степени антибиотикорезистентности госпитальные штаммы разделены на три группы. В первую вошли все штаммы доминирующего плазмидовара 80 : 40 : 4,8 MDa, которые оказались резистентными к 19 из 27 антибиотикам. Ко второй группе относились все штаммы плазмидоваров 80 : 50 : 40 : 4,8 MDa, 80 : 60 : 40 : 4,8 MDa, 80 : 40 : 30 : 4,8 MDa и 70 : 40 : 4,8 MDa, которые также были устойчивы к ампициллинам,. цефалоспоринам (отличались от предыдущих лишь чувствительностью к цефуроксиму), хлорамфениколу, тетрациклинам, и к отдельным аминогликозидам. Штаммы плазмидоваров 80 : 40 MDa, 80 MDa и 80 : 7,0 : 4,8 MDa оказались чувствительными к цефалоспоринам (цефазолину, цефуроксиму, цефокситину, цефотаксиму, цефтриаксону, цефоперазону, цефтазидиму, цефалексину, цефаклору и цефиксиму) и нами были отнесены в третью группу устойчивости.
Минимальная ингибирующая концентрация (MIC) для госпитальных штаммов S. typhimurium определена к четырем антибиотикам (Ар, Cm, Тс, Sm) у 15 штаммов: плазмидовара 80 : 40. : 4,8 MDa и двух штаммов плазмидоваров 80 : 50 : 40 : 4,8 MDa и 80 : 60 : 40 : 4,8 MDa, выделенных во время внутрибольничной вспышки в г. Находка. Минимальная ингибирующая концентрация ампициллина для всех штаммов составила 500 мкг/мл. MIK остальных антибиотиков (хлорамфеникола, тетрациклина и стрептомицина), составила для каждого соответственно 256; 64 и 64 мкг/мл.
Антибиотикорезистентность штаммов г S; typhimurium, выделенных при зоонозном сальмонеллезе, представлена в таблице 20. Как видно из табл. 20, большинство! из этих штаммов, в основном, чувствительны, за; некоторым исключением, ко всем исследованным антибиотикам. Из 53 штаммов, относящихся к 19 плазмидоварам резистентными к 3-4 антибиотикам оказались 10 штаммов (18,8 % всех исследованных культур), принадлежащих к 7 плазмидоварам. К семи антибиотикам оказался устойчивым штамм; плазмидовара 30 : 2,3 MDa. Существенные отличия в антибиотикорезистентностиі выявлены лишь у штаммов плазмидовара 60 MDa, обладающих рестрикционным профилем; типа В. Данные штаммы оказались устойчивыми; к пенициллинам, ряду цефалоспоринов и аминогликозидам (к 18 из 27 антибиотикам).
Исходя из вышеизложенного, можно сделать, вывод о том, что все госпитальные штаммы обладают полирезистентностью. Штаммы, выделенные при зоонозном типе инфекции, в основном чувствительны к антибактериальным препаратам, однако также могут обладать множественной. резистентностью. Следовательно, определение антибиотикорезистентности, хотя и является важным эпидемиологическим критерием, однако, возможности метода для дифференциации штаммов, выделенных при зоонозном и нозокомиальном сальмонеллезе, ограничены.
Мониторинг этиологической значимости плазмидоваров S. enteritidis
Существование в структуре популяции S. enteritidis в Приморском крае трех доминирующих плазмидоваров, маркированных плазмидами 38 MD; 38 : 1,4 MDa и 38 : 2,3 MDa, играющих основную роль в этиологии инфекции, поставило вопрос о мониторинге их значимости в развитии if болезни на протяжении всего периода наших наблюдений за микробом. На рис. 16 представлены результаты изучения ежегодной этиологической значимости в процентах данных доминирующих плазмидоваров S. enteritidis.
Обращает на себя внимание вариабельность их ежегодной этиологической роли. В период с 1995 по 1999 год значимость плазмидовара 38 MDa снизилась с 49,1±3,0 % до 13,2± 1,6 % (различия достоверны, р 0,001).
Однако в 2000 г. этиологическая значимость этого плазмидовара выросла до 20,3±1,8 % (различия достоверны, р 0,01). Напротив, значимость штаммов: плазмидовара 38 : 1,4 MDa на протяжении этого периода неуклонно возрастала с 30,06±2,8 % в 1995 г. до 55,1±2,3 % в 1999 г. (различия достоверны, р 0,001), с последующим снижением в 2000 году до 42±2,2 % (различия достоверны, р 0,01). Плазмидовара 38 : 2,3 MDa был наиболее значимым в 1997 и 2000 г.г., когда на его долю пришлось 25,2±2,1 % и 22,3±1,8 % штаммов микроба, выделенных от больных людей.
Этиологическая значимость доминирующих плазмидоваров подвержена не только годичной изменчивости, но она может меняться и; по месяцам. На рис. 17, 18 и 19 представлена этиологическая значимость доминирующих плазмидоваров S. enteritidis в 1998, 1999 и 2000 г.г. в различные месяцы выделения. Можно отметить, что в 1998 году (рис. 17) этиологически значимыми были два плазмидовара - 38 MDa и 3 8 : 1,4 MDa.
Однако максимум выделения штаммов плазмидовара 38 MDa пришелся на февраль и май (67,6±9,0 % и 61,5±7,6 % соответственно), а этиологическая значимость плазмидовара 38 : 1,4 MDa была максимальной в сентябре и ноябре, составив 59,6±6,4 % и 60,7±9,3 % от всех выделенных штаммов.
Этиологическая значимость плазмидовара 38 : 2,3 MDa, в течение года не превышала 3,8±2,2 %, за исключением октября, когда этот плазмидовар объединил 12,0±4,6 % всех выделенных штаммов. Такой же этиологический тип популяции с преобладанием двух доминирующих плазмидоваров прослеживался и в 1995, 1996 и 1997 г.г.
Этиологическая значимость доминирующих плазмидоваров в 1999 г. выглядит несколько иначе (рис. 18). В течение этого года в популяции S. enteritidis преобладал один плазмидовар - 38 : 1,4 MDa. Этиологическая значимость этого плазмидовара в январе, апреле и в период с августа, по ноябрь была максимальной и составила от 53,3±7,7 % до 64,3±6,6 %. В остальные месяцы этот плазмидовар так же был достаточно значимым, и процент выделенных штаммов колебался от 27,9±8,2 % до 36,7±8,7 %.
Максимальная значимость остальных доминирующих плазмидоваров в 1999 г. не превышала 27,6±8,4 % для плазмидовара 38 MDa в феврале и 20,0±7,3 % для плазмидовара 38 : 2,3 MDa в декабре.
Третий этиологический тип популяции S. enteritidis, где роль всех трех доминирующих плазмидоваров значительна и вариабельна по месяцам, выявлен в 2000 г. и представлен на рис. 19. Штаммы S. enteritidis плазмидовара 38 MDa играли наиболее значимую роль в этиологии инфекции в мае, составив 35,5±4,6 %. Штаммы плазмидовара 38 : 1,4 MDa преобладали в этиологии болезни в январе, апреле и в период с августа по октябрь, когда их роль была достоверно выше значимости плазмидовара 38 : 2,3 MDa (р 0,05). Их этиологическая значимость в эти месяцы колебалась от 53,3±9,1 % до 64,3±13,2 %. Штаммы плазмидовара 38 : 2,3 MDa преобладали в феврале и июне, когда их этиологическая значимость в эти месяцы была несколько больше остальных доминирующих плазмидоваров и составила 34,9±7,3 % и 39,0±5,4 % соответственно (различия с плазмидоваром 38 : 1,4 MDa недостоверны (р 0,05), с плазмидоваром 38 MDa различия достоверны, р 0,05).
Проведенные исследования позволяют высказать следующие обобщения. Длительный централизованный микробиологический мониторинг за возбудителем позволил получить данные об этиологической значимости доминирующих плазмидоваров микроба, которые характеризуется изменчивостью этиологической роли каждого из плазмидоваров не только по годам, но и по месяцам. Выявлено три типа участия плазмидоваров в этиологии болезни: при первом типе в течение года имеет место преобладание значимости двух плазмидоваров микроба; второй тип характеризуется увеличением роли одного из плазмидоваров на фоне снижения значимости двух других; для третьего типа характерно участие в этиологии болезни всех трех плазмидоваров с периодическим увеличением роли каждого из них.
