Содержание к диссертации
Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
2.1. Род Salmonella - общие сведения 12
2.1.1 Мониторинг бактерий рода Salmonella 15
2.1.2. Биологические свойства 17
2.1.3. Антигенная структура 21
2.2. Средства специфической профилактики сальмонеллеза свиней и птиц 23
2.3. Классификация и характеристика вакцинных препаратов 24
2.4. Биотехнология и производство вакцин 29
2.4.1. Питательные среды 34
2.4.2. Приготовление посевного материала 38
2.4.3. Глубинное культивирование микроорганизмов 39
2.5. Оценка иммуногенной активности вакцинных препаратов 41
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 47
3.1. Материалы и методы 47
3.2. Результаты исследований 52
3.2.1. Мониторинг сальмонеллезной инфекции свиней и птиц 52
3.2.2. Бактериологические исследования на сальмонеллез 54
3.2.3. Определение чувствительности полевых штаммов сальмонелл к антибактериальным препаратам 56
3.2.4. Технология изготовления и контроль живых вакцин против сальмонеллеза 58
3.2.4.1. Питательные среды для культивирования вакцинных штаммов 60
Подготовка посевного материала 63
Глубинное периодическое культивирование вакцинных штаммов S. choleraesuis
SC230, S. tyhpimurium №3, S. enteritidis SE204 и S. gallmarum-риПопдаі ТІ0 66
Оценка безвредности и иммуногенности вакцин 68
Производственные испытания вакцин 71
Сравнительная оценка иммуногенных свойств «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» с другими сальмонеллезными
вакцинами 74
Оценка протективной активности сальмонеллезных вакцин 74
Оценка гуморального иммунитета 77
Оценка макрофагалъного звена клеточного иммунитета 79
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 84
ВЫВОДЫ 92
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 93
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 94
ПРИЛОЖЕНИЯ 105
Введение к работе
1. . Актуальность проблемы
Создание и возрождение крупных свиноводческих и птицеводческих комплексов сопровождается резким изменением эпизоотической ситуации по ряду инфекционных заболеваний и активизацией условно патогенных микроорганизмов. Большая плотность животных сопряжена с возможностью взаимного перезаражения, возникают идеальные условия для циркуляции возбудителей среди поголовья.
Сегодня на первый план выдвинулись желудочно-кишечные заболевания (в том числе сальмонеллез) и инфекции с поражением дыхательных путей.
Экономический ущерб от сальмонеллеза складывается из падежа части заболевшего молодняка, отставания в росте и развитии переболевшего поголовья.
На сегодняшний день проблема профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, в том числе и птицы, имеет не только экономическое, но и социальное значение. Свидетельством реального существования такой угрозы, по данным ВОЗ, являются участившиеся вспышки инфекций среди людей. Причину заболеваний связывают с поражением продуктов питания животного происхождения патогенными микроорганизмами. Повышение устойчивости штамма Salmonella enteritidis создало предпосылку для передачи возбудителя от птицы к человеку и обратно. По данным ВОЗ, заболеваемость людей сальмонеллезом за последнее десятилетие возросла шестикратно, а в странах СНГ - в семь раз. При этом этиологическая значимость S. enteritidis в заболевании людей возросла на 30%, животных - 75%, а число случаев обнаружения возбудителя в продуктах питания увеличилось на 50% (В. Ли, 2003).
В связи с этим в настоящее время во всем мире уделяется большое внимание разработке различных лечебных препаратов и сальмонеллезных вакцин.
Сложность борьбы с сальмонеллезом определяется быстрой адаптацией возбудителя, как к антибиотикам, так и другим химиотерапевтическим препаратам. Наблюдается селекция и циркуляция штаммов, несущих R-факторы, формирующиеся под влиянием вышеуказанных препаратов.
Бесконтрольное применение антибиотиков усугубило ситуацию и
способствовало селекции антибиотико-резистентных штаммов
микроорганизмов. В ряде хозяйств обнаруживается 100% - ная. устойчивость бактерий ко всем применяемым антибиотикам.
В настоящее время в птицеводстве, в качестве профилактических и лечебных средств, при сальмонеллезах применяют пробиотики и бактериофаги.
Для профилактики сальмонеллеза свиней, в настоящее время, широко используются как жидкие инактивированные вакцинные препараты на основе вирулентных штаммов S. choleraesuis и S. typhimurium, так и вакцины живые сухие из аттенуированных штаммов. Применение в ветеринарной практике и той и другой формы вакцины объясняется наличием у каждой своих преимуществ и недостатков.
Для профилактики сальмонеллеза свиней существует вакцина живая сухая из штамма ТС-177, который представляет собой «дикий» мутант, не имеет генетических маркеров, кроме пониженной вирулентности. Известна также вакцина живая сухая из супрессорного ревертанта S. choleraesuis №9. Штамм S. choleraesuis №9 (ФГУ ВГНКИ) отличается от эпизоотических штаммов высокой частотой (50%) выделения стрептомицинзависимых мутантов, большая часть из которых остается вирулентной. Поэтому использование этих вакцин приводит к затруднению при дифференциации вакцинного штамма от полевого, из-за необходимости изучения большого количества мутантных клонов (Э.А. Светоч и др. 2003).
Анализируя выше сказанное, можно сделать вывод, что разработка и совершенствование средств специфической профилактики сальмонеллеза свиней и птиц остается актуальной задачей научных сотрудников, биотехнологов и практикующих врачей.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы являлось проведение мониторинга сальмонеллезной инфекции в свиноводческих и птицеводческих хозяйствах, и совершенствование профилактики этого заболевания с помощью специфических средств.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-провести мониторинг сальмонеллеза свиней и птиц на территории Российской Федерации;
-разработать технологии производства, методы контроля и применения «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» и «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза птиц»;
-разработать нормативно-техническую документацию (технические условия и наставление по применению) на производство данных препаратов;
-испытать вакцины в лабораторных и производственных условиях;
-оценить протективную активность «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» в сравнении с другими существующими противосальмонеллезными вакцинами.
Научная новизна работы
Получены новые данные по результатам мониторинга возбудителей сальмонеллеза свиней и птиц о роли S. choleraesuis, S. typhimurium, S. enteritidis, S. gallinarum-pullorum в развитии эпизоотической ситуации, складывающейся в неблагополучных по сальмонеллезу отдельно взятых хозяйствах.
Обоснована необходимость создания вакцинных препаратов для профилактики сальмонеллеза свиней - на основе штаммов S. choleraesuis и S. typhimurium и сальмонеллеза птиц - на основе штаммов S. enteritidis и S. gallinarum-pullorum.
Показана возможность использования питательной среды на основе панкреатического гидролизата рыбной муки (ПГРМ) вместо мясных переваров без потери урожайности при культивировании сальмонелл.
«Бивалентная вакцина живая сухая против сальмонеллеза свиней» из аттенуированных штаммов S. choleraesuis SC230 и S. typhimurium №3 по иммуногенным свойствам превосходит существующие вакцины против сальмонеллеза.
Практическая значимость работы
Разработаны технологии изготовления, контроля и применения «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» и «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза птиц». Созданы проекты научно-технической документации на вакцинные препараты по изготовлению и контролю.
Предложена питательная среда для культивирования вакцинных штаммов S. choleraesuis SC230, S. typhimurium №3, S. enteritidis SE204 и S. gallinarum-pullorum ТЮ на основе панкреатического гидролизата рыбной муки. Данная питательная среда позволяет снизить себестоимость вакцинных препаратов, по сравнению с теми, которые получены на средах из мясных переваров.
Получены положительные результаты испытания вакцинных препаратов, как на лабораторных, так и на естественно восприимчивых животных.
Публикация результатов исследовании
По теме диссертации опубликовано 5 научных работ. Зарегистрировано 2 отчета о НИОКР ГНЦ прикладной микробиологии по
линии Министерства науки, промышленности и технологии РФ 2001-2002 (Раздел «Разработка образцов готовых форм препаратов и наработка опытных партий вакцин против сальмонеллеза птиц, гемофилеза свиней. Получение лабораторного образца вакцины против коксиеллеза крупного рогатого скота») и 2002-2003 гг (Раздел «Разработка проекта нормативно-технической документации на приготовление «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза птиц»).
Апробация работы
Материалы диссертации доложены:
на. международной конференции: «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов», 5-6 декабря 2002 г. -Щелково.
на межлабораторном научном семинаре ГНЦПМ - апрель 2004г. -Оболенск.
Основные положения диссертации выносимые на защиту
Новые данные о роли полевых штаммов S. choleraesuis, S. typhimurium, S. enteritidis, S. gallinaram-pulloram в развитии эпизоотической ситуации в РФ, на примере 21 свиноводческого и 36 птицеводческих хозяйств из 27 регионов России.
Питательная среда для культивирования сальмонелл на основе ПГРМ с содержанием ам. N > 600 мг%.
«Бивалентная вакцина живая сухая против сальмонеллеза птиц», характеризующаяся крайне низкой остаточной реактогенностью и способностью формирования стойкого специфического иммунитета.
«Бивалентная вакцина живая сухая против сальмонеллеза свиней», обладающая крайне низкой остаточной реактогенностью и высокими иммуногенными свойствами по сравнению с другими сальмонеллезными вакцинами.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений и приложений. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами и 11 рисунками. Список литературы включает 115 источников, в том числе 83 отечественных и 32 зарубежных.
Род Salmonella - общие сведения
Возбудители сальмонеллезов относятся к роду Salmonella семейства Enterobacteriaceae. Родовое название Salmonella было дано этим бактериям Линьером в 1900 г. в честь американского исследователя Дэвида Сэльмона, описавшего в 1885 г. микроорганизм (В. suipestifer), известный теперь как Salmonella choleraesuis и считавшийся первоначально возбудителем чумы свиней. В последующем было установлено, что этот микроорганизм в действительности был лишь нередким спутником вируса - истинного возбудителя чумы свиней (И.В. Голубева и др. 1985; Б.И. Антонов и др. 1986; В.И. Покровский и др. 1999).
Сальмонеллы - большая группа бактерий, классификация которых претерпевала значительные изменения по мере совершенствования знаний об их антигенной структуре и биохимических свойствах, при этом основная дискуссия касалась проблемы рассматривать ли входящих в род Salmonella представителей как виды или типы (В.И. Покровский и др. 1985, 1999; А.Л. Котова и др. 1992; Л.А. Ряпис и др. 1995; M.Y. Ророіїи др. 1997; LP. Euzeby 1999; Т. Ezaki и др. 2000; Е. Yabuuchi и др. 2000).
Первым выделившимся сальмонеллам присваивали название по собственному усмотрению исследователей, которые их открывали. В результате чего названия сальмонелл имеют самое разнообразное происхождение (В.И. Покровский 1985; MY. Popoff и др. 1997).
Так, некоторые серовары отражают название болезни, которую вызывали (Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A,B,C). Другие наименования сочетали синдром с хозяин-специфичностью, которая в части случаев оказалась правильной (Salmonella abortus-ovis, Salmonella abortus-equi), в части - ошибочной (Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis).
Многие серовары получили название страны, города, улицы, реки и прочих географических мест, где они были впервые обнаружены (Salmonella brasil, Salmonella london, Salmonella linton).
Отдельные серовары названы по фамилии специалиста, выделившего или идентифицировавшего его (Salmonella morehead, Salmonella saphra), или в честь известных людей (Salmonella sullivan, Salmonella gilbert). Несколько сероваров получили названия добродетелей (Salmonella charity, Salmonella verity). В отдельных случаях наименования сероваров представлены аббревиатурой (Salmonella anfo - «animalfood», Salmonella chinovum -«Chinese» и «ovum») (A.A, Табаева и др. 2001).
В начале 30-х гг. Кауффман и Уайт предложили разделять сальмонеллы в соответствии с их антигенной структурой; позднее Юинг (1963) предложил классификацию по биохимическим признакам, но у последней было много недостатков; так, например сальмонеллы были отнесены к роду Citrobacter и др. (В.И. Покровский и др. 1999).
Накопление новых данных по геносистематике сальмонелл вызвало необходимость пересмотра классификационных схем, что, в свою очередь, создало ряд проблем в номенклатуре.
Исследования гомологии ДНК показали, что все штаммы сальмонелл образуют одну ДНК-группу с 7 подгруппами, a Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium являются членами одной геномоспецифичности (L. Le Minor и др. 1982, 1986). На основании этих исследований все 7 подгрупп отнесены к виду Salmonella choleraesuis
в качестве подвидов: Salmonella choleraesuis subps. choleraesuis, Salmonella choleraesuis subps. arizonae, Salmonella choleraesuis subps. diarizone, Salmonella choleraesuis subps. houtenae, Salmonella choleraesuis subps. indica, Salmonella choleraesuis subps. salamae, Salmonella choleraesuis subps. bongori.
Название Salmonella choleraesuis было выбрано по названию типового вида рода. Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium отнесены к Salmonella choleraesuis subps. choleraesuis (A.A. Табаева и др. 2001),
В настоящее время для дифференцировки сальмонелл применяют схему Кауффмана-Уайта. ЛеМинор и Попофф (1987) предложили классифицировать сальмонеллы по ферментативным свойствам и в соответствии с этим выделили лишь один вид - Salmonella enterica (S. enteritidis). Ривс с коллегами (1989) выделили в самостоятельный вид также и S. bongori (M.W. Reeves и др. 1989; В.И. Покровский и др. 1999). Последний в свою очередь подразделяют на 6 подвидов (подродов), обозначаемых номерами или собственными именами, -S. enterica (I), salamae (II), arizonae (Ша), diarizone (Illb), houtenae (IV), indica (V) и bongori (VI).
Классификация сальмонелл изложенная в IX издании определителя бактерий Берджи (1994), включает в род Salmonella 2 вида - S. bongori и S. choleraesuis, объединяющий бактерий 5 подвидов - choleraesuis (1), salamae (2), arizonae (За), diarizone (3b), houtenae (4) и indica (5). Их основные биохимические свойства представлены в таблице № 2.1.1.
Эта классификация имеет некоторые ограничения, и ее нельзя считать завершенной. Патогенностью для теплокровных обладают в основном бактерии подвидов choleraesuis и salamae, чрезвычайно редко - прочих подвидов; при этом подвид choleraesuis включает в себя большую часть известных в настоящее время сероваров (по состоянию на 1992 г. - 1367 из 2324) (В.И. Покрвский и др. 1999).
Мониторинг бактерий рода Salmonella
Сальмонеллы принадлежат к числу микроорганизмов, широко распространенных во всех странах мира, при этом одни из сероваров являются убиквитарными (распространенными повсеместно), как, например S. typhimurium, тогда как другие скорее можно рассматривать как локальные, свойственные определенным регионам. Так, S. berta обнаруживается чаще всего в странах Северной Америки, S. sendai - в странах Дальнего Востока, S. Uganda и S. wangata - на Африканском континенте, S. madelia и S. altona - в странах Южной Америки и т. д. (И.В. Голубеваидр. 1985).
Из множества сальмонелл в нашей стране зарегистрировано около 45 серотипов, принадлежащих к серогруппам А, В, Cj, Сг, Di, Fi, что облегчает лабораторную диагностику сальмонеллезов (Ф.З. Андросов и др, 1981).
Патогенные типы сальмонелл поражают многие виды животных, однако имеются обособленные варианты, вызывающие инфекции только у одного вида, иногда с выраженным тропизмом к определенным тканям и органам (сальмонеллы аборта овец и лошадей и др.) (Б.А. Матвиенко 1982),
Среди животных наиболее распространены:
-у крупного рогатого скота - S, dublin, S. typhimurium, S. enteritidis;
-у свиней - S. choleraesuis, S. typhimurium или S. typhisuis, S. dublin, S. muenchen, S. arizonae;
-у овец - S. abortus ovis, S. typhimurium;
-у лошадей - S. abortus equi;
-у птицы - S. gallinarum-pullorum; S. typhimurium, S. enteritidis, S. heidelberg, S. anatum, S. haifa, S. infantis, S. london;
-у пушных зверей - S. typhimurium, S. choleraesuis, S. dublin (Ф.З. Андросов и др. 1981; Б.И. Антонов и др, 1986; Ю.Ф. Борисович и др. 1987; Н.А. Ковалев и др. 1988; К.Б. Бияшев 1992; Э.П. Карева и др. 2003).
По данным Всероссийского НИВИ патологии, фармакологии и терапии при изучении этиологии желудочно-кишечных болезней поросят установлено, что от всего числа бактериальных инфекций 32% было вызвано сальмонеллами, при чем в подавляющем числе хозяйств сальмонеллез был вызван Salmonella choleraesuis и Salmonella typhimurium (А.Г. Шахов 2003).
По статистике Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института от поросят всех возрастов были выделены сальмонеллы: S, choleraesuis - 56,6%; S. typhimurium - 23,4; S. dublin - 3,0; S. arizona - 9; сальмонеллы редких групп - 8%. Сальмонеллоносительство у свиноматок установлено до 22 - 46%; у переболевших поросят отьемышей 25% (Э.П. Карева и др. 2003).
По данным ГНЦ прикладной микробиологии при изучении мониторинга сальмонеллезной инфекции в свиноводческих и птицеводческих хозяйствах России установлено:
-при исследовании патологического материала от поросят из 31,8% выделены сальмонеллы, из них 67% - S. choleraesuis, 31 - S. typhimurium, 2% - сальмонеллы редких групп;
-60 % птицеводческих хозяйств являются эпизоотическими очагами. Среди выделяемых микроорганизмов возбудителем сальмонеллеза в 91%-тах являлась - S. enteritidis, в 8% - S. gallinarum-pullorum, в 1% - S. typhimurium (В.В. Гусев и др. 2002,2002,2003,2004).
Материалы и методы
Исследования по данной диссертации проведены в рамках тематики НИОКР по линии Министерства науки, промышленности и технологии РФ в период с 2001 по 2004 гг. в ФГУП ГНЦ прикладной микробиологии (ФГУП ГНЦ ПМ), в свиноводческих и птицеводческих хозяйствах Московской, Пермской, Курской, Нижегородской, Петрозаводской, Белгородской, Псковской, Волгоградской, Владимирской, Орловской, Смоленской, Ленинградской, Воронежской, Томской, Новосибирской, Архангельской, Астраханской, Самарской, Саратовской, Костромской, Калужской, Калининградской, Липецкой, Тульской, Ярославской областей, республики Мордовия и Краснодарского края.
Вскрытие павших и вынужденно убитых животных и птиц, патологоанатомическое обследование и отбор патологического материала проводили по стандартным методикам.
При бактериологическом исследовании патологического материала с целью выделения возбудителей бактериальных инфекций, определения их культурально - морфологических, биохимических свойств и серотипирования руководствовались:
-методическими указаниями по бактериологической диагностике сальмонеллезов животных от 30 декабря 1971 года, рекомендованными Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР;
-наставлением по применению наборов сывороток сальмонеллезных О-комплексных и монорецепторных О- и Н-агтлютинирующих для экспресс-идентификации сальмонелл в РА на стекле от 30 июля 1984 года, утвержденным Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР;
-методическими указаниями по лабораторной диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных за № 13-7-2/2117 от 27 июля 2000 года, утвержденными заместителем руководителя департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации В.В. Селиверстовым;
-методическими указаниями по лабораторной диагностике пастереллезов животных и птиц за № 22-7/62 от 20 августа 1992 года, утвержденными заместителем Главного управления ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации В.М. Авиловым;
В работе использованы эпизоотические штаммы (сальмонеллы, эшерихии, пастереллы, цитробактеры, -клебсиеллы, серрации) выделенные от павших и вынуждено убитых поросят и цыплят.
Биохимические свойства полевых штаммов сальмонелл исследовали с помощью набора ЭНТЕРОтест 24 (Lachema, Чехия).
Для определения подвижности сальмонелл брали полужидкий агар (0,2% агар-агара).
При проведении диагностики сальмонеллеза в РА на стекле использовали сальмонеллезные сыворотки Краснодарской биофабрики.
Для определения чувствительности полевых штаммов сальмонелл к антибактериальным препаратам взят метод разведений данных препаратов в плотной питательной среде. При этом использовали АГРМ (агар на основе гидролизата рыбной муки), на который и происходил высев исследуемых культур (В.Ф. Ковалев и др. 1988).
Работа с вакцинными и вирулентными штаммами, приготовление панкреатического гидролизата рыбной муки, который используется в качестве основы питательной среды, осуществляли согласно разработанной нами временной инструкции по изготовлению и контролю данных вакцинных препаратов.
Технология изготовления «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза свиней» и «Бивалентной вакцины живой сухой против сальмонеллеза птиц» разработана совместно со специалистами ГНЦПМ.
Концентрацию в ПГРМ водородных ионов определяли потенциометрически на рН -метре «MP 226» (Швейцария); аминного азота — формольным титрованием по методу Зеренсен -Гаврилова; триптофана по A.M. Пешкову.
