Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Состояние отечественного свиноводства 12
1.2. Род Salmonella 25
1.2.1. Распространенность сальмонелл в природе 29
1.2.2. Средства и методы специфической профилактики сальмонеллеза 36
1.3. Культивирование сальмонелл 37
1.3.1. Питательные потребности сальмонелл 37
1.3.2. Принципы составления и подбора питательных сред 42
1.3.3. Приготовление посевного материала 44
1.3.4. Процессы культивирования микроорганизмов 45
1.3.4.1. Классификация методов культивирования 47
1.3.4.2. Культивирование микроорганизмов 50
1.3.4.3. Физиологическое состояние микроорганизмов в процессе роста и развития при периодическом культивировании 54
1.3.4.4. Изменения биологических свойств микроорганизмов при периодическом культивировании 61
1.3.5. Способы концентрирования бактериальных культур 63
2. Собственные исследования 65
2.1.Материалы и методы 65
2.2. Результаты исследований 79
2.2.1. Разработка модели промышленной технологии производства вакцины против сальмонеллеза свиней 79
2.2.2. Разработка технологии получения вакцины против сальмонеллеза свиней 82
2.3. Разработка питательной среды для глубинного управляемого процесса культивирования сальмонелл штаммов S.typhimurium № 415 и S.choleraesuis № 370 86
2.4. Разработка глубинного управляемого процесса культивирования вакцинных штаммов S.typhimurium № 415 и S.choleraesuis № 370 93
2.5. Оптимизация защитной среды высушивания, используемой при изготовлении сухой вакцины против сальмонеллеза 102
2.6. Вирулентность штаммов сальмонелл 112
2.7. Приготовление антигенных препаратов 114
2.8. Влияние интервала реиммунизации на антителогенез 116
2.9. Определение оптимальных доз препарата на антителообразование при двукратной иммунизации 118
2.9.1. Изучение иммуногенности двухкомпонентного препарата на белых мышах 118
2.9.2. Изучение реактогенности, безвредности и иммуногенности двухкомпонентного препарата на свиноматках и поросятах 120
2.9.3. Изучение иммуногенности препарата на свиноматках и поросятах 121
3. Обсуждение результатов 128
4. Выводы 138
5. Практические предложения 140
6. Список литературы 141
7. Приложения 172
7.1. Таблицы расчетов коэффициентов уравнений 173
7.2.Паспорта штаммов и СТО на посевной материал 199
7.3.Нормативная документация 208
7.4.Акты испытаний 213
7.5.Патенты 228
7.6.Методические положения 233
- Распространенность сальмонелл в природе
- Физиологическое состояние микроорганизмов в процессе роста и развития при периодическом культивировании
- Разработка модели промышленной технологии производства вакцины против сальмонеллеза свиней
- Изучение иммуногенности двухкомпонентного препарата на белых мышах
Введение к работе
Исследования по разработке и обеспечению продовольствием и биологической защиты людей и животных в стране является основной задачей АПК на современном этапе, что делает актуальными научные изыскания, направленные на решение этих проблем.
Одним из путей решения задач развития АПК поставленных перед наукой является разработка, производство и применение новых экологически безопасных эффективных препаратов, вакцин способных обеспечить нормальное развитие животных, что способствует получению от них качественной продукции.
Этим требованиям соответствуют новые экобиотехнологические препараты, такие как пробиотики, вакцины, диагностикумы и другие иммунобиологические препараты, которые применяют как в здравоохранении, так и в ветеринарии. Такие лечебно-профилактические и ростостимулирующие экологически чистые препараты физиологичны по своему действию, безвредны для животных, просты в наработке, дешевы, технологичны для группового применения, что особенно актуально для отечественного животноводства.
В общей номенклатуре выпускаемых препаратов значительную долю занимают средства специфической профилактики инфекционных болезней животных, вызываемых патогенными бактериями.
Благодаря достижениям современной науки при промышленном производстве биопрепаратов достаточно широко используются реакторные способы выращивания бактерий в жидких питательных средах, физико-химические методы обработки культур и стабилизации микроорганизмов. Однако большинство технологических процессов промышленного производства ветеринарных биопрепаратов базируется на эмпирических данных и требует обстоятельного научного обоснования.
Технология изготовления бактериальных вакцин – многоаспектная проблема, ключевым направлением которой является разработка современных процессов культивирования микроорганизмов, позволяющих интенсифицировать производство и получать высококачественные препараты. Процессы культивирования позволяют не только разрабатывать прогрессивные технологии производства биопрепаратов, но и более глубоко изучать закономерности жизнедеятельности бактериальных популяций.
Под моделированием понимают исследования круга проблем, связанных с применением к промышленному оборудованию данных, полученных в лабораториях и на опытных установках. В случае хорошо поставленного технологического моделирования процесса повышается выход конечного продукта на промышленном оборудовании, сокращении затрат и уменьшении себестоимости готовой продукции.
В фундаментальных работах, посвященных культивированию непатогенных микроорганизмов, приводятся материалы исследований по общим вопросам микробиологического синтеза, закономерности и факторы, оказывающие влияние на рост и развитие продуцентов, а также по разработке научных основ оптимизации выращивания микроорганизмов с применением современного технологического и аппаратурного оформления процессов.
Общие теоретические и прикладные аспекты проблемы культивирования отдельных патогенных микроорганизмов достаточно глубоко рассматриваются рядом исследователей.
Работы по изучению процессов культивирования вакцинных штаммов бактерий, используемых для изготовления препаратов для ветеринарной медицины, за редким исключением, представляют собой материалы исследований, либо констатирующих принципиальную возможность глубинного выращивания микроорганизмов, как правило, без учета их метаболизма и комплекса физико-химических параметров роста, либо характеризующих динамику развития бактерий и не содержащих количественных характеристик и физиологических показателей роста культур. Это не позволяет хотя бы в общих чертах судить о жизнедеятельности микроорганизмов при их культивировании. Однако исследования, направленные на познание закономерностей, присущих популяциям микроорганизмов в искусственно создаваемых условиях, экспериментальное обоснование методов и режимов культивирования бактерий, обеспечивающих воспроизводимое их получение в оптимальных условиях, имеют большое теоретическое и практическое значение, так как результаты изучения закономерностей микробных популяций являются научной основой разработки любой технологии производства биопрепаратов.
Таким образом, современное вакцинное производство немыслимо без научно обоснованных технологий изготовления биопрепаратов, обеспечивающих интенсификацию отдельных стадий, составляющих целостные технологические процессы и получение стандартной и высококачественной продукции. Анализ тенденций разработки и совершенствования технологий промышленного изготовления бактериальных вакцин показывает, что резервы повышения эффективности их производства и качества состоят, в основном, из оптимизации условий и разработки процессов культивирования микроорганизмов с учетом их метаболизма и физиологического состояния, изыскания эффективных средств защиты, обеспечивающих надежную стабилизацию биологической активности препаратов.
Биологической промышленностью выпускается более 40 бактериальных вакцин, в том числе 20 живых препаратов. Из числа живых вакцин 4 жидких и 16 сухих. Практически все используемые в отечественной биологической промышленности технологии изготовления препаратов не совершенны. В качестве питательных сред для выращивания производственных штаммов микроорганизмов используется нестандартное пищевое сырье, процессы культивирования малопроизводительны, не контролируются и не регулируются по большинству значимых физико-химических параметров и осуществляются без учета физиологического состояния культур.
Элементы несовершенства технологических приемов и низкой стабильности наиболее характерны для большинства бактериальных вакцин, что позволило выделить их из общего числа живых препаратов в качестве основных объектов для более детального рассмотрения при разработке технологий изготовления этих препаратов в направлении интенсификации производства и повышения стабильности биологической активности.
Наряду с этим для более углубленного изучения закономерности технологических процессов культивирования и стабилизации микроорганизмов, апробирования их на родственных моделях и определения возможных обобщений, распространяющихся на вакцины против сальмонеллеза животных, в качестве дополнительных объектов представлялось целесообразным избрать, например, вакцину из штамма Pasteurella multocida, которая отличается методами и условиями культивирования.
Выбор указанных объектов исследований обусловлен также и рядом следующих обстоятельств, в частности:
- актуальностью проблемы специфической профилактики сальмонеллеза;
- необходимостью замены устаревших технологий изготовления вакцин на более производительный и эффективный метод глубинного периодического культивирования.
Вакцинные штаммы, избранные модельными, являются представителями достаточно хорошо изученных микроорганизмов, что дает возможность углубленного исследования проблем биологической активности и физиологического состояния бактериальных культур при управляемом выращивании, познание закономерностей, присущих микробным популяциям и расшифровки механизмов, определяющих стабильность биологических свойств в целостном технологическом процессе изготовления вакцинных препаратов для ветеринарной медицины.
Свиноводство в нашей стране является одним из основных источников производства мяса и жира животного происхождения. На фоне специфических условий характерных для отрасли и, в частности, в связи с концентрацией большого количества свиней на ограниченных производственных площадях возрастает роль организации профилактических мероприятий по предупреждению опасных с эпизоотической точки зрения таких инфекций бактериальной этиологии, как сальмонеллез, рожа, некробактериоз, гемофилез, пастереллез и другие.
В условиях крупных свиноводческих хозяйств каждая вспышка заболевания свинопоголовья кишечными инфекциями (к таким, в первую очередь, относится сальмонеллез) ведет к ощутимым потерям экономического и социального характера.
Сальмонеллезной инфекции наиболее ощутимо подвержен молодняк свиней. В меньшей степени от сальмонеллеза страдает взрослое свинопоголовье. Однако, являясь бактерионосителями сальмонеллезной инфекции, они подвергают постоянной опасности инфицирования большого числа свиней.
В нашей стране накоплен значительный опыт по иммунопрофилактике сальмонеллезов сельскохозяйственных животных живыми вакцинами.
В этой связи очевидна необходимость разработки вакцинных препаратов для иммунизации; а) отдельно - для маточного поголовья, как основы для создания колострального иммунитета нарождающегося молодняка свиней, и б) отдельно - для иммунизации поросят послеотъемного периода. В дальнейшем у взрослого поголовья, сальмонеллоносительство не представляет сколько-нибудь значительной опасности.
Для иммунопрофилактики сальмонеллезов эффективны живые вакцины, изготовленные из аттенуированных (авирулентных) штаммов сальмонелл. Последние получают при пассировании вирулентных культур микроорганизмов на искусственных питательных средах и невосприимчивых животных, а также под влиянием физических, химических и биологических факторов.
Одной из основных причин медленного внедрения в практику живых вакцин является возможность реверсии сальмонелл вакцинных штаммов в исходное состояние. При указанных методах аттенуации сальмонеллезных штаммов специфический механизм действия выбранного мутагена на совершенно определенные дискретности генетического аппарата особи не ясен, то есть отсутствуют генетические метки, позволяющие отличать их от естественных прототипов.
1.1. Актуальность темы. В настоящее время техническая микробиология является активно развивающимся научным направлением, использующим биотехнологические процессы при разработке и производстве широкого спектра биопрепаратов (вакцин, сывороток, диагностикумов, пробиотиков), биологически активных веществ (ферментов, антибиотиков, пребиотиков и др.), добавок к кормам (белков и аминокислот). Их применение в животноводстве и птицеводстве способствует повышению продуктивности животных и птицы, обеспечению ветеринарного благополучия хозяйств, гарантии качества, биологической и экологической безопасности как самой продукции, так и процесса ее производства.
Основы разработки, оптимизации, моделирования технологий микробиологических производств и процессов микробиологического синтеза отражены в работах В.М. Кантере, В.В. Бирюкова, И.М. Грачевой, Ю.П. Грачева (1979 – 1990г.г.). Эти разработки актуальны и для предприятий, выпускающих лекарственные средства для животных, в том числе и иммунобиологические препараты, с точки зрения обеспечения их безопасности и качества.
Исследования по разработке управляемых режимов культивирования вакцинных штаммов микроорганизмов и режимов сублимационного высушивания проводили Б.А. Никаноров, А.Я. Самуйленко, Е.А. Рубан, А.А. Раевский, М.Я. Ярцев, Э.Ф. Токарик, А.А. Нежута и др. Технология промышленного производства вакцин для ветеринарии с использованием глубинного культивирования микроорганизмов была разработана Н.Д. Скичко, А.Я. Самуйленко, Н.В. Мельником, В.С. Павленко (1980 - 1990гг.).
В настоящее время в области разработки новых и усовершенствования существующих промышленных технологий производства сухих живых бактериальных препаратов не существует единого методологического подхода, основанного на использовании методов системного анализа.
Традиционные технологии разработаны на основе эмпирических подходов и зачастую не удовлетворяют современным национальным и международным требованиям, предъявляемым к технико-технологическим характеристикам производства и обеспечивающим надлежащее качество продукции. Поэтому остается много нерешенных технических и технологических проблем совершенствования существующих и создания новых технологий промышленного производства бактерийных препаратов.
Одним из самых сложных объектов с точки зрения технологии изготовления является вакцина против сальмонеллеза. Актуальность производства и применения этой вакцины обусловлена тем, что сальмонеллез являются широко распространенным инфекционным заболеванием, наносящим значительный ущерб животноводству и представляющим серьезную угрозу здоровью людей. Важное место в борьбе с сальмонеллезом занимает специфическая профилактика с помощью инактивированных и живых вакцин. С этой целью наиболее эффективны живые вакцины, изготовленные из авирулентных штаммов бактерий.
Семейство энтеробактерий объединяет обширную группу грамотрицательных бактерий, к которым относятся роды Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Shigella и др. Сальмонеллы патогенны для животных многих видов, наиболее часто сальмонеллезы регистрируют у свиней и птиц. Сальмонеллезы имеют большое эпидемиологическое и эпизоотологическое значение. Возбудителями, в основном, являются S. choleraesuis, S. enteritidis, S. typhimurium, S. typhisuis, значительно реже обнаруживают S. gleser, S. dublin, S. voldagsen.
Сальмонеллёз свиней вызывают сальмонеллы разных серотипов, набоилее часто S.cholraesuis u S.typhimurium, в ряде случаев с преобладанием S.typhimurium.
Первая вакцина против сальмонеллеза поросят в нашей стране была изготовлена М.М. Ивановым (1948), против сальмонеллеза телят - А.Г. Малявиным и И.И. Архангельским (1950-1960), усовершенствованием технологии производства вакцин во ВНИИТИБП и на Щелковском биокомбинате занимались Н.Д. Скичко, Н.В. Мельник, А.А. Раевский, Е.Э. Школьников и др.
В связи с вышеизложенным, научно обоснованное решение проблемы совершенствования технологии промышленного производства вакцины и до настоящего времени является актуальной задачей, имеющей практическую ценность.
1.2. Цель и задачи исследований. Цель работы – изучение биотехнологических закономерностей промышленного производства бактерийных препаратов на разработанной модели производства вакцины против сальмонеллеза свиней.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
- научно обосновать и разработать биотехнологическую модель промышленной технологии изготовления вакцины против сальмонеллеза свиней;
- выбор вакцинных штаммов сальмонелл;
- изучить культуральные, морфологические, ферментативные, вирулентные и антигенные свойства культур сальмонелл отобранных штаммов для изготовления вакцины;
- оптимизировать состав питательной среды на основе перевара Хоттингера для глубинного управляемого процесса культивирования бактерий;
- разработка управляемого процесса глубинного культивирования штаммов Salmonellae typhimurium № 415 и Salmonellae choleraesuis № 370;
- оптимизация защитной среды высушивания, используемой при изготовлении вакцины против сальмонеллеза свиней;
- отработка оптимальной схемы применения вакцины в опытах на лабораторных животных (доза, кратность, интервал);
- испытание на безвредность, реактогенную и антигенную активность экспериментальных серий вакцины на супоросных свиноматках и поросятах послеотъемного периода в условиях свиноводческих хозяйств.
- изготовить опытно-промышленные серии вакцины;
- определить эффективность ее применения в животноводстве;
1.3. Научная новизна. Разработан единый подход к изучению биотехнологических закономерностей промышленного производства бактерийных препаратов на разработанной модели производства вакцины против сальмонеллеза свиней. Научно обоснованы разработка и совершенствование промышленной биотехнологии производства бактериальных препаратов ветеринарного назначения. Эффективность их использования экспериментально подтверждена на сложной биотехнологической модели. Применение математических методов планирования эксперимента позволило определить оптимальные, с точки зрения накопления сальмонелл, значения концентраций компонентов питательных сред и параметры управляемого режима культивирования бактерий, оптимизировать состав защитных сред для сублимационного высушивания. С использованием разработанного подхода усовершенствована технология промышленного производства сухой вакцины против сальмонеллеза свиней.
Разработаны дозы и кратность применения сухой вакцины против сальмонеллеза свиней.
Изготовлены опытно-промышленные серии сухой вакцины против сальмонеллеза свиней разных возрастных групп, проведены испытания препаратов в хозяйствах.
1.4. Практическая ценность работы. Применение разработанных технологий производства сухой вакцины против сальмонеллеза свиней дает большой иммунологический, экономический и социальный эффект.
Использование предложенного подхода позволяет разрабатывать и совершенствовать технологию промышленного производства и других бактерийных препаратов. Использование его в научных экспериментах и практике позволяет снизить количество опытов, затрат на эксперименты, что ведет к снижению стоимости разработки технологических процессов и технологии в целом.
По разработанной технологии изготовлены опытно-промышленные серии вакцины против сальмонеллеза свиней на Сумской и Ставропольской биофабриках. Вакцина успешно прошла испытания в свиноводческих хозяйствах Костромской области и Краснодарского края. В течение 6 месяцев случаев заболевания поросят, иммунизированных данной вакциной и поствакцинальных осложнений не зафиксировано.
Использование разработанных технологий производства сухой вакцины против сальмонеллеза свиней способствует сокращению времени культивирования и повышения накоплению жизнеспособных клеток сальмонелл, стабильности по биологическим свойствам и лучшую сохраняемость в процессе длительного хранения и использования.
По разработанной технологии изготовлены промышленные серии вакцины. В производственных испытаниях подтверждена их безопасность и эффективность. В хозяйствах проведены научно-производственные опыты и производственные испытаний на супоросных свиноматках и поросятах послеотъемного периода. Результаты испытаний включены в Методическое положение «Опытно-промышленный регламент производства сухой вакцины против сальмонеллеза свиней, 2011 г.,» Методическое положение «Инструкция по применению сухой живой вакцины, 2011 г.», утвержденные на секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 2011 г.
Промышленный выпуск вакцины против сальмонеллеза на ФГУП Ставропольской биофабрике по усовершенствованной технологии за 2008 – 2012 гг. составил – 15848360 доз и на ФГУП Щелковский биокомбинат - 5 млн. 440 тыс. доз.
Результаты исследований включены в 2 методических положения, утвержденных на секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии академиком-секретарем А.М. Смирновым.
Результаты исследования и методология может быть использована разработчиками и производителями лекарственных средств для ветеринарии, а так же в качестве учебного пособия студентов - биотехнологов.
Результаты работы легли в основу разработанной во ВНИТИБП «Концепции научного обеспечения создания и развития региональных биологических предприятий по производству препаратов для защиты животных, растений и средств, повышающих эффективность функционирования агропромышленного комплекса Российской Федерации» и одобренной Президиумом Россельхозакадемии, протокол №4 от 21.04.2011г.
1.5. Основные положения диссертационной работы, которые выносятся на защиту
1. Разработка биотехнологической модели промышленного производства вакцины против сальмонеллеза свиней.
2. Оптимизированный состав питательных сред для глубинного управляемого процесса культивирования сальмонелл.
3. Оптимизированный управляемые процессы глубинного культивирования сальмонелл.
4. Оптимизированные защитные среды высушивания, используемые при изготовлении вакцин против сальмонеллеза.
5. Разработанная дозировка и кратность применения сухой живой вакцины против сальмонеллеза свиней.
6. Определение иммунологической эффективности применения разработанной сухой живой вакцины для свиней разных возрастных групп.
1.6. Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены:
- в виде ежегодных отчетов по темам государственных заданий на заседаниях ученого совета и методической комиссии ГНУ ВНИТИБП РАСХН (1992 - 2012 гг.);
- на секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2009-2012 гг.);
- на Международных конгрессах («Биотехнология-2010, 2011», Москва, 2010, 2011 гг.);
- на Всероссийских и Международных конференциях, проводившихся в Москве, Санкт-Петербурге, Омске, Краснодаре, Курске, Сергиевом Посаде, Покрове, Тюмени, Щелково, Харькове, Ялте, Минске, Витебске, Алматы (1992 – 2012 гг.).
1.7. Публикации. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 61 научной работе, в том числе в 18 статьях в изданиях по перечню, рекомендованному ВАК Минобрнауки России для публикации материалов докторских диссертаций. По результатам исследований получено 4 Патента РФ.
1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах компьютерного текста и состоит из введения; обзора литературы; собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты исследований; обсуждения результатов; выводов; практических предложений; списка литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована таблицами и рисунками. Список литературы включает 327 источников, из которых 253 отечественных и 74 зарубежных авторов. В приложении представлены таблицы расчетов коэффициентов уравнений, копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
1.9. Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы, постановке цели и задач исследований, методологическом обосновании путей решения поставленных задач, непосредственном планировании экспериментов и выполнении исследований, обобщении и интерпретации результатов, разработке нормативной документации. Автор принимал личное участие в изготовлении и контроле опытных серий препаратов, в подготовке научных публикаций и разработке нормативных и методических документов.
1.10 Благодарности. Автор выражает благодарность научному консультанту, директору ГНУ ВНИТИБП, академику Россельхозакадемии, академику НААН Украины Самуйленко А.Я. В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие и оказывали практическую и консультативную помощь сотрудники института Школьников Е.Э., Раевский А.А., Соловьев Л.Б., Анисимова Л.В., Коротеева Л.А., Скичко Н.Д., Нежута А.А. - за что выражаю им сердечную благодарность.
Распространенность сальмонелл в природе
Родовое название Salmonella было принято Международным соглашением на основе приоритета в соответствии с интернациональными правилами ботани-ческой номенклатуры в 1933 г. Первая схема Кауфмана-Уайта в 1934 г. насчитывала 44 представителя рода Salmonella. Особенно быстро нарастало их число после 2-1 мировой войны и в на-стоящее время оно приближается к 2000. Первые выделявшиеся серовары сальмонелл получали, как правило, назва-ние болезни, которую они вызвали у человека (S.typhi, S.paratyphi, A, S.paratyphi B, S.paratyphi C, S.enteritidis или у животных (S.abortus-bonis, S.abortus-ovis, S.abortus-equi, S.cholerae-suis, S.typhimurium, S.typtisuis) [261, 266, 267, 278].
Многие из сероваров получали название страны, города или квартала горо-да, в которых они были выделены, или улицы, на которой располагался институт, где был идентифицирован штамм или фамилия лица, выделившего или иденти-фицировавшего серовар. Отдельные серовары получили зоологическое название животного, у кото-рого они были обнаружены, или материала, из которого они были выделены. Число представителей рода сальмонелла продолжает постоянно пополнять-ся и ежегодно в среднем прибавляется около 50 новых сероваров [129, 134, 140, 145, 156, 166, 172, 221, 225, 261, 266, 268, 279]. Сальмонеллы принадлежат к числу микроорганизмов, широко распростра-ненных во всех странах мира, при этом одни из сероваров являются убиквитар-ными (распространенными повсеместно), как, например, S.typhimurium, тогда как другие скорее можно рассматривать как локальные, свойственные определенным регионам. Так, S.berta обнаруживается чаще всего в странах Северной Америки, S.sendai – в странах Дальнего Востока, S.uganda и S.wangata – на Африканском континенте, S.madelia и S.altona – в странах Южной Америки и т.д. [261, 266, 268, 271, 279].
Сальмонеллы являются микроорганизмами, характеризующимися выражен-ной полипатогенностью. Подавляющее большинство известных ныне сероваров патогенны как для человека, так и для различных животных и птиц. Исключение составляют лишь S.typhi, S.paratyphi и S.paratyphi C, являющиеся возбудителями заболеваний только у людей. Что касается S.paratyphi B, то этот серовар, как из-вестно, также является возбудителем инфекции преимущественно у человека, но может вызвать заболевания и даже эпизоотии у молодняка крупного рогатого ско-та и цыплят [182, 196, 208, 216, 226, 238]. Сальмонеллы – мелкие палочки с закругленными концами от 1 до 3 мк дли-ной и 0,5-0,8 ммк шириной, как правило, подвижные благодаря перитрихиально расположенным жгутикам. Некоторые серовары (S.gallinarum, S.pullorum) всегда неподвижны, могут встречаться неподвижные мутанты и среди других сероваров. На питательном агаре – колонии прозрачные, нежные, голубоватые; на сре-де Эндо – слегка розоватые, прозрачные; на среде Плоскирева - бесцветные, но выглядят более плотными и мутноватыми. На ЭМС-агаре сальмонеллы растут в виде прозрачных колоний, иногда с фиолетовым оттенком. На висмут-сульфит агаре почти все сальмонеллы образуют черные колонии с характерным металли-ческим блеском, при этом наблюдается прокрашивание участка среды под коло-нией в черный цвет. Исключение составляют S.paratyphi A и некоторые другие серовары, которые на этой среде образуют светлые, нежные зеленоватые колонии. Следует также отметить, что чашки с посевами на висмут-сульфит агаре необхо-димо просматривать через 24 и 48 ч, чем достигается более четкая дифференциа-ция колоний. Патогенные свойства сальмонелл обуславливаются образованием двух ви-дов токсических продуктов – экзотоксина и эндотоксина. На возможность образо-вания сальмонеллами энзотоксина указывают Д.М.Тетерник, Е.Л.Розет (1964). Экзотоксины – это продукты жизнедеятельности, активно секретируемые в окру-жающую среду. Они имеют белковую природу и разрушаются при нагревании 600С в течение 30 мин, обладают нейтропным и некротизирующим действиями. Под действием формалина (0,3-0,4%) и тепла переходит в анатоксин. Экзотоксин оказывает специфическое действие только на клетки тонкого кишечника. Эндотоксин образуется в результате лизиса клеток после гибели. По дан-ным большинства исследователей, в основном, он обусловливает развитие болез-ни. В состав эндотоксинового комплекса входит липополисахарид (ЛПС), опреде-ляющий специфичность и являющийся важнейшим фактором вирулентности сальмонелл, а также белковые компоненты. Липид А, входящий в состав ЛПС, является центром токсичности всей молекулы (O.Winterist et. al., 1973). Однако, другие исследователи считают, что токсичность эндотоксинового комплекса обу-словлена всеми его компонентами, в том числе и белками (R.W.Kessel et.al., 1988). Эндотоксин не разрушается при кипячении в течение 2-2,5 ч и автоклавировании в течение часа (Ewanns D. et.al., 1973; Moon H. et. al., 1976). Этот токсин вызывает геморрагическое воспаление кишечника, вследствие чего его называют энтеро-токсином. Энтеротоксины у сальмонелл делят на термолабильные и термостабильные по их чувствительности к нагреванию при 600С в течение 10 мин. Энтеротоксины различных грамотрицательных микроорганизмов сходны по биологическим свой-ствам. Факт образования сальмонеллами термостабильных токсических веществ подтвердили И.В.Шур (1970), Э.И.Худяк (1978), А.М.Ахмедов (1983) и др. У некоторых штаммов сальмонелл (S.typhimurium) обнаружен нейротоксин липопротеиновой природы, который входит в состав комплексного О-антигена, но отличается от него по специфичности и термолабильности.
Австралийские ученые также приводят данные о наличии у вирулентных штаммов S.typhimurium и S.enteritidis термолабильного антигена (Buris, Rowlly, 1965). Сальмонеллы также продуцируют экстрацеллюлярные термолабильные токсины, которые участвуют в патогенезе заболеваний (Э.И.Худяк, 1977). Однако мнения ученых по вопросам взаимосвязи между вирулентностью и токсичностью противоречивы. Некоторые исследователи констатировали, что между вирулентностью и токсичностью нет отчетливого параллелизма и что ави-рулентные штаммы сальмонелл образовывали эндотоксин такой же силы, что и вирулентные (Камертон и др., 1960). Это подтверждают Б.А.Матвиенко, Ф.К.Валеева, 1968), А.А.Шур (1970) и др. Другим фактором вирулентности сальмонелл являются адгезины, выпол-няющие особую функцию биологического распознавания и прикрепления бакте-рий. Как правило, адгезины по строению напоминают фимбрии (пили), однако имеются данные о том, что у этих микроорганизмов встречаются также фибрил-лярные адгезины (Burrows, 1976; Ф.Е.Езепчук, 1977; G.M.Jones, 1974). Способ-ность сальмонелл образовывать поверхностные пили, реснички, цитотоксин, эн-теротоксин коррелирует с их вирулентностью (R.A.Finkelstein et.al., 1983; F.C.Koo et.al., 1984).
Физиологическое состояние микроорганизмов в процессе роста и развития при периодическом культивировании
Изучение процессов жизнедеятельности микроорганизмов является пробле-мой, непосредственно связанной с созданием противобактерийных и бактерийных препаратов [15, 19, 30, 45 59, 70 82, 98, 153, 163, 176, 178, 185, 199, 218, 231, 256, 274].
Выращивание микроорганизмов нередко осуществляется с неизвестными, лимитирующими и ингибирующими рост факторами, что затрудняет управление их жизнедеятельностью и осложняет разработку совершенных методов культиви-рования. В этой связи одна из главных задач при разработке условий культивирова-ния заключается в необходимости изучения и учета, в каждом конкретном случае, состояния популяций микроорганизмов, которым присущи как нормальные физио-логические, так и неадекватные реакции, приводящие к стрессу и патологическому состоянию [5, 13, 14, 15, 19, 47, 53, 72, 104, 112, 118, 143, 176, 195, 293]. Хотя ис-следователи не приходят к общему выводу даже в определении понятия «физио-логическое состояние» и критериев его оценки, применение знаний о состояниях популяций и фазах роста во многом определяет успех в разработке процессов куль-тивирования [136, 141, 148, 169, 191, 199, 204, 213, 282, 298]. В процессе периодического культивирования микроорганизмы проходят не-сколько фаз развития: - лаг-фаза или фаза приспособления; - фаза логарифмического или экспоненциального роста; - фаза замедления скорости размножения; - стационарная фаза; - фаза отмирания. За последние годы в связи с быстрым развитием популяционно-физиологического направления в микробиологии появилось значительное число работ, характеризующих физиологическое состояние микроорганизмов в динамике развития культур [14, 15, 19, 32, 53, 57, 70, 82, 98, 102, 109, 116, 124, 137, 151, 167, 199, 244, 276, 281].
После посева инокулята в свежую питательную среду микроорганизмы, как правило, проходят период адаптации и подвергаются воздействию метаболиче-ского сдвига, обусловленного изменениями условий выращивания от истощенной питательной среды к среде с высокой концентрацией питательных веществ, пол-ным отсутствием продуктов обмена и т.д. Затем в процессе лаг-фазы развиваются компенсаторно-приспособительные механизмы, которые приводят к адаптации клеток к заданным условиям, и рост культуры не ограничивается ни недостатком питательных веществ, ни избытком продуктов обмена. В экспоненциальной фазе развития устанавливается максимальная скорость роста, возможная в данных конкретных условиях, т.е. осуществляется наиболее совершенная нормальная фи-зиологическая жизнедеятельность, адекватная условиям выращивания. В процес-се экспоненциальной фазы удельная скорость деления клеток остается приблизи-тельно постоянной. Экономический коэффициент - максимальный. Траты на под-держание жизнедеятельности - минимальные. Однако уже в этой фазе в культу-ральной среде снижается концентрация питательных веществ и начинают накап-ливаться вредные продукты метаболизма. Это приводит к появлению разобщения между ростом и делением клеток, в результате чего для поддержания постоянства удельной скорости деления к концу экспоненциальной фазы микроорганизмам приходится «жертвовать» содержанием макромолекулярных соединений [14, 20].
Затем, с увеличением биомассы, на рост культуры начинает сказываться недос-таточное количество питательных веществ в среде и ингибирующее действие про-дуктов обмена. Компенсаторно-приспособительные механизмы уже не в состоянии поддерживать скорость деления на максимальном постоянном уровне, в результате чего она снижается. Лимитирование или ингибирование роста популяции соответ-ствует состоянию стресса, характеризующегося рядом однотипных изменений функционального и структурного характера, мало зависящих от природы стрессора и вида микроорганизма [14, 16, 19, 24, 40, 70, 98, 176, 178, 185, 193, 203]. В начале фазы замедленного роста наблюдается слабая степень лимитирования или ингиби-рования культуры.
В отличие от экспоненциальной фазы, в фазе замедления роста популяция клеток становится гетерогенной, так как нарастает действие неблагоприятных факторов, которое приводит не только к замедлению процессов роста, но может вызывать отмирание и даже лизис части популяции клеток. По данным И.А. Бас-накьян и соавторов [14, 15, 19], до тех пор, пока лимитирование или ингибирование носит характер неспецифических изменений, т.е. не зависит от вызывающего их фактора, культура находится в состоянии стресса. Более глубокая степень лимити-рования или ингибирования сопровождается уже специфическими изменениями в культуре, т.е. стресс сменяется патологическим состоянием [16, 19, 44].
Фазу замедленного роста сменяет стационарная фаза, в которой прирост биомассы по существу прекращается и интенсивность обменных процессов пада-ет. В течение некоторого времени в этой фазе отдельные клетки продолжают раз-множаться, но этот процесс уравновешивается процессом гибели клеток. Для этой фазы характерна все больше нарастающая гетерогенность клеточной популяции, в которой наряду с отдельными размножающимися клетками, находятся еще живые, но уже потерявшие способность к дальнейшему росту бактерии, а также мертвые и лизирующие клетки [45, 71, 98, 104].
В процессе роста культуры в ней накапливаются разнообразные продукты обмена, а некоторые компоненты питательной среды оказываются полностью ис-черпанными, что приводит к наступлению фазы отмирания. В этот период гетеро-генность популяции возрастает и в культуре помимо нормальных клеток находится много клеток «теней», появляются инволюционные формы, что свидетельствует о неблагоприятных условиях для жизни клеток. Однако, наряду с этим, в культуре имеются отдельные клетки, в течение длительного времени сохраняющие жизне-способность, и при пересеве на свежую питательную среду, они начинают актив-но расти [104, 112, 137, 150, 153].
При культивировании микроорганизмов меняющиеся уровни концентрации лимитирующего фактора (в сторону снижения) и ингибирующего рост (в сторону увеличения) вызывают необратимые изменения, которые приводят к гибели кле-ток. Это состояние популяции характерно для второй половины фазы замедления скорости роста, стационарной фазы и режимов хемостата непрерывного культи-вирования при низких скоростях разбавления. По данным И.А. Баснакьян, период отмирания завершается гибелью всех особей [14, 19].
И.Л. Работнова, отмечая, что при изучении микроорганизмов наиболее рас-пространены периодические культуры, указывает на прогрессивность хемостат-ного непрерывного культивирования. В работах ряда авторов - приводится опре-деление физиологического и патологического состояния бактерий, значения неко-торых показателей процессов культивирования для оценки функционального со-стояния популяции микроорганизмов [15, 19, 25, 70, 104, 177, 179, 181].
Физиологическое состояние микроорганизмов определяется как наиболее со-вершенная жизнедеятельность, адекватная условиям среды и характеризующаяся следующей совокупностью признаков - это прямая связь со средой; увеличение кон-центрации субстрата или продуктов метаболизма, приводящие к увеличению скоро-сти роста; конструктивный и энергетический метаболизмы, сопряженные между собой, что выражается высокими и постоянными значениями экономического ко-эффициента по энергетическому субстрату, затраты этого субстрата на поддержание жизнедеятельности минимальны; удельная скорость роста может быть различной. Это состояние наблюдается в экспоненциальной фазе периодических культур и в ре-жимах турбидостата при непрерывном культивировании. Состояние стресса ха-рактеризуется неадекватными неспецифическими реакциями клеток в ответ на неглу-бокое лимитирование или ингибирование.
Некоторыми исследованиями установлено значение экономического и метабо-литического коэффициентов, как показателей, наиболее четко характеризующих функциональное состояние микроорганизмов в процессе их культивирования. Создана система критериев оценки состояния популяций микроорганизмов, включающая, по-мимо указанных показателей, скорость роста, длительность фаз роста при периодиче-ском культивировании, наличие или отсутствие соответствия скорости роста зна-чениям показателей выхода биомассы, оптической плотности одного миллиарда клеток. Показана правомерность использования этой системы критериев при разра-ботке условий процесса культивирования менингококков [13, 18, 177, 180].
Разработка модели промышленной технологии производства вакцины против сальмонеллеза свиней
Для производства бактерийных препаратов необходимы культура микроор-ганизмов, питательная среда, аппаратура для выращивания и концентрирования, сушка микроорганизмов и проведение вспомогательных операций, средств кон-троля и управления. Для объединения их в биотехнологическую модель, способ-ную эффективно функционировать, нужен алгоритм производства бактериальных препаратов. Технологические процессы, базирующиеся на микробном синтезе, можно представить в виде определенной последовательности стадий, причем большинство из них общие для любого микробиологического производства.
В настоящее время значительно расширился объем научно-исследовательских, опытно-конструкторских и проектных работ по разработке новых микробиологических процессов с применением высокопродуктивных штаммов продуцентов и технологического оборудования нового поколения, по поиску наиболее рациональных режимов технологических этапов производств. Интенсификация промышленной технологии производства биопрепаратов – мно-гоаспектная проблема, ключевым направлением которой на современном этапе наряду со снижением материало - и энергоемкости технологии, с использованием современного оборудования и другими приемами является разработка новых или совершенствование традиционных технологий с переходом на современное обо-рудование с использованием управляемых процессов биосинтеза при применении компьютерных программ средств измерения, контроля и регулирования техноло-гических параметров и потоков веществ.
Решение поставленных задач по изучению биотехнологических закономерно-стей бактерийного производства требует использования математических методов планирования эксперимента при оптимизации технологических процессов. Исполь-зование математических моделей при разработке промышленных технологий ве-дет к сокращению числа дорогостоящих опытов и ускоряет создание оптималь-ных по составу компонентов питательных и защитных сред высушивания, а также обеспечению оптимизации технологических этапов производства и достижению максимально возможного результата в промышленном аппарате на основе дан-ных, полученных на пилотной установке, что сокращает затраты и уменьшает се-бестоимость готовой продукции.
Современный подход к изучению закономерностей промышленной техноло-гии получения бактериальных препаратов заключается в оптимизации параметров критических этапов производства, требует применения математических методов планирования эксперимента в качестве инструмента для создания полного цикла технологии, определения соответствия традиционных технологий требованиям GMP, предъявляемым к технико-технологическим характеристикам производств и оборудованию. Биологическая промышленность - одна из отраслей народного хозяйства, функционирующая наряду с другими отраслями - сельским, лесным хозяйством, транспортом и т.д. Основу деятельности каждого предприятия составляет производственный процесс - процесс воспроизводства материальных благ и производственных от-ношений, производственный процесс является основой действий, в результате ко-торых исходные материалы превращаются в готовую продукцию, соответствую-щую своему назначению. В каждый производственный процесс входят основные и вспомогательные технологические процессы. Технологические процессы, обеспечивающие пре-вращение сырья и материалов в готовую продукцию, называются основными.
Вспомогательные технологические процессы обеспечивают изготовление продукции, используемой для обслуживания основного производства, например, подготовка воды, воздуха и так далее. Разнообразие продуктов производства, видов сырья, оборудования, методов работ и т. п. обусловливает и разнообразие технологических процессов. Техноло-гические процессы различаются по характеру изготавливаемой продукции, ис-пользуемым материалам, применяемым методам и способам производства, орга-низационному построению и другим признакам. Но при всем этом они имеют и ряд признаков, позволяющих объединить различные процессы в группы.
Общепринято технологические процессы разделять на механические, физи-ческие, химические, биологические и комбинированные.
При механических и физических процессах изменяются только внешний вид и физические свойства материала. Химические и биологические процессы приводят к более глубоким превращениям материала, вызывая изменение его первоначальных свойств. Комбинированные процессы представляют собой соче-тание указанных процессов и являются наиболее распространенными в практике.
Технология промышленного производства биопрепаратов представляет со-бой комплекс взаимосвязанных физических, химических, биофизических, биохи-мических, физико-химических процессов. Все эти процессы протекают в боль-шом числе разнотипного оборудования, связанного между собой материальными, энергетическими потоками и образуют технологическую линию. Между обору-дованием на технологической линии происходят технологические процессы, ко-торые можно разделить на стадии.
Изучение иммуногенности двухкомпонентного препарата на белых мышах
Для изучения иммуногенности препарата провели опыт на белых мышах живой массой 14-16 г. С этой целью 80 мышей иммунизировали однократно под-кожно в область спины в дозе 0,5 мкг на мышь. Через 20 дней после введения препарата 40 иммунизированных и 40 неим-мунизированных мышей заразили культурой S.choleraesuis 370. Культуру вводили мышам внутрибрюшинно в дозах 10, 102, 103, 104 микробных клеток в объеме 0,5 мл по 10 мышей (опыт и контроль) на каждую дозу. Аналогично 40 иммунизированных и 40 контрольных мышей заразили культурой S.typhimurium 415 в таких же дозах и таких же объемах. За зараженны-ми мышами наблюдали в течение 14 дней, отмечая при этом число павших. Ре-зультаты обработали по Риду - Менчу, рассчитали ЛД50 для иммунизированных и контрольных мышей. Разница между этими показателями и составляет показатель иммуногенности препарата.
Из данных табл. 21 видно, что ЛД50 культуры S.choleraesuis 370 для имму-низированных препаратом мышей составил 80 микробных клеток, а для кон-трольной 8, а культуры S.typhimurium ЛД50 для опытной группы мышей составила 5000 микробных клеток, тогда как для мышей контрольной (невакцинированной) группы этот показатель был равен 80.
Таким образом, однократная иммунизация мышей двухкомпонентным пре-паратом в дозе 0,5 мкг обеспечивает повышение устойчивости к заражению S.choleraesuis 370 в 10 раз, а к заражению S.typhimurium 415 в 63 раза по сравне-нию с неиммунизированными животными. Следовательно, однократная иммуни-зация препаратом вызывает образование специфической невосприимчивости к сальмонеллезу.
Для изучения реактогенности двухкомпонентного препарата в хозяйстве были выбраны методом случайной выборки 5 свиноматок глубокой супоросности (за 10 дней до ожидаемого опороса) и обследованы на сальмонеллоносительство. После чего этим свиноматкам внутримышечно ввели 15 мг, т.е. 1 иммунизирую-щую дозу сухого препарата, растворенного в 1 мл стерильного раствора хлорида натрия. Параллельно с этим 10 поросятам 35-дневного возраста ввели по 3 мг (0,4 мг на 1 кг массы) сухого препарата, растворенного в 1 мл раствора хлористого на-трия. После иммунизации за всеми животными вели наблюдение в течение 10 дней.
В течение наблюдаемого периода ни у свиноматок, ни у поросят на месте введения препарата не отмечено никакой воспалительной реакции. Температура тела у всех животных была в норме, ни у поросят, ни у свиноматок не наблюдали каких-либо отклонений в состоянии здоровья – все животные были активны и хо-рошо поедали корм. Все свиноматки опоросились в срок, от них получено по 9-10 здоровых поросят.
Данные, полученные в результате эксперимента, свидетельствуют о том, что доза 15 мг для свиноматок и 3 мг для поросят, что составляет 15 и 9 млрд м.к., не вызывает у животных видимой клинической реакции, что указывает на ареак-тогенность препарата.
Для изучения безвредности двухкомпонентного препарата 5 интактным свиноматкам за 16-17 дней до опороса ввели однократно препарат в заведомо за-вышенной дозе 15 мг сухого вещества, что составляет 3 прививные дозы. 10 поро-сятам 35-дневного возраста также ввели однократно завышенную дозу 10 мг пре-парата, составляющая 3 прививных дозы. Препарат вводили внутримышечно в область средней трети шеи. У животных измеряли температуру тела и вели наблюдение за ними в тече-ние 10 дней. Ни у свиноматок, ни у поросят после введения препарата на месте введения не отмечено воспалительной реакции. В течение первых суток у двух из 5 свиноматок отмечено повышение температуры тела до 40,50С. В следующие дни ни у свиноматок, ни у поросят не наблюдали каких-либо отклонений в состоянии здоровья – все животные были активны и хорошо поедали корм.
Все 5 свиноматок опоросились в срок, от них получено по 9-10 поросят, ко-торые не имели никаких видимых отклонений. Эти данные свидетельствуют о том, что 3-х кратные дозы препарата 15 мг (для свиноматок) и 10 мг (для поросят), что соответствует 45 и 30 млрд микроб-ных клеток являлись безвредными.
В опыт для иммунизации двухкомпонентным препаратом взяли 54 (см.табл. 22, 23) супоросных свиноматок и за 18 дней до ожидаемого опороса привили их препаратом внутримышечно в дозе 15 мг сухого вещества на 1 голову. Препарат разводили в 1 мл раствора хлорида натрия. Контролем служили 56 свиноматок, которых прививали трехкратно вакци-ной ППД против паратифа, пастереллеза и диплококкоза (за 35, 32 и 15 дней) и двукратно (за 25 и 15 дней до опороса) вакциной (по схеме хозяйства). Из обоих групп (опытной и контрольной) были отобраны методом случай-ной выборки по 10 свиноматок, от которых перед иммунизацией и через 16 дней после введения препарата взяли кровь (из вены уха) и в ее сыворотке определяли титр агглютининов к антигенам, входящим в состав двухкомпонентного препара-та. Результаты исследований приведены в табл. 22. Как видно из данных табл. 22 перед вакцинацией титры агглютининов в крови животных опытной группы были значительно ниже (1,23±0,01 – 2,73±0,14), чем в контрольной группе (3,21±0,14 – 3,84±0,14). Через 16 суток после вакцина-ции у свиноматок опытной группы титры агглютининов в крови к сальмонеллам достоверно были выше на 1-2 лог, чем в контроле.
Из приведенных в табл. 23 данных видно, что после иммунизации в молози-ве опытных свиноматок титры агглютининов были значительно выше и составля-ли от 11,02±0,21 до 11,52±0,21, тогда как титры агглютининов в молозиве кон-трольных свиноматок составляли от 6,12±0,21 до 10,7±0,10. Разница 2-3 лог более чем существенна (Р 0,005).
Данные табл. 22 и 23 свидетельствуют о том, что перед иммунизацией в крови исследованных свиноматок обнаруживали агглютинины в низких титрах. Это можно объяснить тем, что в условиях крупных свиноводческих хозяйствах эти возбудители постоянно циркулируют среди свинопоголовья. Таким образом, после однократной иммунизации глубокосупоросных сви-номаток двухкомпонентным препаратом обеспечивается образование агглютини-нов в сыворотке крови и молозиве в более высоких титрах, чем при трехкратной иммунизации контрольных свиноматок вакциной ППД.
После рождения и в течение всего подсосного периода (до 35 дней) вели наблюдение за общим состоянием поросят в опытных и контрольных группах, отмечая при этом число заболевших, павших и выбывших по иным причинам.
При вскрытии 70 трупов контрольных и 95 опытных поросят установлено, что в обоих группах в 37-40% случаев причиной падежа явились заболевания же-лудочно-кишечного тракта (гастроэнтериты), в 38-42% респираторные заболева-ния (плевропневмонии), по причине асфиксии (задавленности) отход составил 22% контрольных и 21% опытных. При бактериологическом исследовании трупов павших поросят сальмонеллы не выделяли ни одного раза.
В 35-дневном возрасте поросят обоих групп передали на участок доращива-ния, где было сформировано 3 группы. Поросят первой группы (118 голов) при-вили двухкомпонентным препаратом однократно в возрасте 35 дней, поросят 2-й группы (217 голов) – двукратно в возрасте 35 и 45 дней. Эти две группы были сформированы из поросят, полученных от опытных свино-маток. Препарат вводили внутримышечно в дозе 0,4 мкг на 1 кг живой массы. Су-хой препарат разводили в 1 мл 0,8%-ного раствора хлорида натрия.
Поросят 3 группы (760 голов), полученных от контрольных свиноматок, прививали по схеме хозяйства вакциной ТС-177 в 30-дневном возрасте. В 65-ти и 100-дневном возрасте в сыворотке крови поросят всех групп в РА определяли уровни агглютининов по всем антигенам двухкомпонентного препарата. Полу-ченные данные приведены в таблице 28. Данные табл. 28 свидетельствуют о том, что наиболее эффективной оказа-лась двукратная иммунизация двухкомпонентным препаратом. Уровни агглюти-нинов у поросят этой группы к 60-дневному возрасту были на 2-4 порядка выше, чем у поросят других групп, разница статистически достоверна, так как Р 0,005. К 100-дневному возрасту намечается тенденция к снижению титров, однако соот-ношение их по группам остается прежним, а абсолютная величина титров агглю-тининов у поросят 2-й группы в 100-дневном возрасте на 1 порядок превышает титры агглютининов у поросят 1-й группы в 60-дневном возрасте и 1-3 порядка у поросят 3-й группы в 60-дневном возрасте.
