Содержание к диссертации
Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
2.1. Род Salmonella - общие сведения 10
2.1.1. Мониторинг бактерий рода S almonella 13
2.1.2. Биологические свойства_ 14
2.1.3. Антигенная структура 18
2.2. Сальмонеллезная инфекция голубей 20
2.3. Средства специфической профилактики сальмонеллеза голубей 2.4. Биотехнология и производство вакцин 24
2.4.1. Питательные среды 29
2.4.2. Приготовление посевного материала 33
2.4.3. Глубинное культивирование микроорганизмов 34
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 37
3.1. Материалы и методь 37
3.2. Результаты исследований 40
3.2.1. Мониторинг сальмонеллезной инфекции голубей 40
3.2.2. Клиническое проявление сальмонеллеза голубей 41
3.2.3. Бактериологические исследования на сальмонеллез 43
Определение чувствительности полевых штаммов сальмонелл к антибактериальным препаратам 45
Технология изготовления и контроль вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей 48
1 Питательные среды для культивирования вакцинного штамма 49
2 Подготовка посевного материала 52
3 Глубинное периодическое культивирование вакцинного штамма S typhimurium №3 54
4 Оценка безвредности и иммуногенности вакцины 56
Производственные испытания вакцины в голубеводческих 57
хозяйствах
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 58
ВЫВОДЫ 63
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 63
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 64
ПРИЛОЖЕНИЯ 74
Введение к работе
Актуальность темы
Разведение домашних голубей имеет многовековую историю. Известно, что в Египте уже 5000 лет назад были домашние голуби. Сначала этих птиц просто употребляли в пищу, а затем, узнав об их способности возвращаться к своему гнезду и о большой скорости полета, начали использовать для связи-передачи и получения информации.
Сейчас сохранилось как мясное направление, так и спортивное (почтовые голуби).
И сегодня проблема желудочно-кишечных заболеваний молодняка и взрослых особей голубей является для голубевода первоочередной. Экономический ущерб складывается из падежа части заболевшего молодняка, отставания в росте и развитии переболевшей птицы.
Но помимо потерь от сальмонеллеза среди домашних голубей, нельзя забывать об угрозе здоровью человека. По данным ВОЗ, заболеваемость людей сальмонеллезом за последнее десятилетие возросла шестикратно, а в странах СНГ - в семь раз. Причину заболеваний связывают с поражением продуктов питания животного происхождения патогенными микроорганизмами (E.coli, Salmonella и др.)
Птица как домашняя, так и дикая, в том числе голуби могут являться резервуаром возбудителя сальмонеллезной инфекции. Голуби свободноживущие и имеющие контакт с животными, открытыми водоемами, при заболевании сальмонеллезом, инфицируют окружающую среду, заражая другие виды птицы. Такие животные, естественно, представляют источник опасности для людей, в том числе и при использовании голубиного мяса в пищу.
Гибель от сальмонеллезной инфекции у голубей может достигать 20-25%, нанося значительный экономический ущерб, одновременно являясь возможным источником заражения животных и человека (Вал.В.Гусев, В.В.Гусев 2003г.).
В связи с этим во всем мире уделяется большое внимание разработке различных лечебных препаратов и сальмонеллезных вакцин.
Сложность борьбы с сальмонеллезом определяется быстрой адаптацией возбудителя, как к антибиотикам, так и другим химиотерапевтическим препаратам.
Бесконтрольное применение антибиотиков усугубило ситуацию и способствовало селекции антибиотико устойчивых штаммов микроорганизмов. В ряде голубеводческих хозяйств обнаруживается 100% -ная устойчивость бактерий ко всем применяемым антибиотикам.
Поэтому исследования, посвященные изучению проблемы сальмонеллезной инфекции у голубей, и в первую очередь, ее профилактике, несомненно, актуальны для бактериологов, ветеринарных врачей и голубеводов.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы являлось проведение мониторинга сальмонеллезной инфекции в голубеводческих хозяйствах РФ и совершенствование профилактики этого заболевания с помощью специфических средств.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-провести мониторинг сальмонеллезной инфекции у голубей в РФ;
-разработать технологию производства, методы контроля и применения «Вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей»;
-испытать вакцину в лабораторных и естественных условиях содержания голубей.
Научная новизна работы
Получены новые данные по результатам мониторинга возбудителя S.typhimurium и его роль в эпизоотической ситуации в неблагополучных голубеводческих хозяйствах.
Обоснована необходимость создания эффективной вакцины на основе штамма S.typhimurium № 3.
Показана возможность использования питательной среды на основе панкреатического гидролизата рыбной муки (ПГРМ) вместо мясных переваров без потери урожайности при культивировании сальмонелл.
Созданы 3 экспериментальные партии «Вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей».
Практическая значимость работы
Разработаны технологии изготовления, контроля и применения «Вакцины живой сухой против сальмонеллеза голубей».
Предложена питательная среда для культивирования вакцинного штамма S.typhimurimn № 3 на основе панкреатического гидролизата рыбной муки. Данная питательная среда позволяет снизить себестоимость вакцинных препаратов, по сравнению с теми, которые получены на средах из мясных переваров.
Получены положительные результаты испытания вакцинных препаратов, как на птице в лабораторных условиях, так и на голубях в естественных условиях содержания.
Публикация результатов исследований
По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены:
-на международной конференции: «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов», 5-6 декабря 2002 г Щелково.
-на межлабораторном научном семинаре ГНЦПМ- май 2005г.-Оболенск.
Основные положения диссертации выносимые на защиту
Новые эпизоотологические данные возбудителя S.typhimurium у голубей на территории Российской Федерации, на примере 57 голубеводческих хозяйств в 8 регионах России.
Питательная среда для культивирования сальмонелл на основе ПГРМ. «Вакцина живая сухая против сальмонеллеза голубей»,характеризующаяся низкой остаточной реактогенностью и формированием стойкого специфического иммунитета.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений и приложений. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 7 рисунками. Список литературы включает в себя ИЗ источников, в том числе 83 отечественных и 30 зарубежных.
Род Salmonella - общие сведения
Возбудители сальмонеллезов относятся к роду Salmonella семейства Enterobactenaceae. Родовое название Salmonella было дано этим бактериям Линьером в 1900 г. в честь американского исследователя Дэвида Сэльмона, описавшего в 1885 г. микроорганизм (В. suipestifer), известный теперь как Salmonella choleraesuis и считавшийся первоначально возбудителем чумы свиней. В последующем было установлено, что этот микроорганизм в действительности был лишь нередким спутником вируса - истинного возбудителя чумы свиней (И.В. Голубева и др. 1985; Б.И. Антонов и др. 1986; В.И. Покровский и др. 1999).
Сальмонеллы - большая группа бактерий, классификация которых претерпевала значительные изменения по мере совершенствования знаний об их антигенной структуре и биохимических свойствах, при этом основная дискуссия касалась проблемы рассматривать ли входящих в род Salmonella представителей как виды или типы (В.И. Покровский и др. 1985, 1999; А.Л. Котова и др. 1992; Л.А. Ряпис и др. 1995; M.Y. Popoff и др. 1997; LP. Euzeby 1999; Т. Ezaki и др. 2000; Е. Yabuuchi и др. 2000).
Первым выделившимся сальмонеллам присваивали название по собственному усмотрению исследователей, которые их открывали. В результате чего названия сальмонелл имеют самое разнообразное происхождение (В.И. Покровский 1985; M.Y. Popoff и др. 1997). Так, некоторые серовары отражают название болезни, которую вызывали (Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A,B,C). Другие наименования сочетали синдром с хозяин-специфичностью, которая в части случаев оказалась правильной (Salmonella abortus-ovis, Salmonella abortus-equi), в части -ошибочной (Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis).
Многие серовары получили название страны, города, улицы, реки и прочих географических мест, где они были впервые обнаружены (Salmonella brasil, Salmonella london, Salmonella linton).
Отдельные серовары названы по фамилии специалиста, выделившего или идентифицировавшего его (Salmonella morehead, Salmonella saphra), или в честь известных людей (Salmonella sullivan, Salmonella gilbert). Несколько сероваров получили названия добродетелей (Salmonella charity, Salmonella verity). В отдельных случаях наименования сероваров представлены аббревиатурой (Salmonella anfo - «animalfood», Salmonella chinovum -«Chinese» и «ovum») (A.A. Табаева и др. 2001).
В начале 30-х гг. Кауффман и Уайт предложили разделять сальмонеллы в соответствии с их антигенной структурой; позднее Юинг (1963) предложил классификацию по биохимическим признакам, но у последней было много недостатков; так, например сальмонеллы были отнесены к роду Citrobacter и др. (В.И. Покровский и др. 1999).
Накопление новых данных по геносистематике сальмонелл вызвало необходимость пересмотра классификационных схем, что, в свою очередь, создало ряд проблем в номенклатуре.
Мониторинг бактерий рода S almonella
Сальмонеллы принадлежат к числу микроорганизмов, широко распространенных во всех странах мира, при этом одни из сероваров являются убиквитарными (распространенными повсеместно), как, например S. typhimurium, тогда как другие скорее можно рассматривать как локальные, свойственные определенным регионам. Так, S. berta обнаруживается чаще всего в странах Северной Америки, S. sendai - в странах Дальнего Востока, S. Uganda и S. wangata - на Африканском континенте, S. madelia и S. altona - в странах Южной Америки и т. д. (И.В. Голубева и др. 1985).
Из множества сальмонелл в нашей стране зарегистрировано около 45
серотипов, принадлежащих к серогруппам А, В, Сі, Сг, D\, Fb что облегчает лабораторную диагностику сальмонеллезов (Ф.З. Андросов и др. 1981).
Патогенные типы сальмонелл поражают многие виды животных, однако имеются обособленные варианты, вызывающие инфекции только у одного вида, иногда с выраженным тропизмом к определенным тканям и органам (сальмонеллы аборта овец и лошадей и др.) (Б. А. Матвиенко 1982).
Среди животных наиболее распространены:
-у крупного рогатого скота - S. dublin, S. typhimurium, S. enteritidis;
-у свиней - S. choleraesuis, S. typhimurium или S. typhisuis, S. dublin, S. muenchen, S. arizonae;
-у овец - S. abortus ovis, S. typhimurium;
-у лошадей - S. abortus equi;
-у птицы - S. gallinarum-pullorum; S. typhimurium, S. enteritidis, S. heidelberg, S. anatum, S. haifa, S. infantis, S. london, S. gartneri;
-у пушных зверей - S. typhimurium, S. choleraesuis, S. dublin (Ф.З. Андросов и др. 1981; Б.И. Антонов и др. 1986; Ю.Ф. Борисович и др. 1987; Н.А. Ковалев и др. 1988; К.Б. Бияшев 1992; Э.П. Карева и др. 2003; Б.Ф. Бессарабов 2004).
Материалы и методь
При производстве диагностикумов, вакцинных препаратов и проведении бактериологических исследований широко используют питательные среды.
Первоначально микроорганизмы и клетки тканей культивировали на естественных средах, представляющих собой экстракты из растительного или животного материала; в качестве примеров можно назвать виноградный сок, молоко, кукурузный экстракт, пептон и сыворотку. Подобные среды обладают одним недостатком - неопределенностью состава и, следовательно, значительной вариабельностью. Первые шаги к определению состава сред для культивирования были сделаны Пастером (L. Pasteur 1869), который ввел полусинтетическую среду (частично известного состава).
Ученик Пастера Ролэн (M.J. Raulin 1869) впервые применил среду полностью известного состава для выращивания культуры Aspergillus niger. Работа Ролэна была совершенной в том отношении, что он определил пищевые потребности не только качественно, но и количественно, выразив их в виде выхода биомассы (экономического коэффициента) (С.Дж. Перт 1978).
Одним из основных факторов, определяющих рост, размножение и синтез микроорганизмов или различных биологически активных веществ являются питательные среды и их состав.
Элементы питания, необходимые для роста клеток, можно подразделить на следующие группы:
-источники основных элементов;
-источники элементов, требуемых в меньших количествах;
-аминокислоты;
-витамины и гормоны;
-источники микроэлементов (А.Я. Самуйленко и др. 2000).
При подборе состава питательных сред для культивирования микроорганизмов следует учитывать множество факторов. Один из них связан со стехиометрией роста микроорганизмов и количеством биомассы, которое необходимо получить в процессе культивирования. Основой расчетов является материальный баланс, связанный с превращением в процессе клеточного роста низкомолекулярных органических и неорганических соединений в биомассу. Для синтеза заданного количества биомассы в систему культивирования необходимо ввести достаточное количество питательных веществ (реагентов), взятых в определенном соотношении (С. \аутоииіидр. 1981).
