Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Необходимость создания вакцины для высокоспепифичной иммунотерапии инфекции ВПЧ 10
1.2. Принцип действия вакцины для иммунотерапии заболеваний, ассоциированных с ВПЧ 6, 11, 16и18 типов 14
1.3. Белки Е7 - их структура и функции 15
1.4. Белок HSP-70 -структураи функции 18
1.5. Примеры получения фьюза E7-HSP-70 19
1.6. Производство рекомбинантных белков в S. cerevisiae в промышленных условиях 20
2. Собственные исследования 43
2.1. Материалы и методы исследований 43
2.2. Результаты исследований 49
2.2.1. Разработка процесса культивирования штаммов - продуцентов
гибридных рекомбинантных белков E7(11)-HSP70, E7(6)-HSP70 и Е7(16) HSP70, E7(18)-HSP70 49
2.2.1.1. Описание штаммов-продуцентов 49
2.2.1.2. Обоснование общей стратегии процесса культивирования на основании проведенного анализа
2.2.1.3. Оценка ростовых свойств и продуктивности штаммов-продуцентов. 53
2.2.1.4. Выбор модельного штамма для проведения исследований 57
2.2.1.5. Разработка этапа накопления биомассы 57
2.2.1.6. Этап экспрессии целевого белка з
2.2.1.6.1. Питательная среда иусловия культивирования этапа экспрессии целевого
белка 75
2.2.1.6.2. Выбор оптимального способа индукции и углерод содержащего субстрата... 7 8
2.2.1.6.3. Анализ пр отестир ованных способов инду кции 87
2.2.1.6.4. Оптимизация этапа биосинтеза путем математического моделирования 89
2.2.1.6.5. Апробация двухстадийной подпитки на штаммах-продуцентах SCR-E7(18)-HSP70HSCR-E7(11)-HSP70, SCR-E7(6)-H SP70 114
2.2.2. Разработка способа дезинтеграции 119
2.2.2.1. Выбор состава лизирующего буфера 119
2.2.2.2. Влияние температуры на стабильность целевого продукта 120
2.2.2.3. Выбор соотношения лизирующий буфер - биомасса 122
2.2.2.4. Влияние давления и количества циклов дезинтеграции
2.2.3. Очистка субстанции гибридных рекомбинантных белков 127
2.2.4. Изготовление готовых лекарственных форм терапевтических вакцин против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и против рака шейки матки 130
2.2.5. Технологическая схема производства терапевтических вакцин 131
2.2.6. Предвалидапия технологического процесса
1 3. Обсуждение полученных результатов 136
4. Выводы 141
5. Практическое использование полученных результатов.. 142
6. Рекомендации по использованию научных выводов 143
7. Список литературы
- Белки Е7 - их структура и функции
- Производство рекомбинантных белков в S. cerevisiae в промышленных условиях
- Обоснование общей стратегии процесса культивирования на основании проведенного анализа
- Изготовление готовых лекарственных форм терапевтических вакцин против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и против рака шейки матки
Белки Е7 - их структура и функции
Вирус папилломы человека (ВПЧ) - это семейство ДНК вирусов, включающее в себя около 200 типов вирусов, которые обладают заметным тропизмом по отношению к тканям эпителия [145]. Несмотря на сходное строение генома, разные типы ВПЧ поражают эпителий на различных областях тела. Около 40 типов ВПЧ инфицируют аногенитальную область и слизистую оболочку полости рта. ВПЧ является наиболее распространенным вирусом, передаваемым половым путем. Например, в США каждый год им заражаются 6,2 миллиона человек [211]. Основываясь на клиническом прогнозе развития заболевания, типы ВПЧ делят на «ВПЧ низкого риска» и «ВПЧ высокого риска» [152].
«ВПЧ низкого риска» или неонкогенные, к которым относятся типы 6 и 11, могут вызвать доброкачественные или малоопасные аномалии шейки матки, доброкачественную эпителиальную гиперплазию (возникновение аногенитальных кондилом, папиллом) и заболевание дыхательных путей - рекуррентный респираторный папилломатоз (РРП) [130].
«ВПЧ высокого риска» или онкогенные, к которым относятся типы 16 и 18, могут привести к неоплазии аногенитальной области, в том числе раку шейки матки, вульвы, влагалища, пениса и ануса, а также некоторым видам рака ротоглотки [95, 159, 209]. Среди последствий инфекции ВПЧ, ассоциированных с онкологическими заболеваниями, самым серьезным является рак шейки матки. В 2008 году в мире было зафиксировано более чем 500 000 случаев заболевания и 275 000 смертей, вызванных раком шейки матки [82, 159]. В Российской Федерации заболеваемость раком шейки матки находится на высоком уровне - 14 случаев на 100 000 взрослого женского населения (для сравнения в США этот показатель составляет 9 случаев на 100 000). Ежегодно в России впервые выявляется около 12-13 тысяч случаев заболевания раком шейки матки; 8 тысяч женщин умирает от этого заболевания. При этом аналогичный показатель смертности в США составляет только 3,5 тыс. женщин в год при сопоставимом количестве заболевших. Причиной этого является скрининг, проводимый в США и направленный на выявление ранних форм заболевания [11, 38-41].
Инфекции ВПЧ высокого риска обнаруживаются почти во всех случаях рака шейки матки; около 70% случаев рака шейки матки в мире связано с типами 16 и 18 [55, 89]. Хотя хроническая инфекция ВПЧ высокого риска считается необходимым условием для развития рака шейки матки, она не является достаточным условием, так как у подавляющего большинства женщин, инфицированных ВПЧ высокого риска, рак не развивается [90, 112, 148].
Генитальные инфекции ВПЧ, в первую очередь передаются путем генитального контакта, обычно (но не обязательно) посредством полового контакта [213]. Большинство инфекций ВПЧ являются временными и бессимптомными и не вызывают никаких клинических проявлений. Исследования показали, что более 90% новых случаев инфицирования ВПЧ, в том числе и ВПЧ высокого риска, самоизлечиваются или становятся недетектируемыми в течение двух лет. Исчезновение инфекции обычно происходит в первые 6 месяцев после инфицирования [113, 148, 149, 180].
Неонкогенными формами проявления инфекции ВПЧ являются аногенитальный кондиломатоз и рецидивирующий респираторный папилломатоз (РРП).
Практически все случаи аногенитального кондиломатоза - возникновение кондилом в аногенитальной области у мужчин и женщин - связаны с инфицированием ВПЧ низкого риска. Примерно за 90% случаев этого заболевания ответственны ВПЧ 6 и 11 типов, за оставшиеся 10 % случаев - ВПЧ 42 и 54 типов [4, 24].
Заболеваемость аногенитальным кондиломатозом наиболее высока среди женщин в возрасте 15-24 лети мужчин в возрасте 20-29 лет [212]. Показатель заболеваемости аногенитальным кондиломатозом в некоторых регионах России достигает 120 - 150 человек на 100 тыс. населения. Кондиломы у детей часто появляются в результате инокуляции вируса при рождении [31, 44, 175, 214].
Аногенитальный кондиломатоз обычно развивается примерно через 2-3 месяца после заражения ВПЧ. Однако, не все у всех лиц, инфицированных ВПЧ 6 и 11 типов, развиваются остроконечные кондиломы. Кондиломы аногенитальной области поддаются лечению, хотя многие (20-30%) спонтанно регрессируют [190].
Клинические проявления остроконечных кондилом многообразны: в некоторых случаях они ограничиваются объемным образованием в перианальной области, в других - появляются жалобы на кровотечение, зуд, дискомфорт. Течение заболевания длительное, нередко осложняющееся присоединением вторичной инфекции [7, 12, 31].
Несмотря на отсутствие летальных случаев, аногенитальные кондиломы наносят существенный вред здоровью, снижают качество жизни пациентов и часто рецидивируют независимо от типа лечения [6, 9, 19, 21, 74, 103].
РРП является редким заболеванием, при котором в верхних дыхательных путях, в частности в гортани, образуются рецидивирующие папилломы. Выделяют две формы респираторного рецидивирующего папилломатоза: юношеский (с началом заболевания либо в младенческом возрасте, либо в возрасте 11-12 лет) и взрослый (возникающий в возрасте 30-40 лет и старше 60 лет) [5]. Юношеская форма, как полагают, возникает в результате передачи инфекции ВПЧ в перинатальный период от матери к ребенку во время родов. Отмечено, что более чем у 75% больных симптомы РРП возникают до 5 лет, а пик заболеваемости приходится на детей первого (22,8 %) и второго (23,6 %) годов жизни [34].
Производство рекомбинантных белков в S. cerevisiae в промышленных условиях
Дезинтеграция биомассы и осветление лизата. Биомассу продуцента размораживали в течение 6 часов при температуре +4 С и диспергировали в лизирующем буфере ЛБ (100 мМ Tris-HCl рН 8.0, 30 мМ имидазол, 500 мМ NaCl, 4 М мочевины, 0.1 % полисорбата 20, 1 мМ EDTA, 5 мМ дитиотрейтола, 2 мМ PMSF, рН 8.0) в соотношении биомасса: буфер 1:3. Суспензию клеток разрушали в дезинтеграторе APV 1000 (APV, Дания) при давлении 950 бар. В начале каждого цикла суспензия циркулировала в системе стакан дезинтегратора - камера разрушения - охлаждающий стеклянный теплообменник на протяжении 1,5 мин. Затем клеточную суспензию собирали в охлаждаемую льдом колбу, охлаждали до температуры 8-10 С и проводили следующий цикл разрушения. Общее число циклов дезинтеграции определялось результатами микроскопии (не менее 95% разрушенных клеток) и равнялось 7-8. Клеточный гомогенат осаждали на проточной центрифуге Heraeus Stratos (Thermo, Германия) при 15 000 об/мин и скорости протока 25 мл/мин при температуре +4 С. Супернатант фильтровали с помощью фильтра Sartopore 2 диаметром пор 0,22 мкм.
Биохимическая очистка. Очистку проводили на хроматографе АКТА Purifier 100 (GEHealthcare) с применением металл-хелат аффинной, ионообменной и гельфильтрующей хроматографии.
Приготовление вакцины. Сорбция антигенов на адъювант осуществлялась в реакторе. Содержание гидроксида алюминия в вакцине составляло 0,8 мг/мл. Буфер для сорбции антигенов содержал 0,86 мг/мл натрия дигидрофосфата моногидрата, 6,71 мг/мл натрия гидрофосфата додекагидрата, 8,76 мг/мл натрия хлорида, 50 мг/мл сахарозы, 0,005 мг/мл полисорбата 20. В зависимости от вида вакцины концентрация антигенов E7(6)-HSP70, E7(11)-HSP70 составляла 0,2 мг/мл и 0,2 мг/мл, антигенов E7(16)-HSP70, E7(18)-HSP70 - 0,4 мг/мл и 0,4 мг/мл с оотв етс ТВ енно.
Определение степени разрушения клеток биомассы. Степень разрушения визуально контролировалась при помощи фазово-контрастной микроскопии (Carl Zeiss Axiostar, Германия) при увеличении хЮОО. Образец пробы наносился на предметное стекло в количестве 5 мкл, равномерно распределялся по его поверхности так, чтобы он не выходил за пределы покровного стекла. Количество целых клеток подечитывалоеь не менее чем в 10 полях зрения. Подсчет клеток проводили с применением специального программного обеспечения Carl Zeiss Zen. Вычисленное среднее число целых клеток по отношению к контрольному среднему количеству клеток в образце до процедуры дезинтеграции определялось, как степень разрушения в процентах.
Определение клеточной плотности. Клеточная плотность определялась двумя способами: спектрофотометрически измерением значения поглощения света при длине волны 600 нм на спектрофотометре Aquarius СЕ 7500 (Cecil Instruments, Англия) и измерением абсолютно сухого веса (АСВ) клеток из расчета на 1 л культуральной жидкости. Для измерения АСВ образец пробы культуральной жидкости из ферментера объемом 5 мл осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин, ресуспендировали осадок в 5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, промывая, таким образом, клетки от остатков компонентов питательной среды. Суспензию снова осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин. Суспензию полученного осадка в 2 мл 0,9 % раствора натрия хлорида использовали для измерения АСВ в анализаторе влажности Sartorius MA 150 (Германия). Применялся следующий режим высушивания: температура 120 С, время высушивания 20 минут.
Измерение удельной продуктивности. Для анализа использовали образцы культуральной жидкости продуцента гибридного белка, нормированные из такого расчета, что 1 мл образца имел АСВ 10 мг. Образцы центрифугировали в пластиковой пробирке на 1,5 мл 15 минут при 10000 об/мин. Осадок ресуспендировали в 0,1 мл 0,1 М раствора NaOH, инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Вносили в пробирку с биомассой 150-200 мг стеклянных шариков. Добавляли 0,1 мл лизирующего буфера ЛБ (состав см. выше). Биомассу в пробирке дезинтегрировали в аналитическом дезинтеграторе BulletBlender (Next Advance, США) в течение 4 минут при скорости 10 дважды. После 1 часа инкубации при комнатной температуре суспензию осаждали центрифугированием в течение 5 минут при 10000 об/мин. В полученном супернатанте определяли содержание растворимого гибридного белка методом электрофореза в 8% ПААГ в присутствии SDS по Лэммли в восстанавливающих условиях. Анализ интенсивности полос на электрофореграммах и расчет выхода целевого продукта проводился с использованием программы Gene Tools (Syngene, Англия).
Определение концентрации глюкозы и глицерина в культуральной жидкости. Образец культуральной жидкости продуцента гибридного белка осаждали при 4000 об/мин в течение 15 мин. В супернатанте определяли содержание аналита методом ВЭЖХ на аналитическом хроматографе Ultimate 3000 (Dionex,CIIIA) на колонне Polyaminell (YMC, Япония).
Обоснование общей стратегии процесса культивирования на основании проведенного анализа
При утилизации глюкозы или сахарозы культурой S. cerevisiae экономический коэффициент процесса зависит от того проходит ли в культуре брожение или дыхание. При протекании процесса брожения (т.е. при скорости роста от 0,2-0,24 ч" до 0,45 ч" ) экономический коэффициент снижается с 0,55 до 0,145 г сухой биомассы/г субстрата [123]. Брожение приводит к снижению выхода биомассы, нецелесообразному расходу субстрата и неконтролируемому росту культуры, поэтому его следует избегать или, если это невозможно, минимизировать.
Брожение является частью двухфазного процесса - аэробной ферментации. При переносе посевного материала в среду культивирования культура штамма-продуцента утилизирует сахарозу до образования этанола, а затем, по исчерпании сахарозы (или при критических количествах этанола в среде) культура утилизирует спирт, накопленный в среде культивирования в ходе процесса брожения. Катаболизм этанола в S. cerevisiae идет по трем путям, но, в итоге, образуется ацетил-КоА, который далее поступает в цикл трикарбоновых кислот.
При катаболизме 1 молекулы глюкозы в процессе дыхания образуется 38 молекул АТФ, а в процессе аэробной ферментации - 24 молекулы АТФ (из которых 2 АТФ образуются в процессе брожения, а 22 АТФ - при катаболизме этанола). Таким образом, итоговый энергетический выход процесса аэробной ферментации, при котором глюкоза утилизируется до этанола и углекислого газа и далее этанол утилизируется до ацетил-Ко А, в 1,58 раз ниже, чем выход при утилизации глюкозы в процессе дыхания.
Полностью избежать брожения нельзя, так как создать такой низкий расход подпитки по сахару в начале процесса культивирования, чтобы не инициировать при этом брожения, не представляется технически возможным. Кроме того, в процессе дыхания скорость роста культуры не может быть выше 0,2-0,24 ч" [123], что сильно увеличит продолжительность процесса. Процесс брожения можно только минимизировать. Его продолжительность зависит от количества сбраживаемого субстрата, внесенного в начале процесса культивирования.
Протекание процесса брожения сопровождаются изменениями определенных параметров культивирования. Прежде всего, спиртовое брожение является анаэробным процессом, поэтому в ходе процесса брожения уровень растворенного кислорода в среде остается постоянным. Скорость роста культуры при протекании процесса брожения очень высока. Утилизация этанола является аэробным процессом, поэтому уровень растворенного кислорода в среде начинает снижаться, а скорость роста падать. Концентрация этанола в ходе процесса брожения возрастает, а затем падает. Таким образом, определить конец процесса брожения возможно по изменению параметров процесса культивирования.
Существует несколько режимов введения в среду культивирования углероде о держащего субстрата на этапе накопления биомассы. 1. Периодический процесс - весь углероде о держащий субстрат вносится в начале процесса культивирования. Культура последовательно проходит стадии брожения и аэробной ферментации, после чего этап накопления биомассы завершается.
Периодический процесс совместно с подпиточным - часть субстрата вносится в начале процесса культивирования. После окончания брожения начинается подпиточныи процесс, в котором углероде о держащий субстрат подается в лимитирующих количествах. При этом целью стадии брожения является накопление такого пула клеток, который бы дал возможность реализовать подпиточныи процесс с контролируемой скоростью роста и стабильным дыхательным метаболизмом. В данном случае, с учетом особенностей штаммов-продуцентов E7-HSP70 и используемого оборудования, количество биомассы для перехода к подпиточному процессу должно составлять порядка 9-10 г АСВ. Это позволяет использовать для подпитки концентрированный раствор субстрата и избежать разбавления культуральной среды.
Подпиточныи процесс - подпиточныи процесс начинается с начала культивирования, субстрат подается с постоянной скоростью. При данном способе внесения углеродеодержащего субстрата культура последовательно проходит стадии брожения, аэробной ферментации и роста культуры с метаболизмом дыхания в условиях лимитированной подачи сахара. Удельная скорость роста культуры контролируется скоростью подачи сахара. В ряде источников указано, что в процессе, идущем в ферментере большого объема, удельную скорость роста культуры не рекомендуется повышать выше 0,1 ч" [142]. При превышении этого значения появляется риск возникновения локальных областей с повышенной концентрацией сахара и, следовательно, появление процесса брожения. Конечной целью подпиточного процесса является накопление пула клеток достаточного для начала экспрессии целевого белка.
Изготовление готовых лекарственных форм терапевтических вакцин против рецидивирующего респираторного папилломатоза, аногенитального кондиломатоза и против рака шейки матки
Как было показано экспериментально, при температуре культивирования 28 С без подпитки фосфатами этот временной промежуток составляет 7 часов, а при подпитке фосфатами - 6 часов. При внесении глицерина на 22,5-23 часу культивирования экспрессия целевого белка начинается на 28-29 часу.
Потому удержать скорость роста, равной 0,08 ч" , возможно только до 30-31 часа культивирования, после чего скорость роста начинает падать в результате активного процесса экспрессии белка и возросшей нагрузки на клетку.
Повышение концентрации целевого белка выше 15,5 мг/г АСВ приводит к неконтролируемому торможению скорости роста культуры из-за негативного действия целевого белка на клетку и, далее, к падению удельной скорости образования продукта.
Таким образом, граничными условиями нашей модели, обусловленными особенностями роста штамма-продуцента, являются 1) начало подпитки по глицерину в момент времени to=0; 2) неконтролируемое падение скорости роста и ее подъем до величины 0,08 ч" с t0 по t=3,5 час; 3) экспоненциальная стадия роста со скоростью 0,08 ч" с t=3,5 час по t=7,5 час и постепенное снижение скорости роста с t=7,5 часа; 4) неконтролируемое падение скорости роста и удельной скорости образования белка из-за токсического воздействия целевого белка на клетку при концентрации целевого белка 15,5 мг/г АСВ. Для решения нашей оптимизационной задачи мы воспользуемся методом вариационного исчисления. В результате мы получим аналитическое уравнение с неопределенными параметрами, которое описывает оптимальную кривую скорости роста. Пусть X = X(t) - количество биомассы, Р = P(t) количество продукта и /л = ji(t) - удельная скорость роста в момент времени t. Процесс можно описать в следующих уравнениях:
Уравнение (24) определяет только необходимые условия оптимальной траектории fi в ходе процесса с неопределенным параметром с и неопределенным оптимальным значением общего времени подпитки Т. Здесь параметр с и оптимальное значение общего периода подпитки Т зависят от граничных условий.
Нами были установлены начальные граничные условия - fi=0,08 ч" в момент времени t=7,5 часа
Так как мы знаем числовое значение kg, вычисленное с помощью метода наименьших квадратов, то мы можем вычислить значение параметра с, подставляя в аналитическое уравнение значения граничных условий nkq=0,0\. Мы получили числовое значение параметра с = - 6,921.
Из последнего уравнения определяем оптимальную траекторию удельной скорости (і в каждый момент времени t (Рисунок 36). Подробный расчет параметра с и оптимальной траектории ( приведен в Приложении 6. время культивирования, ч
Профиль оптимальной удельной скорости роста ц, рассчитанный путем математического моделирования Моделирование профиля подпитки для реализации оптимального профиля скорости роста и прогнозирование количества биомассы, продукта и объемной продуктивности процесса культивирования.
Для реализации оптимальной кривой роста необходимо рассчитать профиль подпитки. Для оценки адекватности модели нужно спрогнозировать кривые роста биомассы X, накопления продукта Р и объемной продуктивности Разделим общий период подпитки на равные интервалы [tn, tn+1] (1 n N) длиной dt. Таким образом, tn+i = tn + dt (25) Принимаем значение dt = 15 мин. Это обеспечит достаточную точность при расчете параметров процесса.
В каждый момент времени tn мы обозначаем количество биомассы в ферментере как Xn = X(tn) и количество продукта как Pn = P(tn).
В начале подпитки глицерином начальные значения Х(0) = Хо и Р(0) = Ро. Они равны значениям этих параметров, достигнутым в конце фазы накопления биомассы. Сначала мы должны описать рост биомассы. Мы используем простейшую, экспоненциальную модель роста.
Значения qpmax и kq получены из экспериментальных данных, обработанных по методу наименьших квадратов.
Затем мы должны вычислить количество субстрата dS, который должен быть внесен в интервале времени [tn, tn+1\. Чтобы это сделать, допустим, что Sn -это количество субстрата, внесенное в ферментер ко времени tn. Тогда скорость потребления субстрата зависит от количества биомассы и на увеличения биомассы, т.е.
Эти выражения используются, чтобы рассчитать профиль подпитки, необходимый для реализации оптимальной кривой роста и прогнозируемые кривые роста количества биомассы, накопления продукта и объемной продуктивности.
Подробные расчеты в таблицах MS Excel приведены в Приложении 7. В таблице 14 приведены только результаты математического моделирования -итоговые графики прогнозируемых параметров культивирования и оптимизированный профиль подачи подпитки, который необходим для получения прогнозируемых результатов.
