Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Система посттрансляционной модификации SUMO 9
1.1.1. Метаболический путь системы SUMO. Белок-модификатор SUMO и его изоформы 11
1.1.2. SUMO-специфические протеиназы (SENP) 15
1.1.3. Биологические функции системы SUMO 17
1.1.4. Участие системы SUMO в регуляции транскрипции 18
1.1.5. Действие системы SUMO в обеспечении стабильности генома 19
1.1.6. Белки, взаимодействующие с SUMO нековалентным образом 20
1.1.7. Регулирование SUMO модификации 22
1.2. SUMO-протеиназы 23
1.2.1. Семейство SUMO-протеиназ 24
1.2.2. Структура SUMO-протеиназ 27
1.2.3. Субстратная специфичность SUMO-протеиназ 31
1.2.4. Регуляция SUMO протеиназ 37
1.3. Клеточная роль SUMO-протеиназ 40
1.4. Использование SUMO-протеиназы в биотехнологии 44
2. Собственные исследования 54
2.1. Материалы и методы исследований 54
2.1.1. Используемые штаммы 54
2.1.2. Реактивы, растворы 55
2.1.3. Создание штаммов-продуцентов 57
2.1.4. Создание системы клеточных банков 57
2.1.5. Культивирование штаммов-продуцентов 58
2.2. Результаты исследований 62
2.2.1. Создание штаммов-продуцентов SUMO-протеиназ 63
2.2.2. Создание системы клеточных банков промышленного штамма – продуцента, и их характеризация 81
2.2.3. Разработка схемы промышленного культивирования штамма -продуцента ULP – протеиназы 85
2.2.4. Разработка схемы выделения и очистки фермента 109
2.2.5. Исследование стабильности фермента ULP – протеиназы при хранении 118
2.2.6. Технологическая схема производства фермента «Дрожжевая ULP1-протеиназа» 122
2.2.7. Спецификация критериев качества на продукт «Дрожжевая ULP1 – протеиназа» 125
2.2.8. Экономическая эффективность процесса производства фермента ULP1-протеиназа 127
3. Обсуждение полученных результатов 129
4. Выводы 134
5. Практическое использование полученных результатов 134
6. Рекомендации по использованию научных выводов 135
7. Список использованной литературы 136
- Биологические функции системы SUMO
- Регуляция SUMO протеиназ
- Создание системы клеточных банков
- Спецификация критериев качества на продукт «Дрожжевая ULP1 – протеиназа»
Введение к работе
Актуальность темы. Вирусные инфекции человека и животных в последние годы приобретают все более широкое распространение. Эффективным способом лечения является применение иммунобиологических препаратов. Принципиально новым подходом к получению таких препаратов с улучшенными характеристиками является внедрение методов гидролитического расщепления гибридных белков при производстве терапевтических лекарственных средств (Ефимова Н.П., 2002). Высокоэффективной технологией является получение ферментных препаратов с использованием рекомбинантных ДНК в бактериях E.coli, B. Subtilis, и дрожжах S.cerevisiae ввиду их низкой стоимости и безопасности (Monsan P., 1997; Meyer T., 1999).
Ферменты семейства ULP (Ubiquitin like protein) – протеиназ являются необходимым элементом в универсальной технологии получения различных рекомбинантных белков с тэгом SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier protein) (Mller S., 2001), так как обладают способностью расщеплять различные гибридные белки с высокой точностью и эффективностью (Raymond J. Peroutka III, 2011). Представителями данного семейства являются убиквитин-подобные протеиназы дрожжей (ULP1-2) и сентрин-специфичные протеиназы млекопитающих (SENP1-7).
Одним из вариантов применения ULP – протеиназ – является технология производства безметионинового интерферона из гибридного белка – предшественника рекомбинантного SUMO интерферона. На международном рынке в настоящее время существует несколько фирм-производителей, выпускающих фермент ULP – протеиназу, однако продукт, выпускаемый каждой компанией, имеет свои отличительные особенности. Для процесса производства безметионинового интерферона необходима ULP протеиназа, обладающая специфической активностью для конкретного белка - SUMO IFN. Специфическая активность коммерческих протеиназ в отношении данного белка SUMO IFN может сильно отличаться от данных, заявленных в спецификации. Поэтому использование коммерческой протеиназы не гарантирует расщепление SUMO IFN и получение белка безметионинового интерферона и создает необходимость разработки и получения собственного фермента, что является актуальной задачей.
Цель и задачи исследований. Цель исследований - разработка промышленной технологии получения фермента ULP – протеиназы для протеолитического процессинга гибридных белков при биотехнологическом производстве лекарственных средств.
Для выполнения данной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Создать штаммы – продуценты ферментов семейства ULP - протеиназ.
2. Оценить специфичность действия полученных ферментов на целевой белок SUMO – интерферон и отобрать наиболее эффективный продуцент.
3. Подобрать условия культивирования штамма – продуцента и очистки фермента.
4. Разработать технологическую схему и валидировать процесс получения ULP - протеиназы.
5. Разработать технические условия на продукт и обосновать его применение при промышленном производстве безметионинового интерферона.
Научная новизна. Впервые были сконструированы штаммы – продуценты ULP - и SENP – протеиназ на основе штамма – реципиента BL21 (DE3), был разработан метод и определена специфическая активность очищенных ферментов ULP - и SENP – протеиназ в отношении гибридного белка – предшественника SUMO интерферона. Разработана технология промышленного культивирования штаммов – продуцентов протеиназ, экспрессирующих фермент внутриклеточно в растворимом виде. Изучено влияние схемы дезинтеграции клеток на выход целевого фермента. Разработана технология хроматографической очистки фермента, обеспечивающая чистоту конечного продукта 96-98%, подобран компонентный состав, обеспечивающий стабильность фермента в течение 1,5 лет.
Научная новизна работы подтверждена патентом России № 2473683.
Практическая значимость. Данные, полученные в ходе диссертационной работы, позволяют выбрать и охарактеризовать фермент SUMO - протеиназу, обладающую необходимой активностью и специфичностью в отношении целевого гибридного белка. Фермент ULP – протеиназа используется для получения субстанции безметионинового интерферона альфа-2-b на производственной площадке ООО «Фармапарк». Разработан нормативный документ – ТУ на производство фермента ULP1 – протеиназа, продукт внесен в производственный регламент процесса получения субстанции безметионинового интерферона на площадке ООО «Фармапарк».
Личный вклад соискателя. Штаммы – продуценты ULP2, SENP1, SENP7 были созданы автором совместно с к.б.н. Шукуровым Р.Р. Штамм - продуцент ULP1 протеиназы был предоставлен лабораторией экспрессии генов эукариотических систем ФГУП «ГосНИИгенетика» под руководством к.б.н. Д.Г. Козлова. Автором проведена оценка характеристик штаммов-продуцентов и выбор лучшего штамма для дальнейших исследований, создан мастер - банк и рабочий банк штаммов – продуцентов и проведена его характеризация, проведена разработка способа промышленного культивирования, подбор условий, оптимизация и валидация процессов. Исследование и подбор условий проведения хроматографической очистки фермента проведены автором совместно с С.В. Селищевым. Автором была оценена стабильность и активность фермента во времени.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертации представлены и обсуждены на международном симпозиуме «Биофарма: от науки к промышленности» (Черногория, 2013), межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИгенетика» и сотрудников ООО «Фармапарк» (Москва, 2013).
Публикации. По результатам диссертационного исследования опубликовано 5 научных работ, в т.ч. 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК (Биотехнология, Жизнь без опасностей, Биофармацевтический журнал), 1 тезисы научных докладов, 1 патент.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 158 страницах, включает 52 рисунка, 23 таблицы и 4 листа приложений. Список литературы содержит 173 источника, в том числе 158 иностранных авторов. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, описания практического использования результатов, рекомендаций по использованию научных выводов, списка литературы и приложений.
Основные положения и результаты, выносимые на защиту:
-
Протеиназы семейства ULP, экспрессируемые созданными штаммами, проявляют специфическую активность в отношении гибридного белка – предшественника SUMO IFN, процессируя его С-концевую последовательность по пептидной связи между сайтами Gly-Gly и Lys.
-
Промышленная технология получения ULP–протеиназы, включающая культивирование штамма – продуцента в ферментере в объеме 15 л среды, очистку с использованием аффинного сорбента обеспечивает выпуск кондиционного продукта с производительностью не менее 180 мг белка с 1 производственного цикла в течение 6 сут.
-
Использование ULP – протеиназы обеспечивает протеолитический процессинг гибридного белка в соотношении фермент: субстрат 1:3500 в технологии производства безметионинового интерферона.
Биологические функции системы SUMO
Расщепление С-конца белка-модификатора SUMO служит двум разным целям (Рисунок 3): с одной стороны, прекурсоры SUMO необходимо преобразовать в зрелые SUMO путем удаления С-концевого расширения, что, очевидно, требует расщепления линейной пептидной связи и также называется С-концевой гидролазной активностью.
С другой стороны, удаление SUMO из белков-мишеней или обработка цепей поли-SUMO, т.е. осуществление реакции деконъюгации требует расщепления изопептидной связи или изопептидазной активности.
На рисунке 3а показаны карбоксильные (С)-концы Smt3 S.cerevisiae и четыре изоформы SUMO млекопитающих с диглицинновым мотивом, выделены зеленым цветом. Сайт расщепления прекурсора SUMO для образования зрелой формы SUMO обозначен стрелкой.
Химическая структура С-концевого хвоста SUMO-2 показана более подробно; сайт расщепления выделен оранжевым цветом, место расщепления пептидной связи также указанно стрелкой.
На рисунке 3b показана химическая структура связи между терминальным глицином SUMO и лизином субстрата; сайт расщепления протеиназы SUMO выделен оранжевым цветом, расщепляемая изопептидная связь указана стрелкой. Рисунок 3. Активность SUMO-протеиназы по отношению к прекурсорам SUMO (а) и модифицированным SUMO белкам-мишеням(b).
У людей существует шесть так называемых "sentrin-специфических протеиназ" (SENPs): SENP1-3 и SENP5-7 [23,32]. Белки обладают различной специализацией по видам активности не только в отношении созревания SUMO или деконъюгации, но и в отношении различных изоформ SUMO (см. ниже). Их внутриклеточная локализация указывает на наличие непересекающихся функций, а последствия удаления или молчания отдельных протеиназ SENP дают основания предполагать, что их вклад для динамического регулирования процесса модификации SUMO может быть, по крайней мере, так же важен, как и вклад SUMO-лигаз Е3.
В S.cerevisiae существуют две SUMO-протеиназы SENP – Ulp1 и Ulp2 (также называемая Smt4) которые различны по своей локализации и функциям [33,34]. Ulp1 отвечает за расщепление предшественника SUMO и локализуется в ядерных порах. Клетки S.cerevisiae, несущие делецию ulp1, нежизнеспособны и не выживают даже при сопутствующей экспрессии зрелой формы SMT3. Это указывает на то, что отсутствие процессинга предшественников SUMO не является основной причиной нежизнеспособного фенотипа. SUMO-протеиназа Ulp2 локализуется в ядре. Таким образом, две изопептидазы Ulp1 и Ulp2 существуют для взаимодействия с различными субстратами и не могут скомпенсировать отсутствие друг друга. Ниже будет более подробно рассмотрена структура, функции и регулирование протеиназ-SUMO.
Делеционные мутанты по белку-модификатору SUMO или по активирующему ферменту Е1 или конъюгирующему ферменту Е2 нежизнеспособны у почкующихся дрожжей и показывают тяжелые дефекты роста у дрожжей, размножающихся делением. Удаление конъюгирующего фермента Ubc9 у мышей приводит к летальному исходу на ранней стадии эмбрионального развития.
Тем не менее, до сих пор неясно, осуществляет ли белок SUMO некую единую основную функцию. Также нет и единого механизма, который мог бы объяснить все эффекты, оказываемые SUMO на целевые белки. Как и другие посттрансляционные модификации, такие как фосфорилирование, SUMO система участвует в регуляции из множества различных биологических путей [35-41].
Несмотря на разнообразие функций системы SUMO, в настоящее время уже начинают формироваться несколько общих принципов механизма действия. Очевидно, что SUMO наиболее часто действует путем модуляции взаимодействия его целевых белков-мишеней с другими клеточными факторами. Во многих случаях SUMO обеспечивает дополнительный сайт связывания для другого белка, тем самым вызывая ряд нижеследующих эффектов или ориентирует субстрат в определенном месте в клетке. Кроме того, SUMO может предотвратить белок-белковые взаимодействия, блокируя взаимодействие сайтов связывания. Модификация целевого белка частицей SUMO вследствие внутримолекулярного взаимодействия этого целевого белка с фрагментами SUMO индуцирует его конформационные изменения. Как следствие, SUMO модификации могут влиять на внутриклеточную локализацию белка-мишени, его ферментативную активность, стабильность или взаимодействия с другими белками или ДНК. Некоторые аспекты функций системы SUMO, которые изучены к настоящему времени, рассмотрены ниже.
Регуляция SUMO протеиназ
До недавнего времени протеиназы Ulp и SENP были единственными известными классами протеиназ-SUMO. Но не так давно были обнаружены и охарактеризованы еще три класса SUMO-протеиназ человека: DESI1 (desumoylating isopeptidase 1 – деконьюгирующая SUMO изопептидаза 1), DESI2 [87] и USPL1 (ubiquitin-specific protease-like 1 – протеиназа подобная убиквитин-специфической 1) [88], которые имеют мало сходного с последовательностями протеиназ класса Ulp и SENP.
Все три класса представляют собой цистеиновые протеиназы и обладают папаин-подобной структурой. Эти три класса протеиназ-SUMO по своей специфической активности напоминают группу ферментов DUB, отщепляющих убиквитин (deubiquitylating - деконьюгирующая убиквитин), которые делятся на пять структурных классов [89]. Однако, распространение паралогов DUB супер семейства намного больше, чем семейства протеиназ-SUMO. Около 100 протеиназ DUB предсказано для человека, и ни одна из них по своей структуре не напоминает Ulp или SENP протеиназы.
Однако, протеиназа USPL1, как и предполагает ее название, действительно отдаленно напоминает протеиназы класса USP из супер семейства DUB [88]. Протеиназа USPL1 обнаружена у всех позвоночных и некоторых беспозвоночных. Обнаружение протеиназы USPL1 в Danio rerio доказывает то, что функция белка USPL1 как протеиназы SUMO сохраняется в ходе эволюции.
Протеиназы DESI отличаются от известных DUB и Ulp или SENP ферментов. Они относятся к классу протеиназ PPPDE (permuted papain fold peptidases of double-stranded RNA viruses and eukaryotes - пептидазы с папаин-подобной структурой эукариот и вирусов с двухцепочечной РНК) [90], которые не имеют своего представителя в S.cerevisiae, но обнаружены в других грибках, включая Schizosaccharomyces pombe. Функция других протеиназ PPPDE не млекопитающих как SUMO-специфических протеиназ на настоящий момент не исследована. Тот факт, что по своей структуре протеиназа USPL1 больше всего напоминает класс DUB, но фактически является SUMO-специфической протеиназой, подчеркивает важность биохимической характеристики
предполагаемых протеиназ.
Пример тому – характеристика протеиназы Den1 (deneddylase 1), которая первоначально была характеризована как SENP8 вследствие сходства ее последовательности с последовательностью Ulp и SENP, но позднее было установлено, что активность этого фермента связана с белком UBL NEDD8 (neural precursor cell expressed developmentally downregulated protein 8), а не с SUMO [91-93].
Представители SUMO-протеиназ существуют во всех организмах [20,90], однако в некоторых случаях неясно, являются ли эти белки исключительно SUMO-специфическими протеиназами.
Знания о специфичности и функции SUMO-протеиназ, были получены в исследованиях структур протеиназ с высоким разрешением, в том числе комплексов SUMO-протеиназ с белком SUMO или с белком SUMO, конъюгированном с субстратами.
Первой структурой в SUMO-протеиназе, которая была исследована, стал каталитический домен дрожжевой протеиназы Ulp1 в виде комплекса с SUMO в ковалентном переходном состоянии [94]. Исследования показали, что общая архитектура каталитического домена Ulp 1 напоминает домен цистеиновой протеиназы аденовируса AVP 13, как это и было предсказано из сходства последовательностей доменов этих протеиназ.
Специфичность взаимодействия SUMO-протеиназы с частицей SUMO достигается за счет интерфейса SUMO-протеиназы, который включает в себя уникальные гидрофильные взаимодействия и многочисленные солевые мосты. Активный сайт-карман SUMO-протеиназы ориентирует каталитические остатки триады (His-Asp-Cys) для расщепления субстрата и диглициновый мотив С-конца SUMO в мелкий туннель, который образован двумя Trp-остатками. Боковые цепи других, чем Gly, остатков могли бы войти в пространственное столкновение с узким туннелем двух Trp.
Конструкции каталитических доменов SUMO-протеиназ млекопитающих SENP1 и SENP2 подобны доменам Ulp1 и представляют собой Trp туннель и SUMO-связывающую поверхность, которые были описаны для Ulp1 [95-98] (Рисунок 5, b-d).
Как заключают Huang and Schulman [99], протеиназы SENP1 и SENP2 (и, вероятно, другие члены семьи Ulp и SENP) ориентируют расщепляемую связь в цис-конфигурацию, что приводит к излому С-концевого хвоста SUMO в прекурсорах SUMO или изопептидной связи белковой частицы SUMO с белками [96,97]. Эти цис-пептидные связи редки в белках и, как полагают, способны дестабилизировать расщепляемые связи и содействуют расщеплению.
Информация о структурах различных SUMO-протеиназ представлена на рисунке 5. На рисунке 5а показана организация и длины (в аминокислотах) доменов SUMO-протеиназ. Каталитические домены ферментов окрашены пурпурным цветом и на них указаны ключевые остатки His и Cys. Предполагаемые области SIM, нековалентно взаимодействующие с белковой частицей SUMO, помечены звездочками. Области, значение которых важно для внутриклеточной локализации протеиназы, окрашены голубым цветом. Для протеиназы DESI1 (desumoylating isopeptidase 1 – деконъюгирующая SUMO изопептидаза 1) и DESI 2 показаны белки мыши. Для протеиназы USPL1 (ubiquitin-specific protease-like 1 – протеиназа подобная убиквитин-специфической 1) изображен человеческий белок.
Создание системы клеточных банков
Целью исследования являлась разработка и оптимизация промышленного процесса получения фермента ULP – протеиназа, осуществляющего протеолитический процессинг гибридного белка-предшественника SUMO IFN. Для этого необходимо было решить задачи создания продуктивного штамма-продуцента фермента, обладающего наибольшей специфической активностью в отношении целевого гибридного белка SUMO IFN.
Далее нужно разработать технологию культивирования продуцента в колбах и оптимизировать ее по параметрам: подбор питательной среды, индуктора, массообменных характеристик. С целью промышленного производства фермента процесс культивирования масштабируется до ферментера объемом 15-30 л. Для полученной биомассы необходимо было разработать технологию выделения и очистки фермента подбором различных хроматографических параметров.
Очищенный фермент должен быть проверен по выходным характеристикам и стабилизирован. Конечный процесс промышленного производства фермента должен быть стабильным и воспроизводимым. Схема организации производства приведена на рисунке 15.
Основными трудностями, возникающими в ходе разработки процесса, является то, что белок экспрессируется в растворимой форме. Поэтому на всех этапах необходимо контролировать и осуществлять комплекс мер (охлаждение, внесение ингибиторов) по сохранению стабильности и активности фермента.
Создание штаммов-продуцентов SUMO-протеиназ
Для конструирования штаммов-продуцентов ULP – протеиназ были использованы гены двух дрожжевых протеиназ убиквитин подобных белков и двух sentrin – специфичных протеиназ млекопитающих. По литературным данным были выбраны и проверены наиболее эффективные каталитические домены протеиназ, специфически отщепляющих частицу SUMO от N- конца гибридного белка [84, 160]. Дрожжевые последовательности протеиназ ULP1 и ULP2 наиболее специфичны в отношении продуктов гена Smt3 дрожжей S.cerevisiae, использованного при создании гибридного белка SUMO IFN. Каталитический домен протеиназ млекопитающих SENP1 и SENP7 в основном осуществляет деконьюгацию остатков эукариотических SUMO 1 и SUMO 2/3 от гибридных белков, однако также может быть активен в отношении SUMO IFN. Остальные представители данного семейства протеолитических ферментов осуществляют процесиинг белков с SUMO 2/3 и не представляют интереса для данного исследования.
Таким образом, из семейства ULP – протеназ для гидролиза гибридных белков с тэгом SUMO были выбраны следующие ферменты:
1. Ulp1 - дрожжевая протеиназа, находящаяся в нуклеоплазме, взаимодействующая с продуктом гена SMT3, содержит 621 аминокислоты, каталитический домен в центре молекулы (HIS514-CYS580)
2. Ulp2 - дрожжевая протеиназа, находящаяся в нуклеоплазме, взаимодействующая с продуктом гена SMT4, содержит 1054 аминокислоты, каталитический домен в центре молекулы (HIS531-CYS624) 3. SENP1 - протеиназа млекопитающих, локализована в ядерной поре и центре ядра, имеющая сродство и к SUMO1, и к SUMO2/3, содержит 643 аминокислоты, каталитический домен на С-конце (HIS533-Cys602)
4. SENP7 локализуется в нуклеоплазме, имеет сродство и к SUMO1, и к SUMO2/3, содержит 984 аминокислот, каталитический домен на С-конце (HIS794-Cys926)
Для получения ферментов ULP1, ULP2, SENP1, SENP7 – протеиназ были сконструированы рекомбинантные плазмиды на основе вектора _ pET-22-15 (Novagen). Вектор содержит полицистронный лактозный оперон, кодирующий гены метаболизма лактозы, селективный маркер - ген устойчивости к антибиотику ампициллину (ApR) для отбора положительных клонов. В вектор вводили синтетический ген каталитического домена протеиназы (ULP1, ULP2, SENP1, SENP7), в составе которого имеется последовательность 6 остатков гистидина для облегчения выделения и хроматографической очистки фермента.
Для получения фермента ULP2 – протеиназа, кодируемого геном SMT4, была сконструирована плазмида, содержащая последовательность 312 аминокислотных остатков каталитического домена протеиназы ULP2 дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности синезированного гена ULP2 – протеиназы представлена в таблице 6.
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК_рET-ULP 2 осуществляли на основе вектора _ pET-22-15, который является рекомбинантным производным векторов pET-22b (+) и pET-15b(+) (Novagen). В вектор вводили ген каталитического домена протеиназы ULP2 дрожжей Saccharomyces cerevisiae, таким образом, полученная рекомбинантная плазмида содержит целевой фрагмент ДНК размером 975 п.о., и векторную часть размером 5400 п.о. Физическая карта полученной плазмиды представлена на рисунке 16.
Спецификация критериев качества на продукт «Дрожжевая ULP1 – протеиназа»
Для использования фермента ULP – протеиназы в производстве безметионинового интерферона необходимо подтвердить его стабильность и соответствие определяемым параметрам в течение всего срока хранения. Для определения оптимального состава буфера для хранения очищенного фермента ULP – протеиназы были исследованы рН раствора, влияние стабилизатора, буферная система.
Фермент был заложен на ускоренное хранение в различных буферах при различных температурных режимах согласно таблице 19.
Таблица 19. Составы буферных растворов и условия хранения фермента ULP – протеиназы при исследовании стабильности Исследуемыйнастабильностьфермент Параметр исследуемого процесса Температура хранения, 0С Стабилизатор рН Буферная система ULP -протеиназа 2-825 37 500 mМтрегалоза500 mМсахароза50% глицерин 6,0 6,57,0 7,5 8,0 50 mМ NaP 50 mM TrisHCl
Во все образцы был добавлен 0,1% Полисорбат 20, 150 мМ NaCl. После проведенного анализа образцов методом ЭФ и ОФ – ВЭЖХ было установлено, что при температуре 370С фермент в течение 14 дней практически полностью деградирует во всех составах буферов, в присутствии стабилизатора и при различном рН, концентрация его падает с 0,55 мг/мл до 0,05 мг/мл. При 250С на 40 день концентрация падает с 0,57 мг/мл до 0,23 мг/мл (Рисунок 50). Хранение фермента в холодильнике при 2-80С в течение 40 дней обеспечивает сохранение концентрации на начальном уровне - 0,55 мг/мл.
Исследование буферных систем для хранения фермента показало, что использование фосфатной системы 50 mМ NaP лучше трисового буфера, состоящего из 50 mM TrisHCl сохраняет первоначальные свойства белка в растворе – рН варьируется в диапазоне 0,05 – 0,1 в пределах погрешности измерения, чистота фермента уменьшается менее чем на 2%, поэтому в дальнейших экспериментах используют буфер состава 50 mМ NaP, 0,1% Полисорбат 20, 150 мМ NaCl.
Исследование рН буферного раствора фермента ULP - протеиназы в диапазоне 6,0-8,0 при ускоренном хранении при 250С в течение 40 дней показало, что наилучшим значением водородного показателя является 6,5 (Рисунок 51.)
Изменение концентрации фермента в течение 40 дней при 250С при различных водородных показателях буфера
При сравнении стабилизирующих свойств компонентов буфера оценивалась степень чистоты конечного препарата во времени. По данным ЭФ наилучшим стабилизатором является трегалоза, на 40 день при 250С чистота раствора падает на 35% и составляет 0,34 мг/мл, по сравнению с сахарозой, чистота которой падает на 66% и составляет 0,18 мг/мл.
Однако с экономической точки зрения сахароза более выгодна и может быть использована в качестве стабилизатора. Добавление 50% глицерина в буфер для хранения фермента показывает снижение чистоты на 10% при тех же условиях.
В результате подбора оптимального компонентного состава буфера для хранения фермента наилучшей композицией является: 50 mМ NaP, 0,1% Полисорбат 20, 150 мМ NaCl, 50% глицерин. В таких выбранных условиях были заложены промышленные образцы 5 серий фермента ULP – протеиназы для изучения стабильности при минус 200С для определения срока годности продукта.
График стабильности фермента ULP1- протеиназы при хранении в течение 18 месяцев при температуре -200С
Исследование стабильности 5 серий раствора фермента ULP - протеиназы в течение 18 месяцев при температуре минус 200С показало, что на протяжении всего срока годности сохраняется высокая активность фермента в отношении гибридного белка-предшественника рекомбинантного безметионинового интерферона (Рисунок 52.)
В результате исследования была разработана промышленная схема выделения и очистки фермента ULP-протеиназа с выходом по целевому белку 32 мг/л и чистотой более 96-98%, позволяющая получить 180 мг очищенного фермента за один производственный цикл.
Разработанная технология производства включает этапы создания системы клеточных банков, культивирования, дезинтеграции, хроматографической очистки фермента и сохранения его активности в течение заявленного срока годности.
Итоговая схема получения фермента ULP – протеиназа предполагает
создание мастер – банка лиофильно высушенной культуры E. Coli ECR ULP275A, создание из него рабочего банка культуры E. Coli ECR-ULP275А, проверку их жизнеспособности и общей микробной обсемененности, приготовление инокулята в колбах Эрленмейра, культивирование штамма в ферментере объемом 15 л жидкой питательной среды, осаждение биомассы, ее разрушение и хроматографическая очистка с помощью металл-хелатной хроматографии и гель-фильтрации, концентрирование и нормирование готовой субстанции, проверка показателей качества и передачи ее в производство безметионинового интерферона.
Для этого берут 1 ампулу с мастер-банком штамма-продуцента, создают рабочий банк и замораживают его в буфере с 50 масс % глицерина. Инокулят готовят на среде состава: пептон 20 г/л, дрожжевой экстракт – 10 г/л, натрия хлорид – 5 г/л, стерилизованной автоклавированием при 1070С в течение 30 минут. В колбу с инокулятом засеивают 1 мл рабочего банка, выращивают в присутствии антибиотика ампицилина при 28,00С в течение 8 часов.
Готовый инокулят с оптической плотностью 1,5-3,0 о.е. в количестве 1,5 л засеивают в ферментер с 12,9 л жидкой питательной средой того же состава, в присутствии антибиотика ампицилина, и культивируют при 20,00С, перемешивании 300 об/мин и аэрации 10 л/мин в течение 22-25 часов. На 17 час вносят индуктор - раствор лактозы 50%-ный в количестве 300,0 г. Конечная оптическая плотность культуры составляет 10-15 о.е. Далее культуральную жидкость серпарируют, супернатант утилизируют, биомассу пакуют в полиэтиленовые пакеты и хранят при минус 700С.
