Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Интерферон. Общие сведения 11
1.2. Структура интерферона альфа-2 13
1.3. Биологическая активность интерферона альфа-2 16
1.4. Активация синтеза интерферона в клетках 17
1.5. Рецепторы интерферона альфа 17
1.6. Сигналы, вызванные дейс твием интерферона на клетку 20
1.7. Клиническое применение интерферона
1.7.1. Общая информация 23
1.7.2. Терапия хронического гепатита В 23
1.7.3. Терапия хронического гепатита С 24
1.7.4. Терапия волосоклеточной лейкемии 24
1.7.5. Терапия саркомы Капоши
1.8. Требования качества к интерферон - содержащим препаратам 25
1.9. Недостатки использования нативного интерферона альфа
1.10. Создание лекарственных препаратов с пролонгированным дейст- 28
вием
1.10.1. Способы пролонгирования действия белковых молекул 28
1.10.2. Пегилирование. Общая информация 30
1.10.3. Химия пегилирования
1.10.3.1. Активированные ПЭГ первого поколения 34
1.10.3.2. Активированные ПЭГ второго поколения
1.10 3.2.1. Активированные ПЭГ второго поколения для модификации аминогрупп
1.10 3.2.2. Активированные ПЭГ второго поколения для модификации 39
пистеинов 1.10.
3.2.3. Активированные ПЭГ второго поколения для модицифкации 40
окисленных карбогидратов 1.10.
3.3. Реверсивное пегилирование 41
1.10.3.4. Гетерофункциональные активированные ПЭГ
1.10.4. Структура активированных ПЭГ 43
1.10.5. Влияние пегилирования на физико - химические и 43 биологические свойства белковых молекул
1.10.5.1. Влияние на гидрофильноеть, молекулярный вес и гидродина- 44 мический радиус 1.10.5.2. Влияние на конформацию 44
1.10.5.3. Влияние на заряд
1.10.6. Клиренс пегилированных препаратов 46
1.10.7. Токсичность ПЭГ 47
1.10.8. Критические параметры реакции пегилирования. Очистка пегилированных белков
1.10.8.1. Очистка пегилированных белков за счет разницы в гидродинамическом радиусе 1.10.8.2. Очистка пегилированных белков за счет разницы в гидрофильности
1.10.8.3. Очистка пегилированных белков за счет разницы в заряде молекулы 1.10.9. Примеры использования пегилированных препаратов в медици- 54
не 1.10.10. Пегилированный интерферон альфа-2 - различные стратегии... 55
1.10.10.1. Пегилированный интерферон альфа-2Ь (ПЕГИНТРОН) 57
1.10.10.2. Пегилированный интерферон альфа-2а (ПЕГАСИС) 60
2. Собственные исследования 65
2.1. Материалы и методы исследований 65
2.1.1. Материалы 65
2.1.2. Аналитические методы
2.1.2.1. Гельфильтрапия на сорбенте Superose 12 66
2.1.2.2. Ионообменная хроматография на сорбенте TSKgel SP-5PW 66
2.1.2.3. Метод обращенно-фазовой хроматографии 67
2.1.2.4. Метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии лаурилсульфата натрия (в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях) с окраской нитратом серебра
2.1.2.5. Определение специфической активности 68
2.1.3. Препаративные методы 68
2.1.3.1. Растворение телец включения предшественника интерферона альфа
2.1.3.2. Процесс ренатурации интерферона альфа-2 69
2.1.3.3. Предварительная очистка интерферона альфа-2 методом катионообменной хроматографии на сорбенте CM Sepharose FF
2.1.3.4. Процесс тонкой очистки интерферона альфа-2 методом катионообменной хроматографии на сорбенте YMC Biopro S30
2.1.3.5. Процесс концентрирования интерферона альфа-2 методом катионообменной хроматографии на сорбенте CM Sepharose FF
2.1.3.6. Перевод очищенного интерферона альфа-2 в буфер хранения 71 методом гель-фильтрационной хроматографии на сорбенте Superdex 75.
2.1.3.7. Процесс пегилирования интерферона альфа-2Ь 71
2.1.3.8. Процесс пегилирования интерферона альфа-2а 72
2.1.3.9. Процесс тонкой очистки пегилированного интерферона альфа- 2Ь
2.1.3.10. Процесс тонкой очистки пегилированного интерферона альфа2а
2.1.3.11. Процесс концентрирования пегилированного интерферона альфа-2 на сорбенте MacroCap SP
2.1.3.12. Перевод очищенного монопегилированного интерферона альфа-2 в буфер хранения методом гель-фильтрационной хроматографии
на сорбенте Sephadex G25
2.2. Результаты и обсуждение 75
2.2.1. Разработка технологии ренатурации телец включений интерферо- 75
на альфа-
2 2.2.1.1. Оптимизация процесса ренатурации телец включений интерферона альфа
2.2.1.2. Исследование влияния окисляющих и восстанавливающих агентов на процесс ренатурации
2.2.1.3. Исследование влияния детергентов на процесс ренатурации... 80
2.2.1.4. Исследование влияния ионной силы раствора, концентрации хаотропного агента и значения рН на процесс ренатурации
2.2.1.5. Исследование влияния дополнительных компонентов на процесс ренатурации
2.2.1.6. Определение оптимальной нагрузки телец включений на ренатурапионный буфер
2.2.1.7. Определение оптимальной продолжительности процесса ренатурации 2.2.1.8. Масштабирование оптимизированного процесса ренатурации... 87
2.2.2. Разработка технологии очистки интерферона альфа-2 88
2.2.2.1. Разработка стадии предварительной очистки интерферона альфа-
2 2.2.2.2. Разработка стадии тонкой очистки интерферона альфа-2 91
2.2.2.3. Стадия концентрирования интерферона альфа-2 96
2.2.2.4. Стадия перевода интерферона альфа-2 в буфер хранения 97
2.2.3. Разработка технологии пегилирования и дальнейшей очистки интерферона альфа-2а и альфа-2Ь
2.2.3.1. Разработка процесса пегилирования интерферона альфа-2Ь 101
2.2.3.1.1. Оптимизация значения рНреакционного буферного раствора.. 103
2.2.3.1.2. Исследование кинетики реакции пегилирования интерферона 105 альфа-2Ь, определение оптимальной температуры
2.2.3.1.3. Определение причины низкого выхода реакции пегилирова- 107 ния
2.2.3.1.4. Оптимизация соотношения белок - ПЭГ в реакционном буфере
2.2.3.1.5. Определение оптимальной концентрации интерферона альфа-2Ь в реакционном буфере 2.2.3.2. Разработка технологии очистки монопегилированного безме- 112
тионинового интерферона альфа-2Ь
2.2.3.2.1. Очистка методом тангенциальной фильтрации 112
2.2.3.2.2. Очистка пегилированного интерферона альфа-2 методом гельфильтрации
2.2.3.2.3. Очистка методом гидрофобной хроматографии 114
2.2.3.2.4. Очистка монопегилированного интерферона альфа-2Ь методом катионообменной хроматографии
2.2.3.2.5. Концентрирование монопегилированного интерферона альфа- 2Ь
2.2.3.2.6. Перевод монопегилированного интерферона альфа-2Ь в буфер хранения
2.2.3.2.7. Сравнение полученного препарата монопегилированного интерферона альфа-2Ь с коммерческим препаратом Пегинтрон
2.2.3.3. Разработка технологии пегилирования интерферона альфа-2а... 123
2.2.3.3.1. Влияние значения рН на процесс пегилирования интерферона альфа-2а
2.2.3.3.2. Изучение кинетики процесса пегилирования интерферона альфа-2а, определение оптимальной температуры процесса
2.2.3.3.3. Определение причины низкого выхода реакции пегилирования
2.2.3.3.4. Исследование влияния концентрации интерферона на процесс 128 пегилирования
2.2.3.3.5. Определение оптимального соотношения белок - ПЭГ 129
2.2.3.3.6. Изучение влияния структуры растворителя на процесс пегилирования интерферона альфа-2а
2.2.3.4. Разработка технологии очистки монопегилированного интерферона альфа-2а
2.2.3.5. Сравнение полученного препарата монопегилированного интерферона альфа-2Ь с коммерческим препаратом Пегасис
2.2.4. Масштабирование технологии получения субстанции пегилированного интерферона альфа-2Ь и альфа-2а, валидапия процессов
2.2.5. Исследование стабильности полученных препаратов пегилированного интерферона альфа-2а и альфа-2Ь
2.2.6. Экономическая эффективность процесса производства пегилированных форм интерферона
3.Выводы 141
4. Практическое использование полученных результатов
5. Рекомендации по использованию научных
Выводов 6.
Список использованной литературы
- Терапия волосоклеточной лейкемии
- Влияние пегилирования на физико - химические и 43 биологические свойства белковых молекул
- Растворение телец включения предшественника интерферона альфа
- Изучение влияния структуры растворителя на процесс пегилирования интерферона альфа-2а
Терапия волосоклеточной лейкемии
Интерферон альфа-2 - белковая молекула с молекулярной массой около 19,3 кДа и длиной 165 аминоскислотных остатков. Существует два подтипа интерферона альфа-2: интерферон альфа-2Ь и интерферон альфа-2а. Отличие между данными подтипами заключается в одном аминокислотном остатке в позиции 23 (лизин в случае интерферона альфа-2а или аргинин в случае интерферона альфа-2Ь) [112]. Сайт О - гликозилирования находится в позиции 106 (остаток треонина в позиции 106) и отличает интерферон альфа-2 от других интерферонов альфа, не имеющих остатка треонина в 106 позиции [3;93]. Структура интерферона альфа-2 включает два дисульфидных мостика, образованных остатками цистеина в позициях 1 и 98 (мостик Cys 1-98); 29 и 138 (мостик Cys 29-138) [125;126]. При этом показано, что первый из них не задействован в связывании рецептора и, по всей видимости, необходим для поддержания структуры. По данным исследования методом кругового дихроизма в молекуле интерферона альфа-2 около 59 % всех структур приходится на альфа спирали и около 16 % на бета листы [64]. Методами кристаллографии и ядерного магнитного резонанса установлена точная структура белков, относящихся к классу интерферона альфа-2 [24]. Структура интерферона альфа-2 приведена на рисунке 1.
Основа структуры интерферона альфа-2 - пять антипараллельных альфа спиралей (А, В+В , С, D, Е), пересекающихся под углом от 18 до 31 градуса, четыре из которых (А, В+В , С, Е) формируют сердцевину молекулы [103]. Спираль А располагается от 11 до 21 аминокислотного остатка, В - от 52-68, В - от 70 до 75, С - от78 до 100, D - от ПО до 132, Е- от 137 до 157 . Все альфа спирали прямые за исключением спирали В, имеющей ярковыраженный изгиб (около 70С) в положении 69 (остаток тирозина) [103]. Участок спирали В после изгиба принято обозначать как В . Соединение между спиралями осуществляется петлями АВ, ВС, CD и DE. При этом петли ВС, CD, DE относительно просты по своей структуре, их размер составляет2, 6 и 4 аминокислотных остатка, соответственно.
Петля АВ значительно крупнее других петель и более гетерогенна по своей структуре. В частности, в ней выделяют три участка: АВ1 (22-33), АВ2 (34-39) и АВЗ (40-51). Участок АВ1 располагается перпендикулярно к осям спиралей и со единен с N - концом спирали Е путем образования дисульфидной связи между остатками цистеина в положениях 29 и 138. Участки петли АВ1 26-29 и 30-33 формируют две Зю спирали: ЗюА и ЗюВ. Остатки лейцин 26, фенилаланин 27 и лейцин 30 спиралей ЗюА и ЗюВ формируют поверхности, имеющие значительную доступность для растворителей. ЗюВ спираль предшествует участку АВ2 и разворачивает основную цепь на 90 параллельно центральным альфа спиралям. Кон-формация ЗюВ позволяет осуществлять дополнительные взаимодействия с боковыми цепями аминокислотных остатков спирали D. Остатки АВ2 глицин 37, фенилаланин 36 и фенилаланин 38 формируют вытянутую структуру, входящую в гидрофобный кор молекулы. Сразу после участка АВ2 остатки участка АВЗ 40-43 формируют третью Зю структуру - ЗюС. Следующие за структурой ЗюС остатки 44 - 51 соединяют петлю АВ со спиралью В [103].
Гидрофобный кор молекулы интерферона альфа-2 состоит в основном из гидрофобных остатков за исключением шести полярных остатков (Serll, Thrl4, Ser72, Serl50, Serl54, Thrl55) и четырех заряженных боковых цепей (Glu87, Glul41, Argl44, Glul46) [73]. Атом кислорода в позиции у остатка серина 11 способен образовывать водородные связи с кислородом єі остатка глицина 91, в то время как гидроксильные атомы кислорода других полярных аминокислот, входящих в состав гидрофобного кора, формируют водородные связи с карбонильными атомами кислорода основной цепи. Для глутамина в позиции 87 не обнаружено партнеров для образования водородных связей. Боковые цепи глутамина 141 и аргинина 144 стабилизированы за счет образования внутренних солевых мостиков друг с другом и сетью гидрофобных связей с боковой цепью аргинина 22 в случае глутамина 141 или карбонильными атомами кислорода лейцина 12 или глутамина 141 в случае аргинина 144 [59]. О8 атомы глутамина 146 образуют водородные связи с атомом азота основной цепи фенилаланина 36, с Оц атомом тирозина 122 и гуанидиновой группой аргинина 149. Спираль D и петля АВ так же включены в гидрофобный кор за счет гидрофобных остатков (лейцин, изолейцин и валин) в случае спирали D и за счет ароматических колец остатков фенилаланина в случае петли АВ. 1.3. Биологическая активность интерферона альфа-2
Известно, что интерферон проявляет свою биологическую активность за счет взаимодействия со специфическими рецепторами [38;92;116]. В структуре интерферона альфа-2 выделяют несколько областей, ответственных за связывание рецептора: 29 - 35, 78 - 95 и 123 - 140. Участки 29 - 35 и 123 - 140 находятся в непосредственной близости за счет формирования дисульфидной связи между остатками пистеина 29 и 138, соединяющей петлю АВ со спиралью Е [76].
Замена или делепия пистеинов в позициях 29 или 138 значительно снижает биологическую активность интерферона альфа-2. Третий участок 78 - 95 так же ответственен за связывание с рецептором [75]. Более подробное изучение данных участков показало, что участки 29 - 35 и 123 - 140 ответственны в первую очередь за антивирусной активности интерферона альфа-2. Изучение влияния остатков отдельных аминокислот на активность показало, что одним из важнейших является аргинин в позиции 33. Его замена, к примеру, на лизин или аланин приводит к снижению биологической активности в 500 и 2500 раз, соответственно [21]. Более подробное изучение области 78 - 95 показало, что она ответственна преимущественно за антипролиферативную активность [44]. Показано, что регион 81-95 является важным участком, ответственным за антипролиферативную активность интерферон альфа-2 [64]. В своей работе Ни с коллегами методом сайт - направленного мутагенеза установили, что остатки тирозина и изолейцин в позициях 86 и 90 являются ключевыми аминокислотными остатками, ответственными на антипролиферативную активность. В процессе своей работы авторы заменяли тирозин в положении 86 на аспарагиновую кислоту, изолейцин, лизин или аланин. Замена на изолейцин не принесла значительных изменений в антипрофитеративной активности, в остальных трех случаях наблюдалось снижение активности в 100 раз. В противоположность, замена изолейцина в позиции 90 на тирозин значительно увеличивала активность. При этом методом кругового дихроизма было показано, что при описанных заменах значительного изменения во вторичной структуре не происходило, т.е. не было значительных конформационных изменений, способных повлиять на взаимодействие интерферона с рецептором.
Влияние пегилирования на физико - химические и 43 биологические свойства белковых молекул
В процессе выполнения работ по ренатурапии интерферона альфа-2, его дальнейшей очистки, пегилированию и выделению монопегилированной формы использовали следующие реактивы и материалы: полисорбат20 (Fluka, кат. Y0000289 ); полисорбат 80 (Panreac, кат. 146075); цистин (Sigma, кат. 30199); трисгидроксиметиламинометан ( Sigma, кат. 252859 ), мочевина (Sigma, кат. U0631), фенилметансульфонил фторид (Sigma, кат. Р7626); ЭДТА (ApplyChem, кат. А-1103); дитиотреитола (Sigma-Aldrich, кат. 43815); натрия гидроксид (Sigma-Aldrich, кат. 06203); гуанидин гидрохлорид (Scharlau, кат. GU00611000); ацетат натрия (Sigma Aldrich, кат. 32319), хлорид натрия (Panreac, кат. 141659.1214); гистидин (Ajinomoto, кат. 71-00-1); борат натрия (Sigma-Aldrich, кат. 31457), кислота уксусная (Sigma Aldrich, кат. 27255), кислота соляная 37 % (Merc, кат. 1.00317.1000).
Для проведения процесса пегилирования интерферона альфа-2Ь использовали активированный ПЭГ с молекулярным весом 12 кДа и линейной структурой (NOF, кат. ME120TS), интерферона альфа-2а - активированный ПЭГ с молекулярным весом 40 кДа и разветвленной структурой (NOF, кат. LY400NS).
Для проведения хроматографической очистки использовали сорбенты: SP -сефароза (GE Healthcare, кат. №17-1087-01), Superdex 75 (GE Healthcare, кат. 17-1044-04);, MacroCap SP (GE Healthcare, кат 17-5440-01), YMC Biopro S30 (YMC, SPA0S30), Sephadex G25 (GE Healthcare, кат. 17-0032-01). 2.1.2. Аналитические методы
Хроматографию проводят в изократическом режиме на колонне Superose 12 10/300 GL. В качестве подвижной фазы выступает натрий-фосфатный буферный раствор, рН6,5. Скорость потока через колонну составляет 0,5 мл/мин, продолжительность анализа - 50 минут. Температура процесса - комнатная. Детекцию осуществляют спектрофотометрически (длина волны 210 нм).
Предварительно проводят пробоподготовку образца при помощи микроцентрифужного концентратора VIVA SPIN 500. Образец белка разводят водой до концентрации 0,2 мг/мл. После чего переносят 500 мкл разведенного образца в концентратор и центрифугируют до 50 мкл. К 50 мкл сконцентрированного образца добавляют 450 мкл буфера А и центрифугируют до 50 мкл (повторяют процедуру дважды). Полученные 50 мкл раствора переносят в микроцентрифужную пробирку, добавляют туда 450 мкл буфера А, встряхивают на шейкере, после чего производят инжектирование в аналитический хроматограф. Элюируют белок градиентным методом в 100 % буфера В.
Скорость потока 0,5 мл/мин, продолжительность анализа 70 минут. Температура процесса - комнатная Детекцию осуществляют спектрофотометрически (длина волны 210 нм). 2.1.2.3. Метод обращенно-фазовой хроматографии
Колонна: 250x4,6 мм, сорбент октадепил (С18) силикагель, диаметр частиц 5 мкм, размер пор 300 А. Хроматографию проводят в градиентом режиме с использованием буферных растворов: буфер А: 0,1 % ТФУ в воде; буфер Б: 0,1 % ТФУ в ацетонитриле. Скорость потока 1 мл/мин, температура процесса 35±1) С. Градиентная программа:
Метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии лау-рилсульфата натрия (в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях) с окраской нитратом серебра
К образцу белка добавляют буфер для образца, в одном случае содержащий DTT (восстанавливающие условия), в другом случае без DTT (невостанавливающие условия). Электрофорез проводили в 12% полиакриламидном геле. После проведения ЭФ гели окрашивают раствором нитрата серебра. Для этого гели помещают в контейнер с раствором для отмывки гелей, содержащий этиловый спирт и уксусную кислоту и нагревают до 50 - 60 С, выдерживают 5-7 минут при постоянном перемешивании на горизонтальной мешалке. Далее декантируют раствор для отмывки гелей и заливают гели нагретым до 50 - 60 С медицинским асептическим раствором, разбавленным в 10 раз дистиллированной водой, выдерживают 10-15 минут при постоянном перемешивании на горизонтальной мешалке. Сливают медицинский асептический раствор и промывают гели дистиллированной водой в течение 1-2 минут при постоянном перемешивании на горизонтальной мешалке. Погружают гели в реактив нитрата серебра и инкубируют 15-17 минут при постоянном перемешивании на горизонтальной мешалке. Декантируют раствор нитрата серебра и промывают гели тремя сменами воды очищенной в течение 15-20 мин. Переносят гели в проявляющий раствор, содержащий уксусную кислоту и фармальдегид и выдерживают, пока на дорожке геля с нанесенным образцом не становилась видимой основная полоса. Быстро переносят гели в 10% раствор уксусной кислоты и инкубируют не более 10 минут, затем промывают гели водой.
Специфическую активность определяют в культуре перевиваемых линий клеток, чувствительных к интерферону альфа-типа в сравнении с международным стандартным образцом (WHO International Standard INTERFERON ALPHA 2b, (Human rDNA derived) NIBSC code 95/566) против индикаторного вируса. Используют следующую пару клетка/вирус: клетки линии MDBK, индикаторный вирус -вирус везикулярного стоматита.
В стеклянном стакане необходимой вместимости взвешивают навеску телец включений. Далее добавляют воду, исходя из соотношения 2,8 мл воды на 1 г телец включений, концентрированные растворы: 100 mMPMSF до к.к. 1 мМ; 1 М Tris-HCl, рН = 8,0 до к.к. 40 мМ. Полученную смесь гомогенизируют с помощью диспергатора до состояния однородной суспензии, затем добавляют навеску гуа-нидингидрохлорида до к.к. 6 М. Полученный раствор тел включений перемешивают с помощью магнитной мешалки в течение 15 минут при 200 об./мин. К полученному раствору добавляют концентрированный раствор 1 М дитиотреитола до к.к. 3 мМ и инкубируют при комнатной температуре в течение 90 минут. Раствор телец включений фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
В реактор с охлажденным до 2 - 8 С ренатурапионным буфером (20 мМ Трис НС1, рН = 8,0; 0,8 М мочевины; 0,1 % полисорбата 20; 0,5 мМ пистина, рН = 8,5) при перемешивании 120 об/мин, используя перистальтический насос, вносят раствор телец включений, исходя из нагрузки 4,86 г телец на 1 л ренатурациоиного буфера. Вслед за раствором тел включения в реактор, используя насос-дозатор, вносят ULP протеиназу (1 мг протеиназы на 1 г телец включений).
Ренатурат инкубируют при температур 2 - 8 С при постоянном перемешивании на магнитной мешалке со скоростью 80 об/мин не менее 6 часов.
Для остановки процесса ренатурации при перемешивании 80 об./мин добавляют в раствор концентрированный раствор 2,5 М AcNa рН 4,5 до конечной концентрации AcNa около 12,5 мМ. Полученный раствор фильтруют через фильтр с мембраной 0,2 мкм.
Колонну с сорбентом CM Sepharose FF уравновешивают буферным раствором 8 (50 мМ AcNa; рН= 4,5). Далее на колонну наносят раствор ренатурирован ного интерферона альфа-2 в 50 % градиенте воды исходя из нагрузки 10 мг белка на 1 мл сорбента. После нанесения белка колонну отмывают буфером 8 для удаления компонентов ренатурационного буфера. Элюцию целевого белка с колонны осуществляют градиентом буфера 9 (50 мМ AcNa; 500 мМ NaCl; рН = 5,5) в буфере 8 от 0 до 100 % за 1 колоночный объем. Начиная с оптической плотности 200 mAU (UV 280 нм), собирают целевую фракцию. Полученный раствор фильтруют через фильтр с мембраной 0,2 мкм. Процесс хроматографии проводят при температуре 2-8С. Процесс тонкой очистки интерферона альфа-2 методом катионооб менной хроматографии на сорбенте YMC Biopro S30
Колонну с сорбентом YMC Biopro S30 уравновешивают буферным раствором 8. Далее на колонну наносят раствор интерферона альфа-2 с предыдущей стадии очистки исходя из нагрузки 5 мг белка на 1 мл сорбента. После нанесения белка колонну отмывают буфером 8 для удаления несвязавшихся примесных белков. Элюцию целевого белка с колонны осуществляют в изократическом режиме буфером S30 (15 MMHS; 65 MMNaCl; рН= 5,0). Начиная с оптической плотности 100 mAU (UV 280 нм), собирают целевую фракцию. Полученный раствор фильтруют через фильтр с мембраной 0,2 мкм.
Растворение телец включения предшественника интерферона альфа
На следующем этапе стояла задача разработки технологии получения пеги-лированных форм интерферона альфа-2а и альфа-2Ь. Процесс присоединения молекул ПЭГ осуществляется в ходе реакции нуклеофильной атаки, в результате образуются продукты с различным содержанием ПЭГ, из которых целевым является монопегилированная форма интерферона, которая так же отличается гетерогенностью. В случае интерферона альфа-2Ь модификации подвергаются три типа сайтов: N - концевая аминогруппа, остаток гистидина в положении 34, группа лизи-новых изоформ. В случае интерферона альфа-2а модификации подвергаются только остатки лизина. Для проведения реакции пегилирования использовали сукцинимидилкарбонат ПЭГ с молекулярным весом 12 кДа и линейной структу 100 рой в случае интерферона альфа-2Ь и гидроксисукпинимидилэфир ПЭГ с молекулярным весом 40 кДа и разветвленной структурой в случае интерферона альфа-2а.
В процессе анализа литературы было обнаружено, что процесс пегилирования интерферона альфа-2Ь описан только в 1 печатной работе [122]. Условия реакции пегилирования, указанные в данной работе, были использованы в качестве исходной точки эксперимента: состав реакционного буфера: 100 мМ NaP, рН = 6,5; соотношение белок / ПЭГ 1 к 2,6 по массе; продолжительность реакции 70 минут при комнатной температуре; исходная концентрация белка 5 мг/мл. Данные условия проведения процесса были использованы в качестве исходной точки эксперимента.
На первом этапе был проведен поиск поставщика активированного ПЭГ. В качестве двух основных критериев приемлемости качества ПЭГ были выбраны: выход целевой монопегилированной формы и стабильность процесса при использовании различных лотов ПЭГ. Были исследованы активированные ПЭГ производства компаний Biosolve BV (Израиль), Nof corporation (произведенный в условиях GMP) (Япония), Nof corporation (произведенный не в условиях GMP) (Япония), Nanocs (США). Процесс проводили в условиях эксперимента, описанных в литературе. Анализ продуктов реакции пегилирования осуществляли методом аналитической гель-фильтрации. Полученные результаты представлены в таблице 9.
Максимальный выход монопегилированной формы достигается при использовании активированных ПЭГ производства компаний Nof Corporation (GMP) и Biosolve BV. Однако, активированный ПЭГ Biosolve BV продемонстрировали значительный разброс выхода монопегилированной формы (от 30 до 40 %) в зависимости от используемого лота. При использовании ПЭГ Nof Corporation (GMP) разброс в 5 различных лотах составил не более 1,5 %. Таким образом, для дальнейшей работы были выбран активированный ПЭГ производства компании Nof Corporation (GMP).
При проведении процесса пегилирования с выбранным ПЭГ в условиях, описанных в литературе, выход целевой монопегилированной формы составлял 40 % от общего количества продуктов реакции пегилирования. Из 100 мг интерферона и 260 мг ПЭГ в исходных условиях реакции получали 40 мг монопегилированной формы. В составе 40 мг монопегилированной формы входит 15,5 мг ПЭГ и 24,5 мг интерферона альфа-2Ь. Таким образом, эффективность реакции по ПЭГ составляет 6 %, по интерферону 24,5 %. Столь низкая эффективность по ПЭГ является неприемлемой по причине его высокой стоимости.
Еще одной важная проблема заключалась в несоответствии изоформенного состава получаемого в результате реакции продукта изоформенному составу препарата Пегинтрон, что было установлено в процессе анализа изоформенного состава методом аналитической катионообменной хроматографии (данные представлены на рисунке 43).
На рисунке 43 и далее цифрами 1-8 обозначены следующие изоформы: 1-His34; 2 -Y129; 3 - К131+К164; 4 - К121; 5 - К83; 6 -К49; 7 - К112; 8 - СІ.
Как видно из рисунка 43, соотношение изоформ в образцах отличается. К примеру, относительное содержание пика 6 в исследуемом образце значительно больше по сравнению с коммерческим препаратом. Изоформенный состав является важнейшей характеристикой пегилированных препаратов, так как он способен
Анализ изоформенного состава монопегилированного интерферона альфа-2Ь, полученного при проведении процесса в стандартных условиях, и коммерческого препарата Пегинтрон методом аналитической катионооб менной хроматографии на сорбенте TSKgel SP-5PW Низкий выход процесса пегилирования, а так же несоответствие изоформенного состава свидетельствуют о том, что приведенные в литературе параметры проведения реакции пегилирования требуют оптимизации.
Первом шагом на пути оптимизации процесса пегилирования интерферона альфа-2Ь являлась оптимизация изоформенного состава получаемого продукта. Известно, что изоформенный состав целевого продукта зависит от значения рН буферного раствора. В зависимости отрН происходит депротонирование тех или иных групп аминогрупп, что является необходимым условием для проведения процесса конъюгации по данным группам.
К раствору белка с концентраций 2 мг/мл добавляли фосфат натрия до конечной концентрации 100 мМ для создания буферной емкости и доводили значение рН до 6,0 - 7,4 ед. (с шагом 0,2) Соотношение белок - ПЭГ в реакционной смеси составляло 1 к 3 по массе. Процесс проводили в течение 2 часов при комнатной температуре. Реакцию пегилирования останавливали добавлением глицина до конечной концентрации 20 мМ. Оценку изоформенного состава полученного препарата осуществляли с помощью аналитической катионообменной хроматографии. Полученные результаты представлены в таблице 10.
Изучение влияния структуры растворителя на процесс пегилирования интерферона альфа-2а
В результате оптимизации процесса пегилирования были установлены следующие физико-химические параметры процесса: состав реакционного буфера: 50 мМ NaB, 30 % ДМСО; рН = 9,0; соотношение белок / ПЭГ 1 к 2 по массе; продолжительность реакции 10 минут при температуре 2 - 8С; исходная концентрация белка 2 мг/мл. Проведение процесса пегилирования в оптимизированных условиях позволяет увеличить эффективность процесса пегилирования по ПЭГ в 3 раза относительного известных аналогов.
Основной проблемой очистки монопегилированного интерферона альфа-2а является высокое содержание ДиПЭГИНФ формы. Попытка применения параметров хроматографической очистки для пегилированного интерферона альфа-2Ь с применением аналогичных буферных растворов продемонстрировала невозможность удаления ДиПЭГИНФ формы. Результаты пробной очистки монопегилированного интерферона альфа-2а в условиях, разработанных для выделения монопегилированного интерферона альфа-2Ь, представлены на рисунке 64.
ДиПЭГИНФ и МоноПЭГИНФ, а второй представляет собой немодифипирован-ный интерферон альфа-2а, т.е. селективного удаления ДиПЭГИНФ формы не происходит. По этой причине стояла задача разработки подхода, позволяющего удалять ДиПЭГИНФ. Варьирование условий процесса нанесения реакционного раствора на колонну MacroCap SP показало, что нанесение раствора белка в присутствии 30 % ДМСО позволяет селективно получать ДиПЭГИНФ форму в проскоке нанесения. Результаты исследования проскока нанесения (методом гель 133 фильтрации) при варьировании ионной силы раствора в присутствии 30 % ДМСО представлены в таблице 15.
Как видно из приведенных данных, при проводимости раствора белка 5,0 mS/cm, в проскоке нанесения наблюдается 100 % ДиПЭГИНФ. При этом при дальнейшем повышении ионной силы до 6,0 mS/cm в проскок нанесения попадает МоноПЭГИНФ. Содержание МоноПЭГИНФ в проскоке при ионной силе 6,0 mS/cm составляет 10 %. Таким образом, была определена оптимальная ионная сила раствора при его нанесении на сорбент MacroCap SP - 5,0 mS/cm.
Для удаления остаточного количества ДиПЭГИНФ были подобраны условия промывки буферным раствором на основании ацетата натрия, рН = 4,5 в присутствии 30 % ДМСО (буфер МСН: 50 мМ AcNa; 30% DMSO; 0,01 % polysorbate 80; рН 4,50).
Подобранные условия нанесения белка на колонну и дальнейшей промывки позволили на 98 % (относительно исходного количества) удалить ДиПЭГИНФ.
Далее проводили отмывку ДМСО с колонны с адсорбированным белком буферным раствором МСА, после чего осуществляли ступенчатую элюпию МоноПЭГИНФ 35 % буферного раствора МСВ в буфере МСА. Хроматограмма очистки МоноПЭГИНФ представлена на рисунке 65.
Хроматограмма очистки монопегилированного интерферона альфа-2а методом катионообменной хроматографии на сорбенте MacroCap SP В результате процесса очистки получали раствор очищенного монопегилированного интерферона альфа-2а с содержанием целевого белка более 99,5±0,5 % (по данным гель-фильтрации). Элюцию нативного интерферона производили 100 % буфера MCG (50 мМ NaB; 0,01 % polysorbate 80; рН 9,0). После добавления в полученный раствор ДМСО до концентрации 30 % вновь проводили процесс пегилирования. Таким образом, разработанная технология предполагает вторичное использование модифицированного интерферона альфа-2а, что значительно снижает его общие потери.
Полученный раствор очищенного белка далее концентрировали на сорбенте MacroCap SP и переводили в буфер хранения методом гель-фильтрации на сорбенте Sephadex G25. В качестве буфера хранения использовали буферный раствор следующего состава: буфер SE2: 50 MMNaP; 0,01 % polysorbate 80; рН= 5,5. В результате получали раствор очищенного монопегилированного интерферона альфа-2а с содержанием МоноПЭГИНФ более 99,6±0,5 %. 135
На рисунке 66 представлены данные сравнительного анализа полученной субстанции монопегилированного интерферона альфа-2а и коммерческого препарата Пегасис методами ВЭЖХ: катионообменной хроматография - на предмет изоформенного состава МоноПЭГИНФ (А); гель-фильтрации - на предмет содержания близкородственных примесей (продуктов реакции пегилирования) (Б), обращенно-фазовой хроматографии - на предмет наличия примесей с иной природой (В).
Сравнение биологических свойств полученной субстанции с коммерческим препаратом проводили с использованием пары клетка / вирус: клетки почки быка (MDBK) / вирус везикулярного стоматита (VS V).
В результате проведенных испытаний были получены следующие результаты: активность полученной субстанции - 1,5 10 МЕ/мг; активность коммерческого препарата Пегасис - 1,3 10 МЕ/мг. Приведенные данные указывают на то, что полученный препарат обладает схожей антивирусной активностью, что и коммерческий препарат Пегасис.
