Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 14
1.1. Семейство белков человеческого интерферона альфа 14
1.2. Влияние наличия N-кондевого метионина в молекуле интерферона 17 альфа-2 на свойства белка
1.3. Существующие в настоящее время способы получения интерферона
Современные требования к параметрам качества субстанции интерфе
Способы получения интерферона без N-концевого метионина в Е. coli. 26
1.6. Технология получения рекомбинатных белков в Е. coli 31
1.7. Обеспечение безопасности получаемого препарата для пациента 35
2.Собственные исследования 36
2.1. Материалы и методы исследований 36
2.2. Результаты исследований 48
2.2.1. Разработка технологии производства безметионинового интерферона альфа
2.2.1.1. Создание штамм а-продуцента гибридного белка интерферона аль
2.2.1.2. Исследование влияния замены редко встречающихся в Е. coli ами- 53 нокислотных кодонов на уровень экспрессии гена интерферона альфа-2Ь человека в системе транскрипции бактериофага Т7
2.2.1.3. Разработка процесса культивирования штамма-продуцента гибридного белка интерферона альфа-2Ь
2.2.1.3.1. Подбор оптимального состава культуральной среды 59
2.2.1.3.2.Азотсодержащий компонент 61
2.2.1.3.3. Минеральные соли 66
3.4. Факторы роста 51
2.2.1.3.5. Состав питательной среды для культивирования штамма ECR- 74 HSI
2.2.1.3.6. Подбор оптимальных условий культивирования 74
2.2.1.3.7.Подбор схемы получения инокулята 78
2.2.1.3.8. Углеродсодержащие субстраты и индуктор 79
2.2.1.3.9. Проведение установочных серий процесса культивирования в объеме 30л
2.2.1.4. Разработка процесса выделения и очистки тел включений гибрид- 106
ного белка интерферона альфа-2Ь
2.2.1.4.1. Подбор оптимальных условий процесса выделения и очистки телец включений
2.2.1.5. Растворение, ренатурация и гидролиз гибридного белка 116
2.2.1 ..Очистка субстанции человеческого рекомбинантного безметиони- 121
нового интерферона альфа-2Ь
2.2.1.7. Исследование полученного человеческого рекомбинантного альфа- 127 2Ь безметионинового интерферона методом автоматического N-концевого секвенирования
2.2.1.8. Определение подлинности человеческого рекомбинантного безме- тионинового интерферона альфа-2Ь методом пептидного картирования в сравнении с Европейским стандартным образцом
2.2.1.9. Технологическая схема 139
2.2.1.10. Валидация технологического процесса производства человече- 140
ского рекомбинантного безметионинового интерферона альфа-2Ь
2.2.1.12. Экономическая эффективность процесса 150
2.2.1.13. Перенос технологии на производственную площадку ООО «Фар- 152
мапарк» 2.2.2. Разработка технологии производства безметионинового интерферо- 152
на альфа-2а 2.2.2.1. Создание штамма-продуцента гибридного белка интерферона аль- 153 фа-2а 2.2.2.2. Разработка процесса культивирования штамма-продуцента гибридного белка интерферона альфа-2а
3. Обсуждение полученных результатов 158
4. Выводы 162
5. Практическое использование полученных 164 результатов
6. Рекомендации по использованию научных выводов... 165
7. Список литературы
- Существующие в настоящее время способы получения интерферона
- Технология получения рекомбинатных белков в Е. coli
- Разработка технологии производства безметионинового интерферона альфа
- Растворение, ренатурация и гидролиз гибридного белка
Введение к работе
Актуальность темы. Препараты интерферона альфа-2а и интерферона альфа-2b широко используются как в ветеринарии, так и медицине. В медицине их применяют при лечении хронического вирусного гепатита В и С, для лечения онкологических болезней, а также для профилактики гриппа и ОРВИ у взрослых и детей (Фролов А.Ф., 1990; Подымова С.Д., 1996; Malaguarnera M., 1997).
В связи с этим, крайне важно, во-первых, обеспечить внутренний рынок России эффективной субстанцией интерферона альфа-2а и альфа-2b отечественного производства, во-вторых, создать коммерчески рентабельную технологию производства субстанции, основанную на применении современных высокопродуктивных систем экспрессии рекомбинантных белков и новых технологиях культивирования генетически модифицированных бактериальных продуцентов.
При производстве «биоаналога», которым является интерферон альфа-2, для обеспечения эффективности и безопасности продукта, необходимо обеспечить его соответствие установленному стандартному образцу. В международной практике, как указано в Европейской фармакопее 7.0, в качестве стандарта должен использоваться референсный образец CRS (Chemical Reference Substances) интерферона альфа-2a (CRS I0320300) или интерферона альфа-2b (CRS I0320301), рекомендованный Европейским управлением по качеству лекарственных средств (The European Directorate for the Quality of Medicines). Только после проведения испытаний, методология которых указана в Европейской фармакопее 7.0, доказывающих, что полученный интерферон альфа-2 соответствует стандарту, субстанция интерферона альфа-2 может быть признана эффективной и безопасной. Если же полученный продукт отличается от стандартного образца, по каким либо параметрам, например, по аминокислотной последовательности, трехмерной структуре, наличию примесей, то продукт может обладать сниженной биологической активностью, повышенной иммуногенностью и вызывать непредсказуемые побочные эффекты.
Основной проблемой при производстве рекомбинантного интерферона альфа-2 в бактериальном штамме-продуценте является наличие N-концевого метионина, который образуется при синтезе рекомбинантного белка рибосомой бактериальной клетки и может влиять на иммуногенность и стабильность рекомбинантного белка (S. Hermeling, D.J.A., 2004; M. Kamionka., 2011; Ben-Bassat A., Bauer K.; 1987).
В Европейской фармакопее 7.0 указано, что молекула рекомбинатного человеческого интерферона альфа-2 должна состоять из 165 аминокислот, в положении 23 у интерферона альфа-2а находится лизин, у альфа-2b – аргинин, N-концевым аминокислотным остатком должен являться цистеин, связанный дисульфидной связью с 98 цистеином белка. Любой рекомбинантный интерферон альфа-2, чья аминокислотная последовательность отличается от указанной, не может считаться «биоаналогом», аналогичным стандартным международным образцам, в том числе по биологической активности и безопасности.
В России на настоящий момент не существует технологии производства отечественной субстанции рекомбинатного человеческого интерферона альфа-2а и интерферона альфа-2b, удовлетворяющей всем параметрам качества, указанным в Европейской фармакопее, в частности отсутствию N-концевого метионина в молекуле рекомбинантного интерферона альфа-2.
Разработка и реализация на практике эффективной и рентабельной технологии производства отечественной субстанции интерферона альфа-2b и альфа-2a, позволяющей получать продукт, чья себестоимость ниже себестоимости существующих препаратов более низкого качества, является актуальной задачей.
Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований являлись разработка и реализация на практике технологии промышленного производства субстанции интерферона альфа-2b и интерферона альфа-2a, соответствующей современным требованиям качества и безопасности, в том числе требованию отсутствия в белке N-концевого метионина.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Создать и оптимизировать экспрессионные конструкции и штаммы-продуценты гибридного белка предшественника безметионинового рекомбинантного интерферона альфа-2b и альфа-2a человека.
-
Разработать универсальную схему культивирования штаммов-продуцентов, созданных на основе штамма-реципиента E. coli BL21(DE3), дающую высокий выход по биомассе и целевому белку.
-
Разработать способ выделения и очистки телец включений, процесс ренатурации, процесс ферментативного гидролиза гибридных белков предшественников и схему дальнейшей очистки безметионинового интерферона альфа-2b и альфа-2a человека.
-
Оценить соответствие параметров качества полученного безметионинового интерферона альфа-2b требованиям Фармстатьи предприятия, гармонизированной с Европейской фармакопеей 7.0.
-
Провести валидацию и перенос технологического процесса на производственную площадку ООО «Фармапарк».
-
Зарегистрировать субстанцию «Интерферон альфа-2б человеческий рекомбинантный безметиониновый» и внести ее в Государственный реестр лекарственных средств.
Научная новизна. Впервые в России разработана универсальная технология промышленного культивирования штаммов-продуцентов, созданных на основе штамма-реципиента E. coli BL21(DE3) и экспрессионной системы промотора фага Т7 под контролем lac оперона. Эта схема была реализована на ряде штаммов, в том числе штаммах-продуцентах гибридного белка предшественника безметионинового рекомбинантного интерферона альфа-2b и альфа-2a человека.
В ходе работы изучено влияние редко встречающихся в E. coli аминокислотных кодонов на экспрессию гетерологичного белка, ген которого расположен на многокопийном экспрессионном векторе, под контролем регуляторных элементов транскрипции бактериофага T7.
Изучено влияние способа выделения телец включения на протекание процесса фолдинга белка и предложена схема выделения телец включения, дающая минимальные потери продукта при высоком выходе ренатурированного белка.
Впервые изучена реакция ферментативного гидролиза гибридного белка протеиназой Ulp1, ее зависимость от времени протекания, температуры, концентрации фермента и выбраны оптимальные условия ее проведения.
Научная новизна подтверждена патентом № 2473683 на изобретение «Способ промышленного культивирования штаммов E. сoli, полученных на основе штаммов BL21(DE3), несущего ген T7 RNA полимеразы под контролем lacUV5 промотора, с повышенным синтезом биомассы и выходом целевого белка в тельцах включения» (приоритет от 15.12.2011).
Практическая значимость. Полученные в настоящем исследовании данные расширяют возможности оптимизации биотехнологических процессов производства генно-инженерных лекарственных средств.
Разработанная технология была использована для производства субстанции безметионинового интерферона альфа-2b на технологической площадке ООО «Фармапарк».
Была разработана и утверждена нормативная документация на производство субстанции «Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный безметиониновый», фармацевтическая статья предприятия, технологический регламент. Субстанция была зарегистрирована и внесена в Государственный реестр лекарственных средств под № ФС 000434-151112.
Полученная субстанция была использована для производства препарата «ПегАльтевир», представляющего собой пегелированный интерферон альфа-2b, являющийся пролонгированной формой интерферона альфа-2b, который в настоящее время проходит клинические испытания.
Личный вклад соискателя. Автор выполнял работу по оптимизации штамма-продуцента, отбору штаммов, созданию клеточных банков культур, исследованию ростовых свойств штамма, разрабатывал способ культивирования штамма-продуцента, способ выделения и очистки телец включения, процесс ренатурации и ферментативного гидролиза гибридного белка. Автор проводил валидацию технологического процесса на этапах создания рабочего банка, культивирования, выделения телец включения, ренатурации и ферментативного гидролиза и осуществлял перенос этих этапов на технологическую площадку ООО «Фармапарк», организовывал работу по анализу конечной субстанции.
Метод биохимической очистки субстанции был разработан к.б.н В.И. Купцовым, сотрудником отдела медицинской биотехнологии ФГУП "ГосНИИ генетика", работа по конструированию плазмид и трансформации штаммов-продуцентов была проведена сотрудниками лаборатории экспрессии генов эукариотических систем ФГУП "ГосНИИгенетика" под руководством к.б.н Д.Г. Козлова, за что им выражается глубокая благодарность.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты исследований доложены на межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИ генетика» и совещании сотрудников ООО «Фармапарк» (Москва, 2011).
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 2 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК, получен патент № 2473683 на изобретение.
Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 186 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практическое использование результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список литературы (125 источников, из них 106 иностранных авторов). Диссертация включает 45 рисунков, 39 таблиц, 6 страниц приложений.
На защиту выносятся следующие положения и результаты:
-
Промышленная технология получения субстанции рекомбинантного человеческого интерферона альфа-2b и альфа-2a, базирующаяся на использовании оптимизированных по редким кодонам штаммах E. coli с применением экспрессионной системы промотора T7 под контролем lacUV5 оперона, использовании 3-х компонентной подпитки, позволила обеспечить выпуск препаратов, соответствующих Европейской фармакопее 7.0, не содержащих N-концевой метионин, с производительностью не менее (26,2±0,5) г чистого белка с одного производственного цикла процесса культивирования.
-
Универсальный способ культивирования штаммов-продуцентов на основе платформы E. coli BL21(DE3) и промотора фага Т7, реализованный на ряде штаммов, в том числе штаммах-продуцентах гибридного белка предшественника безметионинового рекомбинантного интерферона альфа-2b и альфа-2a человека и обеспечивающий продуктивность процесса (4,8 ± 0,8) г/л и (3,8 ± 0,8) г/л целевого белка соответственно.
-
Внедренный способ производства субстанции позволил увеличить эффективность процесса культивирования в 10 раз и снизить себестоимость продукта на 32% по сравнению с существующей технологией производства метионинсодержащего интерферона альфа-2b.
Существующие в настоящее время способы получения интерферона
УПБ представляют собой метки белковой природы, которые в клетках эукариот используются для мечения других белков, в результате чего последние изменяют свою функциональную активность (54). Помимо убикви-тина в семейство УПБ входят белки SUMO, Rubl, Hubl, ISG15, Apgl2, Apg8, Urml, Ana la и Ana lb. В ходе мечения С-концевые остатки УПБ коньюгируют с є-аминогруппами лизина на поверхности модифицируемых белков (60, 79). В основе большинства способов биотехнологического использования белков семейства УПБ, за исключением APG12 и URM1, лежит их природное свойство синтезироваться в виде удлиненных предшественников, подвергающихся пост-трансляционному процессингу, приводящему к высвобождению универсальной С-концевой последовательности Гли-Гли (72).
В геноме дрожжей Saccharomyces cerevisiae содержится ген SMT3, расположенный между нуклеотидными позициями 1469403-1469708 хромосомы IV (124, 62, 80). Ген SMT3 кодирует белок SMT3 - дрожжевой SUMO (Small Ubiquitine-like protein Modifier). Дрожжевой SUMO синтезируется в виде 101-аминокислотного предшественника, из которых 98 составляют зрелый белок, из которых остатки 13-98 важны для формирования его нативной структуры (78). Эукариотические SUMO, включая дрожжевой SMT3, имеют сходную трехмерную структуру, которая подобна структуре убиквитина и характеризуется плотно уложенными бета-слоями, обернутыми вокруг единственной альфа-спирали (25). Как и другие члены семейства УГТБ предшественники белков SUMO из различных организмов содержат С-концевые удлинения размером от 2 до 12 аминокислотных остатков, которые являются продолжением консервативного С-концевого мотива Гли-Гли (84). Несмотря на различные С-концевые удлинения и довольно низкую степень гомологии аминокислотных последовательностей, например, дрожжевого SUMO и SUMO-1 человека (47%), протеиназа Ulpl дрожжей Saccharomyces cerevisiae способна процессировать оба белковых предшественника (78).
Протеиназа Ulpl относится к семейству цистеиновых протеиназ ULP. Каталитический домен протеиназы Ulpl локализован в С-концевой области белка, в частности, полноценной ферментативной активностью обладает ее С-концевой фрагмент размером 275 аминокислотных остатков (69, 31) (в дальнейшем - протеиназа ULP275). Как и другие члены этого семейства in vivo протеиназа Ulpl осуществляет деконьюгацию SUMO и меченых белков-мишеней, а также отвечает за процессинг нативного предшественника SUMO.
Основными наиболее известными особенностями протеиназы Ulpl, являются две: 1) действие протеиназы Ulpl направлено на гидролиз пептидных или изопептидных связей, соединяющих консервативный С-концевой дипептид Гли-Гли зрелого SUMO и аминокислотный остаток белка-мишени; 2) связываясь с белком-мишенью, протеиназы семейства ULP узнают не отдельный сайт, а трехмерную структуру белков SUMO (86, 29).
Свойство нативной протеиназы Ulpl и ее С-концевого фрагмента распознавать белок SUMO и его производные в составе коньюгатов и предшественников и осуществлять их высокоспецифичный и эффективный процессинг, практически независимо от природы аминокислотного остатка (исключая пролин), соединенного с консервативным С-концевым дипептидом Гли-Гли, лежит в основе искусственно созданных экспрессионных систем. Их отличительной чертой является биосинтез целевых белков в виде гибридных предшественников, содержащих в N-концевой области последовательность белка SUMO или его производных, удаляемых, например, в ходе протеоли-тического процессинга in vitro (72, 73). SUMO-системы используют для увеличения экспрессии белков в клетках эукариотических и прокариотических организмов; увеличения растворимости экспрессируемых белков, облегчения процесса очистки белков за счет включения в их состав аффинных N концевых полипептидов, получения белков с измененными N-концевыми остатками (72).
Для получения безметионинового интерферона альфа 2 протеиназа Ulpl должна гидролизовать пептидную связь между С-концевым дипептидом SUMO и N-концевым цистеином нативного интерферона альфа-2 человека. Эта связь представляет собой соединение консервативного С-концевой дипептид Гли-Гли зрелого SUMO с аминокислотным остатком белка (цистеином), который связан с другими аминокислотными остатками белка одновременно пептидной и дисульфидной связями.
В процессе исследований было показано, что в отличие от протеиназ, активность которых ингибируется наличием дисульфидсвязанных аминокислотных остатков связи в составе сайта процессинга (56, 57), протеиназа ULP275 способна гидролизовать пептидную связь внутри такого сайта. Это позволяет осуществлять эффективный процессинг предшественников безметионинового интерферона альфа-2 человека, в составе которых последовательность белка SUMO соединена пептидной связью с цистеином, соединенном с другими остатками интерферона альфа-2 одновременно пептидной и дисульфидной связями. Вследствие этого ферментативная обработка гибридного предшественника безметионинового интерферона альфа-2 человека протеиназой ULP275 приводит к высвобождению не чистой аминоконцевой последовательности, а N-концевой структуры безметионинового интерферона альфа-2 человека, в состав которой входит корректно замкнутая дисуль-фидная связь.
Технология получения рекомбинатных белков в Е. coli
Вследствие вышеизложенного, в качестве минерального комплекса была выбрана смесь солей со следующими концентрациями 50 тМ Na2HP04, 50 тМ КН2Р04, 25 тМ (NH4)2S04 и 2 мМ MgS04.
В сравнении со стандартной смесью М9 смесь солей (Na2HP04+ КН2Р04 +(NH4)2S04) обладает большей буферной емкостью, что было показано нами в опытах на колбах. При культивировании в течение 14 часов в среде, содержащей М9, рН выросло с 6,59 до 7,04 при конечной оптической плотности 13,05 о.е. В среде, содержащей смесь (Na2HP04+ КН2Р04 +(NH4)2S04), рН выросло с 6,68 до 6,83 при конечной оптической плотности 14,5 о.е.
Соли металлов. В клетке имеется ряд белков с различными функциями, простерическими фуппами которых являются ионы редких металлов. Соли металлов, которые могут иметь значение для активности белков или участвовать во внутриклеточных процессах должны присутствовать в питательной среде.
Ионы железа в концентрации 10 и 100 цМ повышают конечную плотность культуры до 13 о.е., при концентрации 1 цМ плотность увеличивается только до 7,8. Ионы марганца в концентрации 1, 10 и 100 дМ также увеличивают плотность насыщения до 13 о.е., так же как и ионы кобальта в концентрации 1 и 10 iM. Тем не менее добавление ионов кобальта в концентрации 10 цМ вызывает отставание примерно на час в скорости роста культуры, а 100 цМ кобальта ингибируют рост культуры. Ионы цинка оказывают незначительное стимулирующее действие, ионы никеля, молибдена, кальция, меди, селена и бора оказывают еще меньшее действие. Селен нетоксичен в концентрации 10 цМ, но ингибирует рост на при концентрации 100 цМ.
Как оптимальный вариант рекомендуется добавлять соли металлов в среду в следующих концентрациях: 50 цМ железа, 20 цМ кальция, марганца 10 цМ цинка, 2 цМ кобальта, меди, никеля, молибдата, селената и бората. Эти количества не являются токсичными для роста, но могут насытить потенциальные сайты связывания многих целевых белков, учитывая, что целевой белок с молекулярным весом 50 000 Da, продуцируется в количестве 100 мг/л (имеет концентрацию 2 цМ), а белок весом 10 000 Da - соответственно концентрацию от 10 цМ.
При использовании 0,1-2-кратной концентрации смеси металлов, указанной выше, культура растет до максимальной оптической плотности, при 5-кратной концентрации рост слегка тормозится, 10-кратная концентрация заметно замедляет рост, но культура по-прежнему растет до высокой оптической плотности и достигает высокого уровня экспрессии. Если целевой белок имеет известную пару металл-лиганд, этот конкретный металл должен быть добавлен в среду в соответствующей концентрации.
Нужно отметить, что при добавлении в среду смеси солей тяжелых металлов в процессе культивирования штамма ECR-HSI, не было отмечено существенное повышение выхода по биомассе и целевому белку. Это связано с тем, что культивирование проводится на комплексной богатой среде, в составе которой имеются металлы, необходимые для роста.
В случае выращивания культуры на среде полностью определенного состава, состоящей из очищенных компонентов, может оказаться, что такая среда содержит следы металлов в количествах, достаточных для роста до умеренной плотности, но не достаточных для роста до высокой плотности с высоким уровнем экспрессии целевого белка. Добавка металлических микроэлементов при культивировании штамма BL21(DE3) на среде, состоящей из смеси очищенных аминокислот и углеродсодержащих субстратов, повышает конечную оптическую плотность с 4,4 о.е. до 13 о.е. и увеличивает уровень экспрессии в 3 раза (102). В полностью определенной среде дефицит микроэлементов ограничивает рост культуры и уровень индукции целевого белка.
Разработка технологии производства безметионинового интерферона альфа
Тельца включения имеют большую плотность, чем клеточный дебрис, поэтому чаще всего их выделяют центрифугированием. Гомогенат клеток содержит множество компонентов, включая растворимые белки, нерастворимый клеточный дебрис, мембраны, нуклеиновые кислоты и др. Центрифугирование в течение 10-30 минут при 10 000 - 20 000 g обычно успешно се-диментирует тельца включения от растворимого материала. Конкретные условия центрифугирования зависят от размера телец включений и содержания их в гомогенате. Фильтрация также используется для выделения телец включений, но по сравнению с центрифугированием у нее нет явных преимуществ.
Цель второго этапа - отмывки телец включений повысить легкость процесса ренатурации белка и его дальнейшей очистки (upstream).
Отмывка может удалить протеазы и таким образом предотвратить деградацию белка в процессе дальнейшей очистки. Отмывка также может удалить ДНК, липиды, растворимые клеточные белки перед процессом растворения телец включений. Необходимость отмывки телец включений зависит от последующей очистки и чистоты первоначальных телец включений. Большие количества ДНК и других примесей могут присутствовать в тельцах включений, потому отмывка повышает выход в последующем рефол-динге и/или снижает потери белка в результате протеолиза.
При производстве рекомбинантных белков в больших масштабах, отмывка телец включений, удаляя примеси и загрязнения, может повысить воспроизводимость процесса хроматографии и срок эксплуатации дорогостоящих хромотографических сорбентов. Также отмывка может снизить уровень пирогенов, что очень важно для продуктов фармпроизводств.
Исследования влияния таких загрязнений, как ДНК, фосфолипиды, ли-пополисахариды и посторонние белки на ренатурацию белка куриного яичного лизоцима показали, что, кроме посторонних белков в высокой концентрации, они оказывают очень малое действие (23). Добавление определенного количества фосфолипидов даже увеличивало выход в ренатурации. Это объясняется тем, что фосфолипиды могли играть роль детергентов и помогать отделению молекул белка друг от друга.
Качество отмывки телец включений должно подтверждаться не только электрофорезом, но, прежде всего, процессом ренатурации и дальнейшей очистки. Для удаления из телец включений нежелательных загрязнений используются самые разные растворы. Например, добавление лизоцима, ЭДТА и дезоксихолята к гомогенату клеток-продуцентов бычьего соматотропина удаляло большую часть нуклеиновых кислот, липополисахаридов и фофсфо-липидов, не растворяя тельца включения (67).
Тритон Х-100 (82), дезоксихолят (30), мочевина (66) и октилгликозид (ПО) обычно успешно удаляют загрязнения из телец включений. рН, при котором промывают тельца включения, может быть критичным, т.к. при высоком рН тельца включения, как правило, более растворимы. Низкий рН (3-6) малоэффективен, т.к. большинство примесей в тельцах включений не растворимо в этом диапазоне (49). Нужно отметить, что каждый белок в тельцах включения имеет свои собственные уникальные характеристики растворимости, поэтому ни один буфер не будет универсальным для всех видов телец включений.
В тельцах включения присутствуют такие белки, как мембранные белки OmpF, OmpC и OmpA, четыре субъеденицы РНКполимеразы, субъеденицы рибосомы L13, фактор элонгации Ти, канамицинтрансфераза и два белка теплового шока IbA и IbpB. Пока остается неясным вопрос, являются ли эти белки интегрированными частями в тельцах включениях, адсорбированными на поверхностия до или после лизиса клетки или просто частью осадочного материала, появляющегося в процессе седиментации телец включений.
Однако большинство данных говорит о том, что эти примеси появляются в процессе совместной седиментации и слабо сорбированы на поверхности телец включений.
Обнаружено, что эффективное удаление компонентов мембран может быть критичным для очистки, т.к. некоторые протеазы связаны с мембранами. Протеаза OmpT является превалирующей протеазой в тельцах включениях. Показали, что разрезание связи Arg182- Arg18 в соматотропине, при недостаточно эффективной отмывке, обусловлено наличием протеазы OmpT (49). Протеолиз креатинкиназы и ингибитора бычьего трипсина, экспресси-руемых в Е. coli, был очень значительным, пока не была проведена отмывка телец включений раствором тритона Х-100 (120). Удаление клеточных мембран, содержащих протеазы, критично для стабильности целевого белка в процессе очистки.
Включение ингибиторов протеаз в состав отмывочных буферов необходимо для предотвращения нежелательного протеолиза. Выбор ингибитора зависит от вида протеазы. Обычные ингибиторы сериновых протеаз, такие как PMSF, часто добавляются к промывным буферам и гомогенатам клеток. Также используется комплексообразовагель ЭДТА для ингибирования ме-таллозависимых протеаз.
Растворение, ренатурация и гидролиз гибридного белка
Согласно определению, предложенному ВОЗ, под надлежащей практикой производства (GMP) подразумевается «тот объем мероприятий по обеспечению качества продукции, благодаря которому достигаются соответствующая организация производства и стандарты определенного качества с учетом предполагаемого характера использования этих препаратов и требований, оговоренных в выданном разрешении на торговые операции с такой продукцией».
Правила GMP касаются всех аспектов процесса производства, включая производственный процесс, важнейшие технологические этапы, отвечающие установленным требованиям производственные и складские поме 139 щения и транспортные средства, квалифицированный и профессионально подготовленный производственный персонал и персонал, занимающийся контролем качества, утвержденные письменные процедуры и инструкции, заполняемые формы, фиксирующие все этапы выполнения установленных процедур, полная возможность контроля выпуска продукции с помощью протоколов сопровождения партии препарата и журналов учета распределения готовой продукции, системы отзыва препаратов и рассмотрения жалоб.
Руководящий принцип GMP состоит в том, что качество закладывается в процесс выпуска продукции, а не только проходит проверку в готовом продукте. Поэтому создаются гарантии того, что препарат не только соответствует конечным техническим условиям (фармакопейной статье предприятия), но и того, что он произведен в соответствии с тем же порядком действий и при тех же условиях всякий раз, когда осуществляется его выпуск. Существует немало способов контроля данного процесса, в том числе контроль качества производственной базы и ее систем, контроль качества исходных материалов, контроль качества продукции на всех этапах, контроль качества тестирования препарата, контроль идентичности технологических материалов посредством адекватного этикетирования и сегрегации, контроль качества технологических материалов и продукции путем адекватного хранения на складе и т.д. Все эти контрольные действия должны соответствовать установленным, формализованным и одобренным процедурам, которые утверждены в виде протоколов, рабочих инструкций, методик анализов и технологического регламента с описанием всех задач, выполняемых в течение всего процесса выпуска продукции и ее контроля. Валидация сама по себе не улучшает качества продукции. Ее результаты могут либо повысить степень гарантии качества, либо указать на необходимость совершенствования условий производства. Результаты валидации подтверждаются отчетом о ее проведении.
Перед началом валидации производственного процесса были проведены следующие работы: 140 - была проведена валидация аналитических методик, которые использовались при внутрипроизводственном контроле и контроле готовой субстанции, - был проведен входной контроль сырья и материалов, - была проведена квалификация производственных помещений и оборудования, - определен перечень переменных характеристик процесса и их допустимые пределы, так называемые критические точки, перечень критических вспомогательных веществ, - был разработан технологический регламент, СОПы (Стандартная операционная процедура) технологических процессов, в которых подробно описаны используемое сырье, материалы, оборудование и техника проведе ния технологического процесса, и ТК (технологические карты) для фиксации результатов и параметров процесса, - было проведено обучение персонала по утвержденным документам.
Был разработан протокол валидации технологического процесса, в котором были приведены описания проводимых исследований, было указано на каких сериях проводилось исследование, какой персонал принимал участие в валидации, какое сырье и материалы использовались, по каким документам проводились исследования. Валидация была проведена для процесса создания рабочего банка, приготовления инокулята, культивирования, отмывки телец включений, растворения телец включений, ренатурации, биохимической очистки, стерильной фильтрации.
Валидация процесса проводилась на 3-х сериях продукта. По результатам валидации был составлен отчет. Процесс был признан валидным на основании сходимости критических параметров технологического процесса и получения стандартного продукта, соответствующего специфицированным критериям качества.
