Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. История изучения некробактериоза :. 10
1.2. Характеристика возбудителя некробактериоза 14
1.3. Лабораторные методы диагностики некробактериоза 18
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 30
2.1. Материалы и методы 30
2.1.1. Штамм некробактериоза 30
2.1.2. Питательные среды 31
2.1.3. Серологические методы диагностики некробактериоза .... 31
2.1.4. Технологическое оборудование 41
2.1.5. Контролируемые и регулируемые параметры в - процессе глубинного культивирования 41
2.1.6. Математические методы планирования и анализа экспериментов 43
2.2. Результаты собственных исследований 44
2.2.1. Разработка промышленной технологии производства эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза 44
2.2.2. Проверка иммуногенной активности экспериментальных вакцин против некробактериоза в РА 56
2.2.3. Определение титров антител в сыворотке крови крупного рогатого скота в РА 58
2.2.4. Определение наличия антител возбудителя некробак териоза в сыворотке крови в РА и крови в КРНГА 59
2.2.5. Исследование сывороток КРС на наличие антител к F.necrophorum в непрямом твердофазном ИФА 62
2.2.6. Исследование антигена на некробактериоз КРС хозяйства «Шатурторф» 63
2.2.7. Иммунофлюоресцентная тест-система * 64
2.2.8. Сравнительная оценка чувствительности ИФА для детекции антител в сыворотке крови животных 65
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 67
4. ВЫВОДЫ 76
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 78
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 79
Приложения
Введение к работе
Актуальность темы. Некробактериоз крупного рогатого скота (КРС), по сравнению с заболеванием других видов животных, изучен еще недостаточно. Первые исследования болезни у этого вида животных в России проведены Я.Р.Коваленко только в начале 30-х гг. Над этой проблемой работали В.И.Зайцев (28) и другие исследователи. Ими изучены клинические признаки болезни, проверены многие лекарственные препараты для лечения больных животных. В последующие годы проводились лишь эпизоотические исследования, в том числе касающиеся также преимущественно вопросов лечения (Н.Д. Бондарько, Н.К. Коровин, Н.В. Теплое, Р.Н. Руднев) (12).
По частоте встречаемости заболевания некробактериоз крупного рогатого скота отнесен С.Н.Муромцевым и Л.С.Новиковой (1935) (71) после северных оленей,-овец и лошадей, т.е. после животных, содержащихся большими стадами. Первое описание массового поражения конечностей у крупного рогатого скота проведено Я.Р.Коваленко в 1937 г. (47). До этого времени заболевание конечностей у данного вида животных, по-видимому, носило спорадический характер и не представляло проблемы ни для исследователей, ни для владельцев, поскольку в доступной литературе не было обнаружено необходимой информации.
В начале 70-х гг. вновь как в России, так и в других странах появились исследования по изучению причин массового распространения болезней конечностей среди крупного рогатого скота с выделением и установлением вида микрофлоры, участвующей в патологическом процессе. Так, А.Г. Санин (1974) (92) в абсцелирующих флегмонах межкопытцевой кожи установил 20 видов микробов, из них 15 патогенных, но ни в одном случае не получил чистой культуры Fusobacterium necrophorum. N. Verdes et al. (1976) (102) из абсцессов подошвы у овец изолировали F.necrophorum и Corynobacterium pyogenes. Массовое распространение болезней конечностей Н.С.Островский (1977) (72) объяснил нарушением технологии содержания, ведущей к травматизму и мацерации кожи, нарушению ее защитных свойстве последующим внедрением в ткани различной микрофлоры. Этого же мнения придерживались Г.Н.Васин (1983) (95), С.И.Братюка (1983) (68), А.П.Кудрявцев (1985) (96), тогда как М.Петров и С.Ташев (1980) (98), А.А.Самоловов и др. (1984-2000гг.) (92-121) на основании обследования 134 животных с гнойными процессами пальца считали наиболее частыми возбудителями синегнойную палочку, стрептококк, стафилококк и их ассоциации (92-127).
В последнее десятилетие в ряде хозяйств Российской Федерации широкое распространение получило это заболевание. Отсутствие эффективных средств специфической профилактики и лечения, а также недостоверные методы диагностики некробактериоза способствовали его широкому распространению, особенно, среди крупного рогатого скота и нанесению значительного экономического ущерба (73-76, 182-183). В процессе переболевания животные теряют 30-40% живой массы.
Заболевание вызывается бактерией некроза F.necrophorum, которая обитает в паренхиматозных органах и конечностях крупного рогатого скота.
В основе профилактики борьбы с некробактериозом должна находиться система мероприятий организационно-хозяйственных, ветеринарно-санитарных, лечебно-профилактических, которые включают: во-первых, своевременное диагностирование заболевания; во-вторых, полноценное сбалансированное кормление, правильное содержание, систематическую обрезку и расчистку копыт, своевременную уборку навоза, обеспечение животных подстилочным материалом, устройство удобных полов. Следует практиковать активные прогулки животных на различные расстояния в зависимости от их состояния (33,44,50,54, 55-57, 129,130, 139-145).
И, наконец, необходимо уничтожать возбудителя некробактериоза путем дезинфекции животноводческих помещений и мест выгула. Если невоз 6
можно удалить всех животных из помещений, проводят дезинфекцию частями (рядами, группами и т.д.).
Клинически больных животных отделяют от здоровых, собирают их в отдельном помещении или секции скотного двора, ежедневно убирают навоз и проводят дезинфекцию.
В настоящее время для лечения больных животных применяют гипериммунную сыворотку. Для предохранения животных от некробактериоза разработана высокоиммуногенная инактивированная эмульсин-вакцина. Вакцина обладает также и терапевтическим действием. Оба препарата разработаны сотрудниками ВИЭВ профессором Ю.Д. Караваемым, кандидатом вет. наук И.Н.Семеновой, научными сотрудниками А.Р.Мусаевым, Е.Д. Бос-хомджиевой (14-16, 36,41) и не имеют аналогов в мировой и отечественной практике.
В основе вакцины высокотоксигенный штамм возбудителя некробактериоза, полученный в лаборатории путем длительной селекции, продуцирующий экзо- и эндотоксины, инактивированные формалином. Для концентрирования субъединичной вакцины один из токсинов очищают и концентрируют, а затем соединяют с масляным адъювантом (146-153, 172, 173, 175-178).
Отсутствие достаточных сведений и результатов исследований по некробактериозу, по-видимому, связано, с одной стороны, с несовершенством существующих методов диагностики, эффективность которых в производственных условиях лабораторий составляет 23-30%.
Существующие питательные среды (бульон Китт-Тароцци, глюкозосывороточный агар), предложенные еще в 30-е гг. для выращивания преимущественно спорообразующих анаэробов, мало пригодны для культивирования возбудителя некробактериоза из патологического материала, обсемененного банальной микрофлорой. С другой стороны, работа с возбудителем некробактериоза, как представителем анаэробной неспорообразующей микрофлоры, требует определенного опыта и навыка. Таким образом, в основу борьбы и профилактики с некробактериозом крупного рогатого скота должна быть включена система организационно-хозяйственных, ветеринарно-санитарных и специальных лечебно-профилактических мероприятий с обязательным использованием лабораторной диагностики, инактивированнои эмульсин-вакцины и гипериммунной сыворотки против некробактериоза. (35,43,45,48,53,65,67,69,88,103, 131-135).
Цели и задачи исследований. Целью настоящих исследований явились: разработка технологии производства эритроцитарного антигена; сравнительная оценка методов диагностики и разработка экспресс-метода для ранней диагностики некробактериоза крупного рогатого скота (КРС) в условиях животноводческих хозяйств.
Для реализации указанной цели были поставлены следующие задачи:
- разработка управляемой промышленной технологии производства эритроцитарного антигена;
- сравнение реакции агглютинации (РА), кровекапельной реакции непрямой гемагглютинации (КРНГА), иммунофлюоресцентного метода и им-муноферментного анализа (ИФА) при диагностике некробактериоза;
- разработка экспресс-метода для ранней диагностики некробактериоза КРС в условиях животноводческих хозяйств;
- определение эффективности диагностики некробактериоза КРС с использованием эритроцитарного антигена.
Научная новизна. Впервые для сельского хозяйства разработан эрит-роцитарный диагностикум некробактериоза КРС, позволяющий диагностировать пораженный некробактериозом скот и оценить эффективность использованной вакцины и гипериммунной сыворотки для профилактики и лечения данного заболевания. Экспериментально доказана эффективность применения эритроцитарного диагностикума для экспресс-определения некробактериоза КРС в хозяйствах. Практическая значимость работы. Результаты научно-исследовательской работы, полученные при выполнении диссертации, вошли в следующую нормативно-техническую документацию:
1. Временная инструкция по изготовлению и контролю эритроцитарно-го диагностикума некробактериоза КРС;
2. Технические условия «Эритроцитарный диагностикум некробактериоза КРС»;
3. Временное наставление по применению эритроцитарного диагности-кума некробактериоза КРС.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференциях:
1. Международной научно-практической конференции «Современные вопросы патологии сельскохозяйственных животных» РНИУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелеского Национальной академии наук Белоруси», г. Минск 8-10 октября 2003 г.
2. Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы микробиологической безопасности Российской Федерации», по священной 75-летию образования научно-исследовательского института микробиологии Министерства обороны Российской Федерации, 27-28 ноября 2003 г., г. Киров.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, подана заявка на патент «Способ изготовления эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных», приоритет от 9.07.03г. и подготовлена нормативно-техническая документация на изготовление, контроль и применение эритроцитарного диагностикума некробактериоза КРС. Основные положения диссертации, выносимые на защиту: - разработка технологии производства эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза КРС; - сравнительная оценка различных методов диагностики некробакте-риоза КРС;
- определение эффективности применения эритроцитарного антигена для экспресс-диагностики некробактериоза КРС в условиях животноводческих хозяйств.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 103 стр. машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы и практические предложения. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами и 5 рисунками. Список литературы содержит 219 источников, в том числе 65 иностранных.
История изучения некробактериоза
Возбудитель болезни открыт и описан в конце XIX столетия и получил название Bacillus necrophorus (Fluge А., 1886), а болезнь определили как нек-робациллез в соответствии латинской таксономией возбудителя.
Однако последующими исследованиями установлено, что возбудитель спор не образует, и по новой классификации предложили называть его Bacterium necrophorum, а болезнь, соответственно, некробактериозом. Всего же известно более 20 синонимичных названий возбудителя, последнее из которых Fusobacterium necrophorum. (128,173,174,191-194, 197-203).
В большинстве случаев некробактериоз проявляется гнойно-некротическим распадом тканей в области пальца. Эти изменения начали описывать в конце XIX в. Преимущественно они были распространены среди стадных животных (северных оленей, овец, лошадей) и имели разные определения. Так, у северных оленей - это копытка, копытница, копытная болезнь; у лошадей - гангренозный дерматит; гангренозный мокрец, эпизоотическая гангрена, инфекционный дерматит, у овец — копытная гниль, копытная болезнь овец, панарициум (Я.Р.Коваленко, 1948). Определение болезни в этом случае было основано на проявлении главного клинического признака. Этиология же этих болезней в нашей стране долгое время оставалась невыясненной, хотя возбудитель некробактериоза, по сообщению Я.Р.Коваленко (47), выделен и определен Р.Кохом еще в 1881 г., а по данным B.L.Langworth (190), впервые описан Ф. Леффлером в 1884г.
В России Д.А. Холодцов (1897) по результатам экспедиции на Камчатку на основании наблюдений описал клинические признаки болезни, показал ее сезонность, наметил меры борьбы. За период 1898-1909 гг. Н.И.Эккерт, участвуя в 3-х экспедициях в тундры Архангельской губернии, изучал причины эпизоотии и падежа оленей, в том числе от некробактериоза (колытки). Впервые описал дифференциальные клинические признаки копытной болезни. С.А.Грюнец (1906-1925гг.) работал ветеринарным инспектором вначале в Якутской, а затем в Камчатской области и занимался изучением этиологии многих болезней северных оленей, в том числе некробактериоза. В 1910 г. был командирован в Америку, где находился в течение 1,5-а лет. За это время он объехал большую часть Северных Американских Соединенных штатов, некоторое время пребывал на Аляске. Считался ведущим специалистом в области оленеводства и мараловодства (10,11,13).
В 30-х годах XX века этиология некробактериоза была окончательно обоснована. А.Г.Ревнивых (1929) проводит исследования в Обдорском вет-бакинституте и впервые в России выделил возбудителя болезни, описал его культурально-биохимические свойства, дал определение болезни, как некро-бациллез. На основании экспериментальных данных с заражением животных установил клинические и патологоанатомические признаки и провел первые исследования по искусственной иммунизации оленей. С.Н.Муромцев (1934) руководил научной экспедицией от Государственного института экспериментальной ветеринарии по изучению этиологии копытной болезни северных оленей и первым написал подробное изложение проблемы некробактериоза северных оленей. А.Н. Чеботарев (1937-1938) участвовал в научной экспедиции в Нарьян-Мар от института полярного земледелия, животноводства и промыслового хозяйства для изучения этиологии, патогенеза, эпизоотологии некробактериоза и лечения больных животных. Занимался изучением этиологии и разработкой серологической диагностики некробактериоза. А.Д.Бальзаментов (1937-1938 гг.) в составе экспедиции института полярного земледелия, животноводства и промыслового хозяйства в Нарьян-Маре изучал патологоанатомическую и гистологическую картину при искусственно вызванном и естественном некробактериозе северных оленей. На этом основании предложил схему патогенеза болезни. Изложенные им патологоанатомические и гистологические признаки вошли во все руководства по вопросу некробактериоза животных. А.К.Краснобаев (1939-1949 гг.) занимался изучением бактерионосительства при некробактериозе, в частности в содержимом желудочно-кишечного тракта, и предложил пересмотреть роль почвы в передаче возбудителя. Л.Д.Николаевский (1940-1959 гг.) изучал факторы, способствующие возникновению некробактериоза, и занимался разработкой мер борьбы с инфекцией, а в 1951 г. издал монографию по некробактериозу северных оленей. В.С.Федотов (1950-1975 гг.) разрабатывал вопросы профилактики и лечения животных больных некробактериозом. Предложил в качестве мер профилактики теневые навесы и изгородный выпас оленей. И.М.Голосов (1950-1969гг.) на Таймыре разрабатывал способы лечения больных некробактериозом оленей, предложив «ударные дозы» сульфаниламидных препаратов внутрь и внуримышечное их введение в виде 20%-ного раствора, а антибиотиков — в виде 15-20%-ных масляных взвесей. А.Х.Лайшев (1962-1988гг.) изучал клинико-рентгенологическую картину некробактериозных поражений конечностей оленя, занимался вопросами лечения больных некробактериозом оленей, разработал методику ампутации пораженного палаца у оленей. Б.В.Маслухин (1963-1974 гг.) занимался разработкой лечебно-профилактических мероприятий при некробактериозе оленей, обосновал применение тетрациклина для лечения больных оленей. А.М.Силков (1962-1981гг.) предложил агаровые взвеси антибиотиков для лечения больных некробактериозом северных оленей и тканевые биостимуляторы по Филатову для профилактики болезни. Н.И.Писаренко (1966-1976 гг.) в условиях севера обосновала применение морфоциклина для лечения больных некробактериозом оленей.
Характеристика возбудителя некробактериоза
Некробактериоз - инфекционная болезнь животных и человека, характеризующаяся гнойно-некротическими поражениями кожи и подлежащих тканей, слизистых оболочек и внутренних органов (25-27, 105, 138, 154,166, 167-170).
Некробактериоз известен давно. Однако в течение длительного времени описывался под различными названиями, исходя из вида заболевшего животного и характера патологического процесса (инфекционная хромота овец, копытка северных оленей, энзоотический стоматит ягнят и др.) (81,83,98,99, 101,110-114).
Морфология. Возбудитель - некротизирующая бактерия (Fusobacterium necrophorum), которая представляет собой грамотрицательные, неподвижные, полиморфные палочки (до ЗОО мкм длиной), встречаются и кокковид-ные формы. Спор и капсул не образуют. Микроорганизмы окрашиваются всеми анилиновыми красками, используемыми в бактериологии. При окраске леффлеровской синькой и по С.Н. Муромцеву отчетливо просматривается характерная для этого вида микроорганизмов зернистая структура клетки (136,214).
Кулыпуралъные свойства. Некротизирующая бактерия является обли-гатным анаэробом. Оптимальная реакция среды для нормального роста бактерий варьирует в пределах 7,2-7,6 ед.рН при максимальном Eh-150 мв или ниже. Окисленные среды, т.е. при высоких положительных Eh, резко подавляют рост F.necrophorum, добавление асцнической жидкости или сыворотки крови, способствуют росту бактерий. Оптимальной для выращивания бактерий является температура 37С (100).
На жидких питательных средах микроорганизмы растут в течение 18-48 часов, при этом рост многих культур сопровождается образованием газа и наличием неприятного, гнилостного запаха (170).
Для практических ветеринарных врачей лабораторий очень важно иметь в виду, что фазы роста культур на жидких питательных средах (типа Китт-Тароцци) имеют следующие параметры: лаг-фаза-4-5 часов, экспонент-циальная фаза -10-13 часов и фаза замедленного роста-7-11 часов (68,171).
Биохимические свойства. Все культуры F.necrophorum продуцируют индол (один из видовых признаков), превращают треонин и лактат в пропио-нат, образуют сероводород. В бульоне, состоящем из пептбна, дрожжевого экстракта и глюкозы, образуется больше масляной кислоты и меньше уксусной, муравьиной и фумаровой кислот. Желатину разжижают не все штаммы, молоко свертывают, но непостоянно пептонизируют, восстанавливают метиленовую синьку, большинство штаммов расщепляют липазу.
Сахаролитические свойства культур непостоянные и часто слабые. Некоторые штаммы активно ферментируют глюкозу, фруктозу, лактозу, манно-зу, сахарозу, левулезу, галактозу, но не ферментируют адонит, дульцит, глицерин, инулин, рамнозу, сорбит, сорбозу, эритрит, мелизитозу.
Культуры обычно не образуют каталазу, не гидролизуют эскулин и гиппурат, нитраты не восстанавливают, ацетоин не образуют, желчь не задерживает их рост.
Таким образом, вид F.necrophorum можно дифференцировать от других видов того же рода, как по наличию индола, так и по образованию пропио-новой кислоты из лактата (106).
Антигенные свойства. Многочисленные литературные данные свидетельствуют, что F.necrophorum не являются серологически однородными. Опыты с адсорбцией антител показали, что имеются штаммы идентичные в антигенном отношении, но есть также серологические типы, отличающиеся по антигенным свойствам. Культуры F.necrophorum содержат преципитино-ген, агглютиноген и аллерген. Большинство исследователей считают наличие у культур F.necrophorum 3 биотипа - А,В,С (118,119,137).
Патогенность. Патогенность F.necrophorum обусловлена, в основном, термостабильным лейкоцидином (полисахаридом), цитоплазматическим экзотоксином (белком) и гемолизином.
Материалы и методы
Исследования по разработке промышленной технологии производства эритроцитарного антигена и анализ методов диагностики некробактериоза КРС проводились в 2001-2003 гг. во ВНИТИБП, ФГУП «Щелковский биокомбинат», согласно программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2001-2005 гг. по проблеме «Разработать молекулярно-биологические основы совершенствования и создания новых высокоэффективных и экологически безопасных методов, средств, технологий и систем диагностики, профилактики и терапии болезней животных, обеспечивающих устойчивое ветеринарное благополучие и получение продукции животноводства высокого санитарного качества», заданию 06 «Разработать современные экологически безопасные технологические процессы и оборудование для промышленного производства биологических препаратов, обеспечивающих высокую эффективность диагностики, профилактики и лечения болезней животных и решения санитарно-экологических проблем в АПК».
Штамм возбудителя некробактериоза
Для разработки диагностикума использовался производственный штамм F. necrophorum «0-1» (ВИЭВ), который является безвредным для человека и относится к четвертой группе патогенных микроорганизмов. Лио-филизированный штамм освежался один раз в год пассажами через лабораторных животных (кроликов).
Производственный штамм возбудителя некробактериоза (ВИЭВ) поддерживается во Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ).
Стандартный образец культуры производственно-вакцинного штамма должен отвечать требованиям ТУ, утвержденным в соответствии с действующим положением.
Питательные среды
Для промышленного производства эритроцитарного антигена из штамма «0-1» ВИЭВ предложены следующие питательные среды.
Питательная среда для работы со штаммом.
Мясо-пептонопеченочный бульон (МППБ). На приготовление 100 л МПТТБ расходуется 25 л печеночного экстракта, 125 г хлористого натрия и 100 л водопроводной воды.
Производственные питательные среды.
Питательная среда №1 состоит из:
- перевара Хоттингера - 25%;
- печеночного экстракта - 12-,5%;
- пептона - 1%;
- натрия хлористого - 0,5%;
- водопроводной воды - до 100%. Питательная среда №2 состоит из:
- перевара Хоттингера - 30%;
- дрожжевого аутолизата - 3%;
- пептона - 1%;
- натрия хлористого - 0,5%;
- водопроводной воды - до 100%.
Серологические методы диагностики некробактериоза
Определение специфической активности сыворотки в реакции агглю тинации (РА). Реакция агглютинации - это склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток под действием антител в присутствии электро лита (изотонического раствора хлорида натрия).
Определение иммуногенной активности вакцины заключается в определении титров агглютининов к возбудителю некробактериоза в сыворотках крови вакцинированных кроликов. С этой целью отбирают 6 клинически здоровых кроликов серонегативных к некробактериозу.
Смесь вакцины из 5 флаконов вводят двукратно с интервалом 12 сут. внутримышечно в дозе 0,5 см3 - первый раз и 0,75 см3 - второй раз.
Через 12 сут после второго введения вакцины у животных берут кровь из уха, получают сыворотку и исследуют ее в реакции агглютинации (РА с антигеном F.necrophorum).
Реакцию ставят в пробирках. Из испытуемых сывороток с титром антител не ниже 1:64 делают основное разведение 1:4. Для этого в пробирку с 1,8 см физиологического раствора вносят калиброванной пипеткой 0,6 см сыворотки и перемешивают. После этого готовят двукратные серийные разведения испытуемых сывороток от 1:4 до 1:512. С этой целью в первую и вто-рую пробирки вносят по 1,0 см основного разведения (1:4), во вторую, третью и т.д. по 1,0 см физиологического раствора. Путем перемешивания и по-следовательного переноса жидкости по 1,0 см из второй пробирки в третью, из третьей в четвертую и т.д. получают соответствующие разведения сыворотки. Из последней пробирки 1,0 см жидкости после смешивания удаляют.
Аналогично разводят позитивную и нормальную контрольные сыворотки. В отдельную пробирку наливают 1,0 см3 физиологического раствора (контроль антигена на спонтанную агглютинацию). Флакон с антигеном встряхивают до получения гомогенной взвеси. Во все пробирки калиброванной пипеткой вносят по 0,05 см взвеси антигена. Штативы с пробирками встряхивают до образования в них гомогенной, слегка опалесцирующей взвеси и ставят при температуре (37±1) С на 4-6 ч, затем дополнительно выдерживают при комнатной-температуре до 24 ч, после чего проводят учет реакции.
