Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Общая характеристика аденовирусов 13
1.2. Аденовирусная инфекция крупного рогатого скота 13
1.3. Структурная характеристика аденовириона 16
1.3.1. Строение нуклеокапсида 16
1.3.2.Физико-химические свойства структурных белков аденовириона 18
1.3.3. Основной структурный белок аденовириона - гексон 18
1.3.4. Структурные белки аденовириона 20
1.4. Иммунохимические свойства аденовирусных белков 21
1.4.1. Антигенная структура белков аденовирусов 21
1.4.2. Антигенные свойства гексона 23
1.5.Основные методы диагностики вирусных болезней животных 25
1.5.1. Лабораторная диагностика аденовирусной инфекции крупного рогатого скота 27
1.6. Иммуноферментный анализ 31
1.7. Иммуноферментный анализ, как метод диагностики аденовирусной инфекции 35
1.7.1. Иммуноферментный анализ, как метод выявления антител к аденовирусам крупного рогатого скота 36
1.7.2. Иммуноферментный анализ, как метод обнаружения аденовирусных антигенов 43
2. Материалы и методы 46
2.1. Материалы 46
2.1.1. Биологические препараты 46
2.1.2. Реактивы 47
2.2. Методы исследования 48
2.2.1. Получение монослойной культуры клеток перевиваемой линии MDBK 48
2.2.2. Получение монослойной культуры клеток перевиваемой линии Т-1 49
2.2.3. Получение монослойной культуры клеток ТБ 49
2.2.4.Культивирование аденовируса крупного рогатого скота первого серотипа 49
2.2.5.Культивирование аденовируса крупного рогатого скота седьмого серотипа 51
2.2.6.Экстракция гексонов аденовирусов 51
2.2.7 Гидрофобная хроматография 52
2.2.8.Анионообменная хроматография 53
2.2.9. Электрофорез в полиакриламидном геле 55
2.2.10. Непрямой иммуноферментный анализ 56
2.2.12. Реакция нейтрализации 59
2.2.13. Реакция непрямой гемагглютинации 60
3. Результаты исследований 61
3.1. Культивирование аденовирусов первой и второй подгрупп 61
3.1.1. Культуры клеток 61
3.1.2. Методы культивирования аденовирусов 62
3.2. Получение реагентов набора ИФА 64
3.2.1. Получение аденовирусных антигенов 64
3.2.2. Получение гипериммунных сывороток к гексонам аденовирусов 68
3.2.3. Определение оптимальных условий проведения ИФА 72
3.3. Апробация набора реагентов ИФА 84
3.4. Сравнительная характеристика метода ИФА 90
4. Обсуждение результатов 93
5. Выводы 108
6. Практические предложения 111
Список литературы 112
Приложение 127
- Лабораторная диагностика аденовирусной инфекции крупного рогатого скота
- Иммуноферментный анализ, как метод обнаружения аденовирусных антигенов
- Получение гипериммунных сывороток к гексонам аденовирусов
- Сравнительная характеристика метода ИФА
Лабораторная диагностика аденовирусной инфекции крупного рогатого скота
В основе лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота лежат те же подходы , которые были описаны в предыдущей главе (1, 2а, 10, 20). Исследуемым материалом являются мазки-отпечатки и смывы из носа и носоглотки, фекалии от больных животных, или патологоанатомический материал (кусочки тканей), взятый из трахеи, легких, почек, кишечника и лимфоузлов. На этапе предварительной диагностики, как показывает практика, аденовирус обнаружить не удается всеми известными экспресс-методами, за исключением электронной микроскопии и РИФ (МФА) (24, 25). Вирусологические методы индикации и идентификации аденовирусов включают:
- выделение вируса из смывов, выделений из носа и носоглотки, фекалий или патологического материала в чувствительных культурах клеток по цитопатическому действию и внутриядерным включениям в препаратах инфицированных культур клеток;
- идентификация аденовируса по определению родоспецифической антигенной детерминанты в реакциях РСК, РИД, МФА и типоспецифической антигенной детерминанты в реакциях РН и РТГА;
- выявление вирусного генома методом молекулярной гибридизации и последующая его идентификация методом рестрикционного анализа ДНК (і);
- выявление антител в сыворотках крови в РСК, РНГА, ИФА.
Как известно, аденовирусы лучше размножаются в эпителиальных клетках своих естественно-восприимчивых хозяев, вызывая цитопатическое действие (2, 3, 24, 92). Оно может быть обусловлено по меньшей мере двумя факторами: цитотоксическим и инфекционным . Первый из них вызывает раннее округление, увеличение и агрегацию клеток без изменения морфологии ядер и синтеза вирусной ДНК. Второй фактор инициирует образование внутриядерных включений, репликацию вирусной ДНК и специфическое изменение клеточного монослоя (59, 23). Самыми первыми биологическими системами культивирования были первичные культуры клеток, полученные из ткани легких и почек теленка, а также тестикул бычка (2, 3, 33). Позднее для вирусов первой подгруппы была адаптирована перевиваемая культура клеток, полученная из ткани почки коровы (3, 87), но не чувствительная для аденовирусов второй подгруппы. В конце 80-х начале 90-х годов в России в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР группой ученых под руководством доктора медицинских наук Мироновой Л.Л. была получена перевиваемая культура клеток почки теленка Таурус-1, к которой в лаборатории ветеринарной вирусологии МГАВМиБ им. К.И.Скрябина профессором Белоусовой Р.В. с соавт. были адаптированы аденовирусы КРС обеих подгрупп (18). Установлено, что если специфическое для аденовирусов цитопатическое действие, более раннее для первой подгруппы (на 48-72 часа) и более позднее для 2 подгруппы (4-7 сутки), не удается обнаружить уже в первом пассаже, то это еще не исключает наличие вируса в исследуемом материале. Считается, что имеет место либо недостаточная адаптация вируса к культуральной системе, либо его малое количество для проявления цитопатического действия в культуре клеток. В этом случае первый пассаж считают слепым и вирусовыделение повторяют в той же культуральной системе до трех - четырех раз, если это необходимо. Следующим этапом лабораторной диагностики является идентификация цитопатогенного агента. Она основывается на иммунологической реакции антиген-антитело со специфическими сыворотками к аденовирусам. Так, в реакциях РСК, РИД, РИФ определяют род вируса, а в реакции РН - его тип. Эта, уже ставшая традиционной, схема лабораторной диагностики аденовирусной инфекции позволяет дать ответ не ранее, чем через неделю. Ветеринарная биотехнология предлагает новые современные экспресс-методы идентификации аденовируса без предварительного культивирования в культуре клеток. Это методы гибридизационного и рестрикционного анализов, иммуноморфологические методы, методы иммуноферментного и радиоиммунного анализов (22,19, 34, 35, 37, 39). В методе молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот используют ДНК вирусов, выделенных из смывов из носа и носоглотки больных животных, из фекалий или инфицированных культур клеток (19). Доказано, что типовая принадлежность аденовирусов может быть установлена не только в реакции РН, но и методом рестрикционного анализа ДНК с применением рестриктаз (48,152). Метод основан на экстракции ДНК из инфицированных клеток или патогенного материала, обработкой ее рестриктазой и анализе продуктов реакции методом электрофореза в агарозном геле (69). МФА позволяет быстро (в течение 1-2 часов) обнаружить и идентифицировать вирус непосредственно в патологическом материале (23, 24). Его эффективность зависит от чувствительности и специфичности флюоресцирующих антисывороток.
Среди диагностических методов, обеспечивающих наиболее высокую чувствительность, специфичность и экспрессность результатов, особое место занимают иммунологические реакции, в которых комплексы антиген-антитело детектируются с помощью радиоизотопной или ферментной меток (РИА и ИФА) (11, 32, 35, 96). Методу ИФА будет посвящена отдельная глава. Для диагностики аденовирусной инфекции методом радиоиммунного анализа (РИА) используют две его модификации: РИЛА - для выявления антител и конкурентный РИА - для выявления антигенов (41). Установлено, что конкурентный РИА, основанный на конкуренции антигена в исследуемом образце с установленным количеством меченного стандартного антигена за ограниченное количество специфических антител, позволяет выявлять 1-10 нг вирусного белка в 1мл образца (36). Метод РИА не может использоваться для массовой диагностики, вследствие наличия радиоактивной метки и невозможности длительного хранения реагентов без потери активности.
Заключительным этапом в лабораторной диагностике аденовирусной инфекции считают серологические исследования крови от больных животных на наличие антител (20, 33). Парные сыворотки идентифицируют на наличие антител в реакциях РН, РСК, РДП , РИГА. Самая достоверная, но и самая трудоемкая, и длительная реакция - РН, определяет вируснейтрализующие антитела, остальные реакции - родоспецифические антитела. Серологические исследования проводят с целью ретроспективной диагностики, анализа эпизоотической ситуации и иммунологического статуса поголовья для проведения профилактических мероприятий. Последние две задачи, в особенности, требуют массовых серологических исследований, для которых традиционные методы (РН, РСК, РДП) недостаточно эффективны и длительны по времени (31). Метод ИФА позволяет быстро и достоверно детектировать аденовирусные антитела в сыворотках крови от больных и переболевших животных, а также оценивать результаты вакцинации (22, 28, 39,45).
Иммуноферментный анализ, как метод обнаружения аденовирусных антигенов
Как отмечалось ранее, вторым направлением в области иммунной биотехнологии по разработке методов диагностики аденовирусных инфекций стало создание более чувствительного и менее трудоемкого, чем традиционные РН, РИФ, РИД, РСК, метода непрямого ИФА, позволяющего обнаруживать аденовирусные антигены в патологическом материале и в зараженной культуре клеток. Установлено, что из двух вариантов ИФА конкурентного и «сэндвич»-ИФА, второй является более чувствительным, хотя и уступает по простоте выполнения конкурентному (11, 40). Как отмечалось ранее, «сэндвич»-ИФА основан на специфическом взаимодействии антител, адсорбированных на твердом носителе или ковалентно связанных с ним, с антигеном образца и, как результат, образовании иммунного комплекса антитело - антиген, который выявляется вторыми антивидовыми антителами, меченными ферментом. Результат реакции учитывается после добавления в систему субстрата для индикаторной ферментативной реакции.
Предложена следующая схема ИФА для выявления антигенов (в том числе и аденовирусных), как наиболее оптимальная (11,40):
- получение очищенных антител, содержащих специфические эпитопы к антигенным детерминатам;
- выбор твердого носителя и отработка параметров иммобилизации специфических антител;
- получение очищенного, высокоактивного и стабильного конъюгата;
- отработка оптимальных условий постановки реакции.
Установлено, что на поверхность твердого носителя можно наносить нативную специфическую гипериммунную сыворотку (4, 11, 40). Но в таком виде она содержит балластные белки, которые мешают адсорбции антител и снижают чувствительность. Во избежание этого исходную сыворотку либо очищают поэтапным осаждением сульфатом аммония с последующим диализом (40), либо ионообменной хроматографией (11). Однако наибольшей чувствительности и специфичности можно достичь, используя вместо антисывороток, моноклональные антитела. Для них характерна уникальная специфичность к одной антигенной детерминанте, гомогенность препарата, возможности получения в неограниченных количествах (4, 48, 49). Оптимальное разведение сыворотки на носителе подбирают эмпирически, на основании калибровочных кривых.
Для адсорбции специфических антител, как и в случае непрямого ИФА на обнаружение антител, используют полистироловые носители. Связывание происходит за счет гидрофобных взаимодействий антител и соответствующих участков на носителе. На прочность этого связывания влияют однородность полистиролового носителя, рН и ионная сила буферного раствора, степень очистки и концентрация антител, время и температура обработки (11, 40).
Многолетние исследования показали, что наибольшая чувствительность, специфичность и воспроизводимость метода ELISA достигается при сочетании следующих качественных показателей:
- если используется высококачественный полистироловый носитель с относительно равномерным гидрофобным покрытием;
- если сорбировать на носителе очищенную антисыворотку с количеством примесных (балластных) не превышающих 1,0 мкг/мл или моноклональные антитела;
- если концентрация связывающегося с носителем белка (антител) на единицу поверхности лежит в диапазоне 100 нг/см2 (80);
- если антитела сорбируют в фосфатном буфере, при температуре 37 С в течение 36 часов;
- если носитель обрабатывать каким-либо инертным белком или после его инкубации с антителами, или добавлять в буфер с 0,1% твин - 20 на последующих этапах реакции (11,40).
Отмечено, что в условиях хранения носителя с адсорбированными антителами в подложке возможно частичное нарушение этой связи. В оптимальных условиях адсорбированные антитела остаются прочно связанными с носителем, при этом происходит высвобождение лишь незначительной доли суммарного связанного белка в первые 48 часов и совсем незначительной его части в последующие 30 дней. Этот процесс имеет место при нарушении условий хранения носителя с антителами, например, таких как влажность или температура. Это снижает воспроизводимость в повторных пробах (11). Показано, каким параметрам должен отвечать конъюгат (соотношение антитело - фермент, степень очистки, удельная активность, выбор субстрата) (146). Для избежания так называемого «мостикового связывания», при котором блокируются антигенные детерминанты на исследуемом образце и эпитотопы на поверхности антител на носителе из-за химически схожей ковалентнои сшивки в конъюгате (11), возможно при введении в «сэндвич-систему» вторичных антител, полученных против того вида животного, к которому принадлежали антитела специфические к антигену образца. В этом случае конъюгат будет содержать ковалентные сшивки, отличные от химического связывания носитель - антитело.
Таким образом, разработка и внедрение метода ИФА для выявления антител к аденовирусам КРС позволит значительно повысить эффективность экспресс-диагностики и иммунологического мониторинга вакцинированных животных.
Получение гипериммунных сывороток к гексонам аденовирусов
Очередная задача состояла в получении достаточно больших количеств гипериммунных сывороток одной серии против гексонов аденовирусов КРС для ее использования при разработке ИФА и последующей апробации (27). При таком подходе можно бы было говорить о достоверных и воспроизводимых результатах исследований. Большое количество антисыворотки можно получить от животных с большой массой, например таких, как козы, овцы или телята. Исходя из этого, мы проводили иммунизацию телят черно - пестрой породы, трехмесячного возраста и массой около 90 кг. Предварительно у телят брали сыворотку крови и тестировали на наличие или отсутствие антител к аденовирусам КРС в РН, РИГА и ИФА. В РН и РНГА использовали в качестве антигенов культуральные аденовирусы BAV-1 и BAV-7, которые получали, согласно п.п. 2.2.4 и 2.2.5. В ИФА полистироловые планшеты сенсибилизировали очищенными гексонами, выделенными из аналогичных культуральных аденовирусов ( п.п. 2.2.6 - 2.2.8). Полученные результаты показали, что животные были серонегативны к аденовирусам. В связи с тем, что животные были серонегативны к аденовирусам. В связи с тем, что активность антисывороток зависит от способа введения, схемы иммунизации (количества инъекций, способа введения и продолжительности всей процедуры), дозы вводимого материала, а также иммунологической реактивности животного (27), мы модифицировали стандартную схему иммунизации аденовирусными антигенами и апробировали ее. Согласно этому, инъекции проводили в смеси с полным адъювантом Фрейнда подкожно, с интервалом в две недели. Через каждые две недели после второго введения кровь брали из вены и определяли титр специфических антител. Продолжительность иммунизации составляла не менее шести инъекций, но при невысоких титрах антител могла быть пролонгирована. В нашей работе мы применили сочетание внутрикожного введения (1-3 иммунизации с полным адъювантом, 4-5 иммунизации - с неполным) по 0,2 мл в 20 точек вдоль позвоночника (суммарный объем иммуногена 4,0 мл) и внутривенного (6-8 иммунизация - без адъюванта) введения по 2,0 мл в яремную вену. Концентрация очищенного гексона в суспенции составляла 0,2 мг/мл. Продолжительность всего цикла была рассчитана на 5,5 месяцев. Кровь для исследования сывороток брали, начиная с седьмого дня, после каждой иммунизации.
Сыворотки крови исследовали в динамике в РН, РИГА и ИФА с гомологичными антигенами и в перекрестных реакциях с антигенами другой подгруппы. В ИФА пробы сывороток разводили в 50 раз и титровали, начиная с разведения 1:100. На рис. 2,3,4,5 показаны кривые титрования антител в гипериммунных сыворотках. Из анализа данных видно, что титр антител нарастал постепенно до максимальных значений после шестой иммунизации: РН 1:200, ИФА и РИГА 1:6400 -1:12800 (BAV-7 и BAV-1) и оставался на этом уровне в течение месяца.
Динамика титра антител к гексону BAV-1 в пробах сывороток, полученных при гипериммунизации, в ИФА и РНГА (по оси абсцисс-сроки иммунизации; по оси ординат-разведение сыворотки).
При перекрестном титровании гипериммунных сывороток в ИФА было показано (рис.6,7)., что титр антител к гомологичным антигенам (1:12800 для BAV-1 и 1:6400 для BAV-7) на четыре log2 выше, чем к гетерологичными антигенами (1:800 и Г.400 соответственно). При этом выявлено, что титры выше в среднем на один log2 при перекрестном взаимодействии антител к аденовирусам второй подгруппы (BAV-7) с гексоном первой подгруппы (BAV-1), чем при обратной ситуации.
Сравнение титра антител в гомологичных и гетерологичных гипериммунных сыворотках при взаимодействии с гексоном BAV-1 в ИФА. Гетерологичные сыворотки получены к гексону BAV-7 (по оси абсцисс-сроки иммунизации; по оси ординат-разведение сыворотки). Рис. 7. Сравнение титра антител в гомологичных и гетерологичных гипериммунных сыворотках при взаимодействии с гексоном BAV-7 в ИФА. Гетерологичные сыворотки получены к гексону BAV-1 (по оси абсцисс-сроки иммунизации; по оси ординат-разведение сыворотки).
Сравнительная характеристика метода ИФА
При испытании набора реагентов для метода ИФА на различных образцах сывороток с целью определения антител к аденовирусам крупного рогатого скота, мы сравнивали получаемые результаты с данными исследований аналогичных образцов в РН и РИГА. В нашу задачу входило определить достоверность и воспроизводимость результатов, получаемых методом ИФА Известно, что в РН определяются антитела к типоспецифическим антигенным детерминантам, в реакции непрямой гемагглютинации - к гругшо- и видоспецифическим (20,30). Кроме того, эти реакции являются основными при серодиагностике аденовирусной инфекции (33). При сравнении результатов исследования сывороток от вакцинированных телят, было показано, что титр антител составлял в ИФА 1:1067, в РН -1:80, в РИГА -1:264 (табл.7).
Корреляция результатов ИФА с РН и РИГА составляла более 90%, при г=0,925,приР40,001(5).
Было выявлено в ИФА две фазы подъема антител (рис.12,13): для BAV-1 - на 5 и 15 дни, для BAV-7 - на 7 и 20 дни с момента заражения. Это соответствовало данным, полученным в РН и РНГА, где также определялись ранний и поздний подъем титров антител.
При исследовании 147 образцов полевых сывороток из различных животноводческих комплексов, где у телят наблюдались клинические признаки респираторных вирусных инфекций (повышение температуры тела, кашель, ринит, диарея), в ИФА было выявлено на 16% больше серопозитивных сывороток, чем в РНГА.
Как следует из литературных данных, семейство Adenoviridae включает более 100 видов, объединенных в два рода: аденовирусы млекопитающих и аденовирусы птиц (91, 98,108,116). Они вызывают инфекционные болезни у человека и животных, которые могут протекать с поражениями дыхательных путей, кишечника, лимфоидной ткани, конъюнктивы (2, 60, 124, 137). У молодняка крупного рогатого скота аденовирусы вызывают респираторные заболевания и диареи, что ведет к снижению живой массы поголовья, а среди новорожденных телят - и падеж (12, 21, 53). В связи с этим совершенствование методов эффективной экспресс-диагностики аденовирусных заболеваний и создание новых биотехнологий изготовления диагностических препаратов являются актуальными на современном этапе развития науки (22, 26, 34, 39, 45). Не вызывает сомнения тот факт, что главным способом предупреждения возникновения и распространения вирусных инфекций среди крупного рогатого скота является вакцинация (2, 14, 21). Поэтому разработка высокоэффективных методов серологической оценки иммуногенных свойств аденовирусных вакцин и контроля за их практическим применением остается приоритетным направлением ветеринарной биотехнологии (16,34,38,45).
Известно, что для оценки иммунного ответа при аденовирусной инфекции в лабораторной практике наиболее широко используется реакция непрямой гемагглютинации (20, 31, 33, 139, 140). Отечественная биопромышленность выпускает наборы специфических реагентов для РНГА. И хотя этот метод прост и не требует сложного оборудования, однако он обладает и целым рядом существенных недостатков. Среди них низкая специфичность, из-за использования в качестве антигена культурального вируса, слабая воспроизводимость, из-за нестабильности эритроцитарного диагностикума при хранении, субъективная оценка результатов, которая не всегда делает возможным отличить слабо положительную реакцию от отрицательной. Благодаря развитию иммуноферментного анализа, в частности метода непрямого и «сэндвич»-варианта ELISA ( Engvall, Perlmann, 1972), у нас в стране были разработаны диагностические наборы для ИФА по серодиагностики целого ряда вирусных пневмоэнтнеритов крупного рогатого скота. Среди них - инфекционный ринотрахеит, парагрипп-3, ротавирусная и коронавирусная инфекция телят. Преимуществами этого метода перед рутинными (РЫТА, РСК, РИФ) являются высокая чувствительности и специфичность, экспрессность, объективность учета результатов, простота выполнения, воспроизводимость результатов при серийном выпуске реагентов (9,22, 34,39).
Метод ИФА - это иммуноферментный тест, основанный на одном и том же наборе манипуляций, а именно взаимодействии антигена с антителом и выявлении полученного иммунного комплекса антивидовыми иммуноглобулинами, меченными ферментом (И, 40). Концепция нашей научно-исследовательской работы заключалась в том, чтобы подобрать такие специфические реагенты (аденовирусные антигены, положительные и отрицательные контрольные сыворотки, антивидовой конъюгат, меченный ферментом) и неспецифические компоненты (полистироловые планшеты, буферные растворы, хромоген) набора ИФА, которые бы при наиболее оптимальных условиях постановки иммунной реакции ( время и температура инкубации, промывка планшет и т.д.) выявляли быстро и достоверно антитела к аденовирусам КРС.
