Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Характеристика рицина 11
1.1.1. Рибосом-инактивирующие лектины 11
1.1.2. Строение рицина и его действие на эукариотические клетки 13
1.1.3. Биосинтез рицина 19
1.1.4. Транспорт рицина в клетках млекопитающих 20
1.1.5. Действие А-субъединицы рицина на рибосомы 24
1.1.6. Иммунологические свойства рицина 27
1.2. Профилактика излечение отравлений рицином 30
1.2.1. Воздействие рицина на организм животных 30
1.2.2. Разработка антидотов против рицина 33
1.2.3. Разработка вакцин против отравлений рицином 35
1.2.4. Разработка тест-систем для обнаружения рицина 41
1.3. Применение субъединиц рицина в медицине 44
1.3.1. Иммунотоксины 44
1.3.2. Адъюванты для создания вакцин 47
1.4. Использование технологии создания химерных белков для получения рекомбинантных антигенов 48
1.4.1. Аффинные домены и белки-носители 50
1.4.2. Применение целлюлозы, как иммуносорбента 63
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 67
2.1. Материалы и реактивы 67
2.1.1. Плазмидные векторы и олигонуклеотиды 67
2.1.2. Бактериальные штаммы и среды 67
2.1.3. Ферменты 67
2.1.4. Сорбенты 67
2.1.5. Другие реактивы 68
2.1.6. Буферные растворы '. 68
2.1.7. Лабораторные животные 70
2.1.8. Оборудование .'. л. 70
2.2. Основные методики 71
2.2.1. Выделение ДНК клещевины 7Г
2.2.2. Полимеразная цепная реакция 72
2.2.3. Химико-ферментативный синтез 72
2.2.4. Сайт-специфический мутагенез 72
2.2.5. Гидролиз ДНК специфическими эндонуклеазами 73
2.2.6. Фракционирование.фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле 73
2.2.7. Препаративное разделение фрагментов ДНК и их элюция из геля 73
2.2.8. Лигирование фрагментов ДНК 73
2.2.9. Выделение и очистка аналитического количества плазмидной ДНК 74
2.2.10. Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК 75
2.2.11. Определение нуклеотидных последовательностей плазмидных ДНК....76 . 2.2.12. Подготовка компетентных клеток Е. coli для трансформации плазмидной ДНК электропорацией 76
2.2.13. Трансформация клетокЕ. coli 76
2.2.14. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН 77
2.2.15. Выращивание штамма-продуцента и индукция синтеза рекомбинантных белков 77
2.2.16. Определение растворимости белков 78
2.2.17. Определение периплазматической локализации белков 79
2.2.18. Выделение и очистка белков, содержащих НІ8б-аффинную метку 79
2.2.19. Выделение и очистка белков, содержащих CBD 81
2.2.20. Иммунизация кроликов 82
2.2.21. Непрямой ИФА 82
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 83
3.1. Получение рекомбинантных аутентичных RTA и RTB 83
3.1.1. Ююнирование нуклеотидной последовательности аутентичной RTA 87
3.1.2. Клонирование нуклеотидной последовательности аутентичной RTB 89
3.1.3. Экспрессия рекомбинантных генов аутентичных RTA и RTB в клетках Е. coli М15 93
3.2. Получение рекомбинантной мутантной RTA 95
3.2.1. Клонирование нуклеотиднойпоследовательности мутантной RTA 96'
3.2.2. Экспрессия рекомбинантного гена мутантной RTA в клетках Е. coli Ml5 98
3.3. Получение химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD в цитоплазме Е. соН99'
3.3.1. Клонирование гибридных генов химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD 101
3.3.2. Экспрессия гибридных генов химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD в клетках Е. coli М15 105
3.4. Получение химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR и исследование их иммуногенных и антигенных свойств 105
3.4.1. Клонирование гибридных генов химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR 106
3.4.2. Экспрессия гибридных генов химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR в клетках Е. coli М15 108,
3.4.3. Выделение и очистка химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR 110
3.4.4. Исследование иммуногенных и антигенных свойств химерных белков RTA-DHFR и RTB-DHFR 111
3.5. Получение химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD в периплазме Е. coli и исследование их иммуногенных и антигенных свойств 113
3.5.1. Клонирование гибридных генов химерных белков SigRTAspCBD и SigRTBspCBD 115
3.5.2. Экспрессия гибридных генов химерных белков SigRTAspCBD и SigRTBspCBD вЕ. соНМ15 117
3.5.3. Выделение и очистка химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD 119
3.5.4. Исследование иммуногенных и антигенных свойств химерных белков RTAspCBD и RTBspCBD 121
ВЫВОДЫ 125
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 127
Введение к работе
Актуальность проблемы. Рицин, токсин растительного происхождения из семян клещевины обыкновенной (Ricinus communis) является одним из наиболее сильнодействующих токсинов [1]. Его содержание в семенах (касторовых бобах) составляет приблизительно 1-5%. С давних лет известно, что употребление всего двух бобов клещевины может оказаться смертельно опасным для человека сельскохозяйственную высокомасличную техническую культуру. В касторовых бобах содержится 48-55% касторового масла, которое отличается высоким содержанием триглицеридов рицинолевой кислоты (80-85%) и используется в промышленности, медицине и косметологии. Побочным продуктом при производстве касторового масла является шрот клещевины, содержащий 37-40% питательного белка и входящий в компоненты кормов для сельскохозяйственных животных и рыб. Однако присутствие рицина в семенах клещевины осложняет производство касторового масла и шрота клещевины [2, 3,4].
Обычно рицин удаляют из сырья острым паром [1]. Тем не менее, такая обработка не всегда полностью инактивирует токсин, что в дальнейшем может приводить к отравлению человека и сельскохозяйственных животных. Согласно ГОСТ 18102-95 (Масло касторовое медицинское. Технические условия) и ГОСТ 17290-71 (Шрот клещевинный кормовой. Технические условия), реакция.на рицин, в продукции должна отсутствовать.
Ввиду широкого распространения клещевины как сельскохозяйственной культуры и простой технологии выделения, рицин является легко доступным токсином. Из-за своей высокой токсичности и доступности он привлекает внимание военных специалистов в области химического оружия, начиная с 1-ой мировой войны. Технология выделения рицина из жмыха семян клещевины не требует сложного оборудования, и поэтому рицин доступен для производства даже в странах со слаборазвитой химической промышленностью. Разработаны эффективные технологии выделения и очистки рицина до кристаллического состояния.
По оценкам экспертов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) летальная доза неочищенного рицина в аэрозольном состоянии находится на уровне ингаляционной дозы паров зарина, а очищенного - меньше чем летальная, доза вещества VX. Ему как поражающему агенту, был присвоен шифр «W» [5]. Летальные дозы токсина зависят от способа его попадания в организм животных и от вида животных. Наиболее опасной формой рицина является аэрозоль. Минимальная летальная ингаляционная доза рицина для человека может составлять приблизительно 0,005 мг/кг [6, 7].
В 1978 году рицином был убит болгарский телеведущий Георгий Марков. Токсин был введен журналисту в бедро "уколом" зонтика, в котором была спрятана капсула с рицином. Смерть наступила через 3 дня [8]. В 2003 и 2004 годах рицин был обнаружен в Южной Каролине (США) в почтовом отделении, обслуживающем кабинет сенатора Билла Фриста, и внутри письма, адресованного в Белый Дом (США). Рицин был обнаружен на территории США у лиц, имеющих отношение к антиправительственным группировкам и связанных с террористическими организациями [1]. В начале 2003 года британская полиция арестовала группу террористов, часть которых прошла подготовку в Чечне. В подпольной лаборатории они наладили производство рицина, а между тем, один из задержанных работал на военной базе и имел доступ к приготовлению пищи солдат [9]. Очевидно, что растительный токсин рицин представляет серьезнейшую опасность из-за возможности его использования в качестве химического оружия, в частности, в террористических целях. Он может быть применен для отравления воздуха в закрытых вентиляционных системах, питьевой воды и запасов-продовольствия.
Рицин - гликопротеин, белковая часть молекулы которого построена из двух субъединиц - каталитической активной А-субъединицы (RTA, Ricinus Toxin А-chain) [10] и лектиновой связывающей В-субъединицы (RTB, Ricinus Toxin В-chain), соединенных одной дисульфидной связью [11]. RTA ответственна за токсические свойства рицина, a RTB за его транспорт внутрь клетки. Благодаря своей токсической активности RTA нашла применение в создании иммунотоксинов (ИТ) - конъюгатов, состоящих из токсина и антитела и обладающих направленным действием, например в противоопухолевой терапии [11], терапии ВИЧ [12], а также для подавления иммунного ответа при трансплантации органов [13].
На сегодняшний день не существует препаратов для профилактики и лечения отравления рицином, в связи с чем, чрезвычайный интерес представляет создание антидотов и вакцин, а также разработка тест-систем для экспресс-индикации рицина в окружающей среде и в организме. Наиболее перспективными представляются антидоты, полученные на основе протективных антител к рицину, а также тест-системы, основанные на иммунохимических методах. Производство подобных антидотов, тест-систем и вакцин требует получения антигенов рицина.
Работа с нативным рицином для получения его антигенов крайне сложна ввиду его высокой токсичности. Следует отметить, что RTA, изолированная от RTB, находясь вне клетки нетоксична из-за неспособности проникать в клетку без RTB [14]. RTB, сама по себе, также нетоксична [15]. Кроме того, известно, что рекомбинантные RTA и RTB сохраняют многие эпитопы нативного рицина, в том числе и протективные [16, 17]. Поэтому перспективным подходом к получению антигенов рицина является создание рекомбинантных RTA и RTB. Для разработки ИТ также возможно использование рекомбинантных RTA, но для этой цели необходимо сохранение токсичности рекомбинантых RTA и снижение их им му ногенности.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось получение рекомбинантных антигенов RTA и RTB и исследование их иммуногенных, и антигенных свойств. Работа выполнялась в рамках комплексного проекта Федерального агентства по науке и инновациям при Министерстве образования и науки РФ по теме: «Разработка технологий, методов и средств обеспечения-системы биологической безопасности и противодействия терроризму» (шифр «БТ-00.2/001») по договору №8-Л/05 от 04.05.2005 (ГК 02.467.11.6002 от 12.04.2005).
В соответствии с поставленной целью в процессе работы предстояло решить следующие основные задачи:
1. Клонирование и экспрессия в Е. coli нуклеотидных последовательностей, кодирующих как аутентичные RTA и RTB, так и их гибриды с белками-носителями;
2. Создание эффективных штаммов-продуцентов Е. coli рекомбинантных белков, содержащих RTA и RTB;
3. Разработка технологии выделения и очистки рекомбинантных белков, содержащих RTA и RTB;
4. Исследование иммуногенных и антигенных свойств полученных белков.
Научная новизна. На основе идеологии создания многокомпонентных белков, развиваемой в исследовательских коллективах лабораторий биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН и молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, заведующим которых является К.6.Н. В.Г.Лунин, были впервые спланированы и сконструированы рекомбинантные гибридные плазмидные ДНК Е. coli, позволяющие эффективно осуществлять в клетках Е. coli штамма Ml5 индуцированный биосинтез химерных белков RTA-DHFR, RTB-DHFR и RTAspCBD, RTBspCBD, содержащих А- и В-субъединицы рицина и белки-носители (дигидрофолат редуктазу - DHFR и целлюлозосвязывающий домен -CBD). Впервые получены штаммы-продуценты данных белков. Разработана высокоэффективная схема выделения, очистки и иммобилизации рекомбинантных белков RTAspCBD, RTBspCBD на целлюлозном сорбенте, основанная на свойствах целлюлозосвязывающего домена и позволяющая получать препараты белков со степенью чистоты более 95%. Впервые получены в препаративных количествах высокоочищенные рекомбинантные белки RTA-DHFR, RTB-DHFR и RTAspCBD,
• RTBspCBD, способные индуцировать у кроликов выработку высокого титра специфичных к нативному рицину антител.
Практическое значение работы. Полученные штаммы-продуценты рекомбинантных белков RTAspCBD, RTBspCBD и разработанный метод выделения, очистки и иммобилизации этих белков на целлюлозе, могут найти применение в области промышленной, биотехнологии при создании вакцинных препаратов для предотвращения отравлений рицином, тест-систем индикации рицина на основе иммунохимических методов, а также для получения антидотов к , рицину на основе протективных антител. Целлюлозосвязывающий домен позволяет получать иммобилизованные препараты RTAspCBD, RTBspCBD на целлюлозе. Белки, иммобилизованные на целлюлозном носителе, как показали данные предварительных испытаний, обладают большей стабильностью и существенно большей иммуногенностью по сравнению с раствором нативного белка [18]. Данные белки могут быть использованы для разработки нового поколения иммунологических диагностикумов, в том числе белковых биочипов, основанных на присоединении к подложке из целлюлозы данных рекомбинантных белков, а также для получения сорбентов на основе целлюлозы, для очистки противорициновых антител. В случае сохранения токсичности, связанной- с каталитической активностью RTA выщеплять аденин из 28S рРНК эукариотических клеток, белок RTAspCBD может найти применение в качестве компонента ИТ для борьбы со злокачественными опухолями. Белок RTBspCBD. может быть использован в качестве адъюванта субъединичных генно-инженерных вакцин.
Характеристика рицина
Рицин относится к классу белков, называемых рибосом-инактивирующими белками (РИБ). Эти белки представляют собой ферменты, инактивирующие рибосомы, необратимо выщепляя один и более остатков аденина из рРНК. Эти белки могут также депуринизовать и некоторые другие полинуклеотиды [19].
Белковая природа веществ, определяющих известные с древних времен ядовитые свойства семян клещевины (Ricinus communis) и розарийного горошка (Abrus precatorius), была установлена еще в конце девятнадцатого века. Тогда же обнаружили способность этих белков - рицина (из клещевины) и абрина (из розарийного горошка) — индуцировать агглютинацию эритроцитов и преципитацию белков сыворотки крови, что и считали причиной токсического действия. В это же время Пауль Эрлих, иммунизируя животных рицином и абрином, открыл специфичность иммунитета. Он обнаружил появление в сыворотке крови специфических белков, преципитирующих токсин, что легло в основу гуморальной теории иммунитета. Интенсивные исследования структуры и механизма действия токсинов начались с 1970-х годов, когда было показано, что абрин и рицин более токсичны для клеток асцита Эрлиха, чем для нормальных клеток и, следовательно, могут найти применение в терапии опухолей.
К настоящему времени охарактеризовано обширное семейство белков, обладающих способностью ферментативно инактивировать рибосомы. Способность гидролитически выщеплять инвариантный аденин из высококонсервативной области 28S рРНК - PHK-N-гликозидазная активность -является характерным признаком белков этого семейства, называемых рибосом-инактивирующими белками (РИБ). Семейство РИБ разделяют на два типа: РИБ типа 1 (далее РИБІ) и РИБ типа П (далее РИБІІ).
РИБІ - мономерные белки, состоящие только из одной активной субъединицы (А-цепи), отвечающей как раз за ферментативные свойства белка. К этому типу белков принадлежат: антивирусный белок лаконоса и трихосантин, определяющий абортирующее действие препаратов китайского огурца (Trichosantes kirilowii). РИБІ широко распространены у растений, а также среди грибов и водорослей. К настоящему времени известно более 50 белков этого типа.
РИБП состоят из двух субъединиц, приблизительно по 30 кДа каждая, соединенных дисульфидной связью, одна из которых гомологична РИБІ (А-субъединица, или А-цепь), а другая обладает лектиновыми свойствами (В-субъединица, или В-цепь). В-цепь обеспечивает связывание РИБ с клетками-мишенями-и их внутримолекулярный транспорт. Поэтому РИБП1 также называют рибосом-инактивирующими лектинами. В группу РИБП входят такие мощные растительные токсины, как рицин, абрин и модецин, а также относительно нетоксичные нигрин и эбулин бузины (Sambucus). К РИБП относятся также бактериальные токсины: шига токсин, продуцируемый Shigella dysenteriae и шига-подобные токсины, продуцируемые энтерогеморрагическими штаммами Escherichia coli. Структура шига и шига-подобных токсинов несколько отличается от структуры типичных РИБП. Эти токсины состоят из А-субъединицы, гомологичной РИБІ, нековалентно связанной с пентамером из пяти одинаковых В-субъединиц (молекулярная масса 7,7 кДа), которые специфически связывают галабиозные остатки гликолипидов клеточных мембран, в основном глоботриаозилцерамида Gb3. Аналогичную структуру, состоящую из двух субъединиц, А- и В-, имеют и такие токсины как дифтерийный токсин, токсин сибирской язвы и ботулизма. Основная субъединичная структура РИБП - А-В-структура - у некоторых РИБ может димеризоваться (ковалентно или нековалентно). Так, например, агглютинин клещевины образует тетрамеры типа В-A-S-S-A-B, в которых А-субъединицы димера А-В связаны дисульфидной связью. Токсический лектин омелы MLI образует нековалентно ассоциированные димеры типа (А-В)2 [20, 21,22].
В настоящее время известно уже более двух десятков РИБП. Характерно; что, как правило, из одного вида растений выделяют несколько вариантов: РИБ, кодируемых разными генами, но имеющих сходную первичную структуру. Так, семена клещевины содержат рицин и агглютинин клещевины, идентичные на 89%, листья омелы (Viscum album) - вискумин и MLI, MLII и MLIII (mistletoe lectin), идентичные на 75-88% [23].
Материалы и реактивы
Для работы использовали плазмидные векторы группы pQE фирмы QIAGEN, США: pQE16 (Amps, DHFR+, His ), pQE6 (Amp ). В- работе были-использованы олигонуклеотиды, синтезированные ЗАО «Синтол» (Россия, Москва)» твердофазным амидофосфитным способом на автоматическом ДНК-синтезаторе ASM 102U (Новосибирск, Россия) и очищенные методом электрофореза в 12%-ном1 полиакриламидном геле (ПААГ).
В работе был использован лабораторный штамм Escherichia coli Ml 5 [pREP4] (Kmr, Naif, Str8, rif, lac", ага", gal", mtF, F", recA+, uvr+, wvr .
Жидкая среда LB (Luria-Bertani) для выращивания биомассы содержала: 1%. бакто-триптон; 0,5% дрожжевой экстракт. 1% NaCl. Среду титровали до рН 8 5 при помощи 0,1 М .раствора NaOH. Среда LB для электропорации содержала: 1% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой-экстракт, 0,5% NaCl.
Твердаягпитательная.среда — среда LB с содержанием Г,7% бакто-агара и 2% глюкозы. Все среды.перед употреблением стерилизовали автоклавированием.
В работе использовали эндонуклеазы рестрикции: ВатШ, BgUl, KpriZl, ЕсоШ, HindlU, Ncol, Xbal, а также РНК-азу, T4 ДНК-лигазу, Год-полимеразу, буферные растворы для эндонуклеаз рестрикции и для лигирования фирмы Fermentas МВГ (Литва). Активность каждого фермента - 10 ед/мкл.
Для очистки белков с CBD использовали суспензию сферической целлюлозы «Celluflow С-25» фирмы The Collaborative Group (США) размером гранул 5-10 мкм.
Для очистки белков с НЇЗб-аффинной меткой, использовали Ni-NTA-агарозу фирмы QIAGEN (США).
Нативный рицин был любезно предоставлен Т.И. Валякиной из лаборатории нейрорецепции и нейрорегуляции ИБХ им. Шемякина М.М и Овчинникова Ю.А. Лизоцим, хлорид магния, имидазол фирмы Merck (Германия). Хлорид натрия, ацетат магния, бромфеноловый синий, краска Кумасси R.-250 фирмы Диа М (Россия). Сульфат аммония, гидроксид натрия, гидрокарбонат натрия, ацетат калия, ацетат аммония, ледяная уксусная кислота, изопропанол, этанол, хлороформ, бутанол, изоамиловый спирт, фенол, глицерин, глюкоза фирмы. Химмед (Россия). Хлорид лития, этилендиаминтетрауксусная кислота и. этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА), изопропил-бета-В-тиогалактопиранозид (ИПТГ), лимонная кислота, персульфат аммония фирмы Helicon (Россия). Ацетат калия фирмы Рапгеас (Испания). Хлорид калия фирмы Лаверна, Россия. Трис гидрохлорид, гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия, додецилсульфат натрия (ДСП), глицин, Tween-20, стекловата, агароза, вазелиновое масло для ПНР фирмы Serva (США). Р-меркаптоэтанол фирмы Amresco (Канада). Triton Х-100, мочевина, бромистый.этидий, формальдегид, К,К -метиленбисакриламид, гексамминкобальта (Ш) хлорид, АТФ, красители — маркеры бромфеноловый синий» и ксиленцианол, гуанидин хлорид, бромид цетилтриметиламмония, ТМВ-субстратная смесь фирмы Sigma (США). НН К -тетраметилзтилендиамин, акриламид, гексаметиленкобальта хлорид (III) фирмы Fluka (Бельгия). Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ) с концентрацией 5 мМ фирмы Медиген (Россия). Дрожжевой экстракт, бакто-триптон, бакто-агар фирмы Difco (США). Антибиотики фирмы Биохимик (Россия): ампициллин и канамицин. Использовали легкоплавкую агарозу Seakem GTG фирмы Самвгех Bioscience (США) свободную от ДНКаз. Набор реактивов для секвенирования ДНК Cy5-Dye Terminator Cycle Sequencing Kit фирмы Amersham-Pharmacia-Biotech (США), антивидовой иммунопероксидазный конъюгат «Goat-anti-rabbit IgG-HRP» фирмы Amersham (США).
Получение рекомбинантных аутентичных RTA и RTB
В настоящее время, как уже отмечалось, в мире не существует препаратов для лечения и предотвращения возможных отравлений рицином. Несмотря на то, что в Америке уже существует более десятка тест-систем экспресс-индикации рицина в окружающей среде, в России такие тест-системы находятся только на стадии разработок [1]. Создание рекомбинантных RTA и RTB уже давно представляет большой интерес для исследователей; занимающихся разработкой противорициновых вакцин, антидотов, тест-систем и ИТ.
Использование рекомбинантных RTA и RTB, полученных при помощи генно-инженерных подходов, для решения данных задач, является более предпочтительным, чем использование природного рицина, так как субъединицы рицина сами по себе нетоксичны, в отличие от нативного рицина, и могут быть получены в болыномколичестве в непатогенном микроорганизме. Кроме того, они могут быть модифицированы посредством введения точечных мутаций, делеций, вставок, дополнительных доменов для решения-тех или иных биохимических или биотехнологических задач.
При создании штаммов-продуцентов рекомбинантных белков, а в частности антигенов RTA и RTB, очень важной является возможность получения стабильных, водорастворимых продуктов, устойчивых к протеолизу в клетках штамма-продуцента. Важна возможность производить эффективную и технологичную очистку рекомбинантных белков- от примесей штамма-продуцента, а также важно сохранение их антигенной» и иммуногенной активности (кроме задач, связанных с получением ИТ, где важно сохранение токсичности RTA и снижение иммуногенности).
Основная цель экспериментов по клонированию генов, которые предполагается использовать в биотехнологии - подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме хозяине. К сожалению, сам факт встраивания того или иного гена в клонирующий и экспрессирующий вектор еще не означает, что этот ген будет экспрессирован. В то же время, чтобы получение коммерческого продукта было экономически оправданным, уровень его синтеза должен быть достаточно высоким. Среди молекулярно-биологических свойств систем экспрессии наиболее важны следующие: 1) тип промотора; 2) прочность связывания мРНК с рибосомой; 3) число копий, клонированного гена и его локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки); 4) конечная локализация синтезируемого продукта; 5) эффективность трансляции в организме хозяина; 6) стабильность продукта в хозяйской клетке [188; стр. 112].
Эффективность экспрессии любого чужеродного гена зависит от его родства с организмом хозяином. Несмотря на то, что многие представители как про- так и эукариотических организмов способны к экспрессии чужеродных генов, для I получения важных в коммерческом отношении продуктов с помощью технологии рекомбинантных ДНК используют в основном клетки Е. coli. Это связано, прежде всего, с тем; что генетические, молекулярно-биологические, биохимические и физиологические свойства этого микроорганизма детально изучены. Кроме того, это наиболее дешевый и быстрый способ получения многих белков. Поэтому в качестве штамма-продуцента белков RTA и RTB нами были выбраны широко применяемые в генно-инженерной практике грамотрицательные бактерии Е. coli.
Ген, кодирующий предшественника, рицина, уникален в растительном и животном мире, встречается только в клещевине обыкновенной {Ricinus communis) и не содержит нитронов [251]. Его последовательность аннотирована, в банке данных GenBank под номером-Х03179 (рис. 7). Предшественник рицина состоит из сигнального пептида, пропептида, а так же А- и В-субъединиц, соединённых линкером. После посттрансляционньгх модификаций сигнальный пептид, пропептид и линкер отрезается; а А- и В-субъединицы соединяются дисульфидной связью. Последовательность аминокислот предшественника рицина из Ricinus communis аннотирована в банке данных Swiss-Prot под номером Р02879. Она состоит из 576 а.о.: область 1-26 а.о. соответствует сигнальному пептиду; область 27-35 а.о - пропептиду; область 303-314 а.о. - линкеру; область 35-303 а.о. и 315-576 а.о. соответствует зрелому белку (рис. 8).
