Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 20
1.1. Проблема вирусного гепатита А и его лабораторная диагностика 20
1.2. Анализ лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки и детекции её возбудителя 43
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 62
2.1. Объекты исследования, взятые в работу 62
2.2. Биологическое сырье и основные химические реактивы... 63
2.3. Аппаратное оснащение исследований 63
2.4. Экспериментальные и коммерческие тест-системы для диагностики вирусного гепатита А и Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей 68
2.5. Характеристика основных реагентов, используемых
для получения магноиммуносорбентов 69
2.6. Методы контроля антигенов и сывороток 70
2.7. Методы выделения иммуноглобулинов 70
2.8. Получение иммуноферментных конъюгатов и контроль
их активности 70
2.9. Физико-химические методы 71
2.10. Лиофилизация биологического материала 71
2.11. Методы математической и статистической обработки
полученных результатов 72
Глава 3. РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ МАГНОИММУНОСОРБЕНТНОЙ ГЕПАТИТНОЙ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ В
ИФА 73
3.1. Разработка биотехнологии получения полиакрила- мидного магнитного сорбента 73
3.1.1. Подбор методов выделения иммуноглобулинов ішасса G 77
3.1.2. Получение полиакриламидных гепатитных магноим-муносорбентов 79
3.1.3. Технические устройства и методические приемы для работы с МИС 81
3.1.4. Проведение иммуноферментного анализа 86
3.1.5. Применение гепатитной магноиммуносорбентной полиакриламидной тест-системы 91
3.2. Получение и применение гепатитных композиционных магноиммуносорбентов (ГКМИС) 96
3.2.1. Разработка биотехнологии получения гепатитных композиционных магноиммуносорбентов 98
3.2.2. Характеристика гепатитного диагностикума на основе композиционных магноиммуносорбентов и его
применение 107
Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ИФА И ПЦР ПРИ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДО ВАНИЯХ НА КРЫМСКУЮ ГЕМОРРАГИЧЕСКУЮ
ЛИХОРАДКУ КЛИНИЧЕСКОГО И ПОЛЕВОГО МАТЕРИАЛА, РАЗРАБОТКА МЕТОДОЛОГИИ ИХ КОМПЛЕКСНОГО ПРИМЕНЕНИЯ 113
4.1. Разработка методов подготовки клинического и полевого
материала для проведения исследований 114
4.2. Разработка методологии комплексного использования ИФА и ОТ-ГЩР при диагностике Крымской геморра гической лихорадки 117
4.3. Разработка методов детекции вируса Крымской геморрагической лихорадки в полевом материале, полученном из природных очагов некоторых регионов Юга России.... 134
4.4. Серологическое исследование крови и органов млеко питающих и птиц в природном очаге КГЛ Ставропо льского края 148
Глава 5. РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕСТ- СИСТЕМЫ МАГНОИММУНОСОРБЕНТ-НОЙ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ КРЫМСКОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ В ИФА 152
5.1. Разработка композиционного магноиммуносорбента
на основе алюмосиликата 152
5.2. Разработка метода селективного концентрирования на
магноиммуносорбенте с последующей постановкой
иммуноферментного анализа 162
Глава 6. РАЗРАБОТКА СОЧЕТАННОГО МЕТОДА ДЕТЕКЦИИ ВИРУСОВ ПУТЕМ СЕЛЕКТИВНОГО КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ НА МАГНОИММУНОСОРБЕНТЕ С ПОСЛЕДУЮЩЕЙ ПОСТАНОВКОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИЕЙ (ОТ-ПЦР) 172
6.1. Разработка и проведение сочетанного метода
МИС + ПЦР для детекции вируса гепатита А 173
6.2. Разработка и проведение сочетанного метода
МИС + ПЦР для детекции вируса Крымской
геморрагической лихорадки 180
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 187
ВЫВОДЫ 206
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 209
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 210
- Проблема вирусного гепатита А и его лабораторная диагностика
- Объекты исследования, взятые в работу
- Разработка биотехнологии получения полиакрила- мидного магнитного сорбента
Введение к работе
Охрана здоровья населения, как важнейший фактор национальной безопасности, является одним из основных приоритетов государственной политики. В настоящее время очевидны бесспорные успехи, достигнутые медицинской наукой и практикой в борьбе с инфекционными заболеваниями. Наряду с этим, вирусные гепатиты (ВГ) продолжают оставаться одной из главных проблем здравоохранения в большинстве стран мира. Заболеваемость ВГ имеет чрезвычайный характер, так как по темпам прироста и масштабам распространенности на земном шаре она значительно превосходит заболеваемость СПИДом (Онищенко Г.Г., 2002). По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ежегодно от патологии, связанной с вирусными гепатитами, включая цирроз печени и первичную клеточную карциному, умирают более 1 млн человек, из них около 100 тыс. от молниеносной формы заболевания.
Особое место среди вирусных гепатитов занимает гепатит А (ГА) - инфекция с фекально-оральным механизмом передачи. Для вирусного гепатита А характерны выраженные периодические подъемы и спады заболеваемости. Наибольшее распространение ГА имеет в регионах, где есть серьезные недостатки в обеспечении населения питьевой водой. В последние годы количество проб воды водоемов первой категории, не соответствующих стандартам, превышает 20 %. В местах водозаборов в 2-5% проб воды обнаруживаются возбудители кишечных инфекций и антиген вируса гепатита А (ВГА). Практически не сокращается количество водопроводов, не имеющих полного комплекса очистных сооружений (35%) и обеззараживающих установок (17%). Возрастает количество водных вспышек вирусного ГА (Онищенко Г.Г., 2002, 2002а). Примером является водная вспышка ГА в Карачаево-Черкесской Республике в январе-марте 2004 г. , когда заболело 180 человек.
Уровень заболеваемости ГА в детском возрасте в Российской Федерации в несколько раз превышает соответствующие показатели в развитых странах мира (Каретный Ю.В., Каганов Б.С., Добротворский И.Л., 2002).
Впервые 13 февраля 2001 г. Государственная Дума России провела парламентские чтения «О государственной политике по предупреждению распространения в Российской Федерации заболеваемости инфекционным гепатитом», на которых было подчеркнуто, что проблема вирусных гепатитов переросла из медицинской в общегосударственную, инфекции приобрели катастрофические масштабы и представляют реальную угрозу для здоровья нации («Мир вирусных гепатитов», 2001).
В 1999 г. в Российской Федерации резко осложнилась эпидемическая ситуация по заболеваемости Крымской геморрагической лихорадкой (КГЛ) (Онищенко Г.Г., Ефременко В.И., 2004). Заболевания КГЛ на территории Предкавказья известны с конца 40-х годов (Чумаков М.П., 1945,1946, 1974; Бутенко A.M. с соавт., 1970; Кучин В.В., Бутенко A.M., 1970; Кондратенко В.Ф. с соавт., 1973). После длительного перерыва природный очаг КГЛ активизировался. Тяжелые вспышки с высокой летальностью имели место в 1999 г. в Обливском районе Ростовской области (26 случаев) (Онищенко Г.Г. с соавт., 2000), в Нефтекумском и Ипатовском районах Ставропольского края (10 случаев), а в 2000 г. в Ставропольском крае на 13 административных территориях были выявлены 48 больных (Василенко Н.Ф. с соавт., 2001; Онищенко Г.Г. с соавт., 2001). За шесть лет эпидемические проявления КГЛ зарегистрированы в 7 из 13 субъектов Южного Федерального округа России. За эти годы здесь заболели КГЛ 432 человека, из них 36 умерли. В октябре 2004 г. эта опасная инфекция зарегистрирована в Республике Ингушетия, летальность при этом составила 75 %.
По мнению Л.В.Колобухиной и соавт. (2001), непосредственной причиной обострения эпидемиологической обстановки по КГЛ является рост численности клещей Hyalomma marginatum в результате сочетания природ-
ных (потепление) и социальных факторов (отсутствие противоклещевой обработки скота). В последние годы также резко снижен объем работ по борьбе с грызунами в поле (Онищенко Г.Г., Грижебовский Г.М., Ефременко В.И., 2003).
В этой связи особую важность приобретает своевременное выявление возбудителей опасных вирусных инфекций в биотических и абиотических объектах и оперативное уведомление соответствующих служб об эпидемиологической обстановке. Поэтому необходимо повысить требования к качеству средств и методов лабораторной диагностики, применяемых при эпидемиологическом надзоре, реализации мер по санитарной охране территорий (Онищенко Г.Г., 2002). Это нашло отражение в Программе «Профилактика особо опасных и природно-очаговых инфекций и санитарная охрана территории Южного Федерального округа Российской Федерации от завоза и распространения инфекционных заболеваний (2003-2005 гг.)», принятой на рабочем совещании 13-14 февраля 2002 г. в СтавНИПЧИ.
Ранняя лабораторная диагностика, своевременное выявление возбудителя инфекционного заболевания занимают основное место в системе противоэпидемических мероприятий и способствуют локализации очага инфекции. Разработка технологий на основе использования иммобилизованных форм биологических объектов является одним из научных направлений современной биотехнологии. Иммобилизация лигандов путём присоединения их к инертной и нерастворимой матрице - это та область научных исследований, которая в настоящее время вызывает большой интерес, благодаря повышению стабильности лигандов в несколько сот раз путём создания специальных условий и применения метода химического модифицирования, активирования матрицы. Перспективными для применения в методах имму-ноанализа являются твердофазные носители, в том числе различные гранулированные сорбенты (Шаханина К.Л., Клеев Б.В., Фёдоров Ю.М., 1976; Camargo Z., Guesdon J.L., Drouhet Е., 1984), а в последнее время - сорбенты с
магнитными свойствами (Жарникова И.В., 1995; Тюменцева И.С., 1996; Еф-ременко В.И., 1997; Афанасьев Е.Н., 2000; Chemla Y.R. et al, 2000; Richardson J.,HawcinsP., LuxtonR., 2001; Tanaka Т., Matsunaga Т., 2001).
Исследования по созданию и практическому использованию магнитных сорбентов применительно к вирусным инфекциям ранее не проводились. В связи с этим возникла необходимость в развитии и совершенствовании иммунобиологических методов, разработке новых экспрессных методов диагностики вирусных инфекций и индикации их возбудителей, направленных на сокращение времени проведения анализов и повышения их чувствительности и специфичности.
Цель исследования - конструирование твердофазных магнитоуправляемых иммунохимических тест-систем, отработка методических подходов к их применению, изучение диагностической ценности при лабораторной диагностике вирусного гепатита А, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей.
Задачи исследования:
-разработать методологические основы конструирования твердофазных магнитоуправляемых иммунохимических тест-систем для лабораторной диагностики вирусного гепатита А, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей;
разработать технологию применения магноиммуносорбентов при проведении экспрессных анализов (ИФА и ПЦР);
провести оценку эффективности различных способов выделения иммуноглобулинов класса G из антивирусных иммунных сывороток и мышиных иммунных асцитических жидкостей (ИАЖ) при конструировании диагностических тест-систем;
изучить диагностическую ценность разработанных тест-систем и методических приемов на экспериментальном, клиническом и полевом материале;
- изучить диагностическую ценность иммуноферментного анализа и по-
лимеразной цепной реакции при диагностике КГЛ и разработать методологию
комплексного применениия этих методов на различных стадиях заболевания;
- создать банк сывороток крови от больных людей Крымской геморраги
ческой лихорадкой из природных очагов Юга России для его использования
при оценке новых МИБП для диагностики КГЛ.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ
Впервые применительно к вирусным инфекциям осуществлена научно-методическая разработка биотехнологии производства магнитоуправляе-мых твердофазных иммунохимических тест-систем (полиакриламидных и композиционных), обладающих высокими сорбционной ёмкостью, стабильностью, чувствительностью, специфичностью.
Впервые разработаны методические приёмы по сочетанному применению селективного концентрирования вирусов на магноиммуносорбентах с последующим проведением экспрессных методов (ИФА и ПЦР), позволяющие исследовать материал от больных людей или животных, пробы из внешней среды неограниченного объёма с высокой степенью загрязнения, с низкой концентрацией вируса и чувствительностью, в несколько сот раз превышающей традиционные, что значительно повысило достоверность полученных результатов исследований.
Впервые в сравнительном аспекте проведен комплексный анализ различных способов выделения иммуноглобулинов из антивирусных иммунных сывороток и ИАЖ при конструировании диагностических тест-систем.
Разработаны эффективные методы подготовки проб клинического и полевого материала для лабораторного исследования, повышающие чувствительность и специфичность экспрессных анализов.
Впервые проведено изучение диагностической ценности иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипци-
ей (ОТ-ПЦР) при диагностике КГЛ и определена методология комплексного использования этих методов на различных стадиях заболевания.
Впервые на территории Ставропольского края в очаге КГЛ обнаружены антитела класса G к вирусу КГЛ в пробах крови ежей, землеройки-белозубки и мыши полевой; на территории Республики Ингушетия антиген и РНК вируса КГЛ выявлены у клещей Boophilus annulatus и Haemaphysalis otophila.
Приоритетность выполненных исследований подтверждена патентом РФ на изобретение №2065164 от 10.08.1996 г. «Диагностическая тест-система для выявления вируса гепатита А».
Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты проведенных исследований по методологии конструирования магнитоуправляемых твердофазных аффинных тест-систем дополняют теоретическую основу и намечают направление научных изысканий в области усовершенствования экспресс-диагностики вирусного гепатита А, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей. Теоретический аспект исследований состоит и в анализе возможных способов минимизации неспецифических реакций, повышения достоверности результатов лабораторного анализа на вирусный гепатит А и Крымскую геморрагическую лихорадку.
Разработка методов подготовки клинического материала для проведения лабораторных исследований, изучение диагностической ценности экспресс-анализов позволили предложить метод комплексного использования ИФА и ОТ-ПЦР при диагностике КГЛ.
Разработанные методические подходы и приёмы по извлечению антигенного материала из клинического и полевого материалов, выделению иммуноглобулинов из иммунных сывороток и асцитических жидкостей, опти-
мизация параметров конъюгации лигандов и маркёров позволили унифицировать биотехнологию производства ряда МИБП для экспресс-диагностики инфекционных вирусных заболеваний и детекции их возбудителей. Эти биотехнологии позволили изготовить серии диагностикумов (иммунофермент-ных, магноиммуносорбентных: полиакриламидных, аэросильных и алюмоси-ликатных), стабильно отвечающих общим медико-биологическим требованиям, предъявляемым к индикационным препаратам.
Применение сконструированных магноиммуносорбентов в сочетании с экспрессными методами диагностики (ИФА и ПЦР) увеличивает их чувствительность, одновременно сокращая время проведения исследований за счёт ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, что повышает целенаправленность проведения эффективных противоэпидемических мероприятий.
На основе материала от больных и подозрительных на заболевание КГЛ, поступившего в 2000-2004 гг. из природных очагов Юга России, создан банк лиофилизированных сывороток крови, систематизированных по различным критериям. Эта коллекция дает возможность проводить как углублённые клинические испытания новых МИБП для диагностики КГЛ, так и изучать некоторые теоретические аспекты современной вирусологии.
По материалам диссертации написана монография Н.Ф.Василенко с соавторами «Вирусный гепатит А, Крымская геморрагическая лихорадка: современные аспекты эпидемиологии и лабораторной диагностики» (2004 г.). Кроме того, результаты наших исследований использованы при написании двух монографий: В.И.Ефременко «Магносорбенты в микробиологических исследованиях» (1996 г.) и Г.Г.Онищенко с соавторами «Крымская геморрагическая лихорадка» (2004 г.).
Материалы научных разработок легли в основу следующих методических и нормативных документов:
«Инструкция по изготовлению и контролю тест-системы диагностической для выявления вируса гепатита А иммуноферментным методом». Одобрена Ученым советом СтавНИПЧИ (протокол №2 от 26.02.1993 г.) и утверждена директором института.
«Протокол медицинских испытаний опытного образца комплекта «Диамаг-100» при выявлении вируса гепатита А в объектах внешней среды и материале от больных иммуноферментным методом с использованием маг-ноиммуносорбентов («полевые» испытания)». Утвержден главным врачом Ставропольского городского ЦГСЭН А.А.Герасименко от 12.10.93 г. и зам. главного врача РЦГСЭН Чеченской Республики В.Х.Муцаевым от 10.05.95г.
Методические указания «Использование магноиммуносорбентов в иммунологических методах выявления корпускулярных и водорастворимых антигенов возбудителей инфекционных заболеваний (бактериологический, иммуноферментный, иммунофлуоресцентный)». Утверждены Комитетом Госсанэпиднадзора РФ 11.04. 1995 г.
Методические рекомендации «Приготовление органокремнеземных магносорбентов с иммобилизованными лигандами белковой природы (иммуноглобулины, антигены, ферменты)». Утверждены Комитетом Госсанэпиднадзора РФ 15.05.1996 г.
Методические рекомендации «Организация и проведение мероприятий против Крымской геморрагической лихорадки на территории природных очагов России». Утверждены Первым заместителем Министра здравоохранения РФ, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 23.03.2001 г.
Методические рекомендации «Оценка клинических и лабораторных данных (ГЩР, ИФА) при диагностике Крымской геморрагической лихорад-
ки». Одобрены Ученым советом СтавНИПЧИ (протокол №3 от 20.03.2002 г.) и утверждены директором института.
Методические рекомендации «Выявление вируса гепатита А в объектах внешней среды и материале от больных людей». Одобрены Ученым советом СтавНИПЧИ (протокол №4 от 29.04.2004 г.) и утверждены директором института.
Методические рекомендации «Применение магнитных иммунных сорбентов (МИС), ИФА и ПЦР для выявления возбудителя Крымской геморрагической лихорадки в природных очагах инфекции». Одобрены Ученым советом СтавНИПЧИ (протокол №5 от 25.05.2004 г.) и утверждены директором института.
Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах по первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ и семинарах для практических врачей и научных работников МЗ РФ по экспресс-диагностике инфекционных заболеваний и применению магносорбентных препаратов в мониторинге инфекционных агентов.
Основные положения, выносимые на защиту:
Изучение диагностической ценности экспериментальных тест-систем для ИФА и ПЦР при проведении лабораторного анализа на вирусный гепатит А и Крымскую геморрагическую лихорадку.
Принципы комплексного использования иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией при лабораторной диагностике Крымской геморрагической лихорадки на разных стадиях заболевания.
3. Методология конструирования иммуноферментных диагностику-
мов, обеспечивающих высокую эффективность обнаружения возбудителей
опасных и особо опасных вирусных инфекций и их антигенов в экспериментальных и полевых условиях.
Методологические подходы и разработка биотехнологии изготовления твердофазных микрогранулированных композиционных аффинных маг-нитоуправляемых сорбентов для избирательного концентрирования вирусов и использования в экспрессных методах диагностики (ИФА и ПЦР).
Результаты экспериментальных, клинических и полевых испытаний тест-систем для диагностики вирусного гепатита А, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей.
Публикации
Основное содержание диссертации, выполненной в рамках 5 НИР, отражено в 39 опубликованных работах (монография - 1, в ведущих научных журналах, рекомендуемых ВАК - 6 статей, депонированых - 6 статей, в 1 патенте РФ на изобретение, в материалах международных, межгосударственных и всероссийских научных конференций - 7 публикаций, в иностранных журналах - 1; в материалах научно-практических конференций - 16), а также в 1 нормативном документе (Инструкция) и 6 методических рекомендациях и указаниях.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на
научной конференции « Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций» (Ставрополь, 1991); научной конференции «Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных заболеваний» (Омск, 1993); Всесоюзной научно-практической конференции «Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики» (Пермь, 1993); Межгосударственной научно-практической конференции «Актуальные вопросы профилактики чумы и
других инфекционных заболеваний», посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы (Ставрополь, 1994); научно-практической конференции «Актуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний», посвященной 60-летию противочумной службы Кавказа (Ставрополь, 1995); научной конференции Ставропольского отделения Российского научного общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Ставрополь, 1995); конференции «Эпидемиологические и клинико-иммунологические аспекты профилактики важнейших инфекционных заболеваний» (Астрахань, 1996); 4-й итоговой научной конференции молодых ученых и студентов (Ставрополь, 1996); научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997); VII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997); международной научно - практической конференции «Проблемы санитарно-эпидемиологической охраны территории стран Содружества Независимых Государств» (Саратов, 1998); научной конференции, посвященной 70 - летию биолого-химического факультета "Проблемы развития биологии и химии на Северном Кавказе» (Ставрополь, 2001 г.); межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные аспекты природно-очаговых болезней», посвященной 80-летию Омского НИИПИ (Омск, 2001); рабочем совещании по обсуждению проекта программы «Профилактика особо опасных и природно-очаговых инфекций и санитарная охрана территории Южного Федерального округа Российской Федерации от завоза и распространения инфекционных заболеваний (2003-2005гг.)» (Ставрополь, февраль, 2002); 47-й научно-методической конференции преподавателей и студентов «Университетская наука - региону» (Ставрополь, апрель, 2002); II Республиканской научной конференции «Экология, биоразнообразие и значение кровососущих насекомых и клещей экосистем России» (Великий Новгород, май, 2002); научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность. Итоги и перспективы», посвященной
50-летию СтавНИПЧИ (Ставрополь, октябрь 2002); 4-й Межгосударственной научно-практической конференции государств - участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, сентябрь, 2003); VI Российском съезде врачей - инфекционистов (Санкт-Петербург, октябрь, 2003); Международной конференции по вновь появляющимся инфекционным болезням (США, Атланта, 2004).
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Она изложена на 271 странице, содержит 19 таблиц и 33 рисунка. Список литературы включает 365 отечественных и 173 зарубежных литературных источников.
Проблема вирусного гепатита А и его лабораторная диагностика
Вирусные гепатиты (ВГ) продолжают оставаться одной из главных проблем здравоохранения как в нашей стране, так и в большинстве стран мира. За последние 5 лет в Российской Федерации произошли существенные изменения в динамике заболеваемости, разработке средств диагностики и профилактики вирусного гепатита А (ГА) - инфекции с фекально-оральным механизмом передачи.
За рассматриваемый период в динамике заболеваемости вирусного ГА отмечались противоположные тенденции («Эпидемиологическая обстановка в РФ и основные направления деятельности по её стабилизации», 2002).
По данным Главного государственного санитарного врача РФ Г.Г.Онищенко (2001, 2002, 2002а), в 1997-1999 гг. имело место значительное сокращение заболеваемости, что объясняется совпадением по времени двух процессов: очередного снижения заболеваемости в её многолетних циклических колебаниях и резкого (примерно на 10 млн) сокращения количества детей дошкольного возраста, среди которых ранее в основном циркулировал вирус. В 2000 г. произошел перелом в развитии эпидемиологического процесса, уровень заболеваемости возрос по сравнению с предыдущим годом на 63 %, в 2001 г. - на 78 %. В целом по стране показатель заболеваемости составил 78 на 100 тыс. населения, а в Ивановской, Амурской, Костромской, Смоленской , Ленинградской областях, республиках Карелия, Тыва, Карачаево-Черкесской, Ингушской, Приморском крае - 143 - 280, Читинской обл. -961, в Бурятском автономном округе - 1685.
Отмечено, что за период 1997-2001 гг. произошло смещение максимальных возрастных показателей на более старшие возрастные группы (11-14, 15-19, 20-29 лет). Если ранее удельный вес детей до 14 лет составлял 60% и более, то в 2000-2001 гг. - 40-41 %. Это объясняется сохраняющимся риском заражения взрослого населения вирусом гепатита А при отсутствии у значительной его части иммунитета, который прежде формировался в детском возрасте за счет интенсивного, зачастую скрытого вовлечения детей в эпидемический процесс, а также резким сокращением числа детей, посещающих дошкольные учреждения, и количества этих учреждений, где нередко имеют место условия для реализации контактно-бытового пути передачи вирусного ГА.
Распространению вирусного гепатита А способствуют серьезные недостатки в обеспечении населения доброкачественной питьевой водой. В последние годы количество проб воды водоемов первой категории, не соответствующих стандартам по микробиологическим показателям, даже несколько возросло и превышает 20 %. В местах водозаборов в 2-5 % проб воды обнаруживаются возбудители кишечных инфекций и антиген ВГА. Практически не сокращается количество водопроводов, не имеющих полного комплекса очистных сооружений (35 %) и обеззараживающих установок (17 %). Возрастает количество водных вспышек кишечных инфекций и вирусного ГА. В 2001 г. зарегистрировано 9 вспышек ВГА с числом пострадавших более тысячи человек. Наиболее высокие показатели заболеваемости вирусным ГА имеют место в регионах, где в качестве источников водоснабжения используются в основном открытые водоемы.
В Ставропольском крае, начиная с 1997 г., наметилась тенденция к снижению заболеваемости гепатитом А. По сравнению с 1995 г., когда отмечалась активизация эпидемического процесса, заболеваемость ГА к 1997 г. снизилась в 5,7 раза и составила 42,4 на 100 тыс. населения (Антоненко А.Д. с соавт., 1999). В 2002 г. в структуре вирусных гепатитов в крае ГА занимал ведущее место (58,0 %), и продолжалась тенденция снижения заболеваемости вирусным ГА. Показатель заболеваемости составил 37,9 на 100 тыс. населения, что на 15,8 % ниже уровня 2001 г. и на 19,0 % - средне-российского показателя. В возрастной структуре заболеваемости 41,2 % случаев пришлось на детей до 14 лет. Наиболее пораженной возрастной группой оставались дети в возрасте 11-14 лет, показатель заболеваемости которых составил 113,6 на 100 тыс. данной возрастной группы. Удельный вес вспышечной заболеваемости ГА составил 5,5 % (2001 г. - 27,8 %). Основными причинами заболевания во всех случаях явилось отсутствие условий для соблюдения личной гигиены и нарушение противоэпидемического режима, приведшие к распространению инфекции (Ковалев Н.Г., 2003).
В настоящее время вирусный ГА занимает ведущее место в этиологической структуре вирусных гепатитов у детей в РФ, а уровень заболеваемости этой инфекцией в детском возрасте в России в несколько раз превышает соответствующие показатели в развитых странах мира (Каретный Ю.В., Каганов Б.С, Добротворский И.Л., 2002).
Объекты исследования, взятые в работу
При выполнении экспериментальных работ использовано следующее оборудование и аппаратура:
- иономер универсальный (завод измерительных приборов, г. Гомель, Белоруссия);
- мешалка магнитная ММ-5 (завод комплектных лабораторий, г. Мука-чево, Украина);
- термостат электрический суховоздушный ТС-80м (Одесское ПО лабораторной медицинской техники «Медлаборатортехника», Украина);
- микроскоп биологический «Биолам PI» (ЛОМО, г. Санкт-Петербург);
- морозильное устройство НС-280/75 («Фригера», национальное предприятие Колин, Чехословакия);
- холодильник бытовой (Московское ПО ЗИЛ);
- установка для сублимационной сушки ТГ-5 (г. Дрезден, Германия);
- весы технические ВСМ-20 (г.Нижний Тагил);
- весы электронные Sartorius (Германия);
- центрифуга лабораторная К-24 (Германия);
- спектрофотомер СФ-26 (ЛОМО, г. Санкт-Петербург);
- баня водяная лабораторная (инактиватор) (Львовский завод радиоэлектронной медицинской аппаратуры, Украина);
- шуттель-аппарат АВУ-1 (Киевский завод медоборудования, Украина);
- прибор для встряхивания и инкубирования планшет Thermoshaker ST (Литва);
- регистрирующий спектрофотометр Multiskan (LKB, Швеция);
Титр в ИФА 1:200000 СтавНИПЧИ
амплификаторы ДНК Mastercycler 22331 (Eppendorf, Germany) и 2400 Gene Amp PCR System (Perkin - Elmer, USA);
камеры для горизонтального электрофореза Sunrise (Life Technologies - Gibco BRL Horizontal Gel Elecrophoresis Apparatus, USA) и Gel Ele-crophoresis Apparatus GNA-200 (Pharmacia Fine Chemicals, Sweden);
ультрафиолетовый трансиллюминатор TFX-20 (Life Technologies - Gibco BRL UV Transilluminator, USA);
система регистрации изображений в геле Kodak Digital Sciense
ED AS 120 System (Eastman Kodak, USA).
2.4. Экспериментальные и коммерческие тест-системы для диагностики вирусного гепатита А, Крымской геморрагической лихорадки и детекции их возбудителей
Для проведения ИФА использованы следующие тест-системы:
- иммуноферментная тест-система для выявления антител класса G к вирусу ГА ( «ДИА плюс», Москва);
- «Вектогеп-А-антиген-стрип», (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск);
- экспериментальные тест-системы иммуноферментные для индикации антигена вируса КГЛ, антител классов М и G в сыворотках крови людей к вирусу КГЛ, изготовленные в НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского (Москва);
- тест-системы иммуноферментные «ВектоКрым-КГЛ антиген», «Век-тоКрым-КГЛ - IgM», «ВектоКрым-КГЛ - IgG», (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск);
- конъюгат белка А, меченный пероксидазой, сухой (институт им. Пас-тера, Санкт-Петербург).
class3 РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ МАГНОИММУНОСОРБЕНТНОЙ ГЕПАТИТНОЙ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ В
ИФА class3
Разработка биотехнологии получения полиакрила- мидного магнитного сорбента
Наиболее важными моментами в технологии получения магносорбентов являются проблема стабилизации дисперсий, выбор оптимальных стабилизаторов и их концентрации, хорошее смачивание раствором мономеров частиц капсулируемого продукта и адгезия капель олигомера к их поверхности, а также скорость полимеризации мономеров.
При выборе магнитного материала мы исходили из того, что он должен иметь механическую прочность, выраженные магнитные свойства, мелкодисперсное состояние, коррозийную устойчивость в жидких средах, хорошую включаемость в полимер микрогранул, обладать инертностью по отношению к биологическим препаратам. Таким требованиям отвечала окись железа.
С целью повышения уровня гидрофильных свойств магнитного порошка, для лучшего включения его в полиакриламидные гранулы разработана методика, включающая предварительную обработку магнитного порошка путем промывки его ацетоном, дистиллированной водой, с последующим фосфатированием. Фосфатное покрытие, кроме повышения уровня гидрофильности порошка, достаточного для включения в полиакриламид-ный гель, дополнительно придавало коррозионную стойкость.
Разработанный нами метод заключался в следующем. Навеску магнитного порошка заливали 2-3-х кратным объемом ацетона и перемешивали 3-5 мин. Операцию повторяли 2-3 раза, затем порошок отмывали от ацетона 5-10 объемами дистиллированной воды 3-5 раз. Навеску обезжиренного порошка помещали в емкость с 5-10 объемами состава, содержащего 2 г/л ортофосфорной кислоты и 2 г/л хлорного железа. Затем магнитный порошок 5-10 раз отмывали 5-10 объемами дистиллированной воды и 3-5 раз 10 объемами 0,1 М фосфатного буферного раствора рН (8,1 ±0,1) до получения нейтрального значения рН промывной жидкости. Магнитный порошок сушили на фильтровальной бумаге при комнатной температуре и использовали для приготовления магнитных сорбентов.
В качестве носителя был выбран полиакриламидный гель, представляющий продукт сополимеризации акриламида CH2=CH-CO-NH2 и сшивающего агента- N,N - метиленбисакриламида-СН2=СН-СО-1ЧН-СН2 -NH-CO-СН=СН2. Нити линейного полимера акриламида , сшитые N,N - метиленби-сакриламидом, образуют относительно жёсткую и химически инертную пространственную сетку геля, хорошо удерживающую воду. Пористость и жёсткость геля определяется процентным содержанием в нём полимера. Рабочий диапазон рН 3-8. Гель можно автоклавировать, он выдерживает контакт с различными органическими кислотами, детергентами. В результате исследований нами разработана технология получения магнитных сорбентов на основе полиакриламидного геля методом блочной и эмульсионной полимеризации геля. Иммобилизацию иммуноглобулинов осуществляли путём механического включения в структурную решётку геля или на его поверхности после предварительной активации глутаровым альдегидом. Блочная полимеризация проще, но теряется часть включаемого материала, поэтому мы использовали второй тип полимеризации.
Метод заключался в следующем. На дно реактора емкостью 300-400 мл, содержащего 200-220 мл гептана и 0,5 мл эмульгатора СПЭН-85, подавали газообразный азот под давлением 2х104 - 5x104 Па и барботировали в течение 10-15 минут, чтобы создать интенсивное перемешивание (гептан, насыщенный азотом, при этом занимает вдвое больший объем по сравнению с первоначальным). Сомономеры реакции полимеризации геля (1,5 г акриламида и 0,5 г метиленбисакриламида) растворяли в 0,5 мл дистиллированной воды. К раствору добавляли 0,75 мл 10 % расплавленного желатина, 1,5 г обработанного магнитного порошка и 6 мг персульфата аммония. Увеличивая подачу азота в реактор до 1х105 - 1,5х105 Па, к органической фазе добавляли раствор ингредиентов водной фазы. За счет интенсивного перемешивания через 2-3 минуты происходило образование равномерной эмульсии. После внесения в реактор 0,2 мл ТЭМЭДа реакцию продолжали еще минут до полной полимеризации геля. После окончания полимеризации смесь сливали, отделяли гранулы с помощью постоянного магнита и заливали их 100-150 мл 50 % раствора ацетона. Далее производили мокрое рассеивание через сито для отделения гранул размером от 20 до 100 мкм (Пушкарь В.Г. с соавт., 1984). На рисунке 1 представлены микрогранулиро-ванные полиакриламидные магнитные сорбенты.
