Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Роль неферментативного гликозилирования протеинов в патогенезе сахарного диабета 12
1,1 .Распространенность и социальная значимость сахарного диабета..12
1.2. Сосудистые осложнения и диагностические критерии сахарного диабета 13
1.3. Гликозилированный гемоглобин, его структура 17
1.4. Биохимия неферментативного гликозилирования протеинов 19
1.5. Роль гликозилированных протеинов в патогенезе сахарного диабета 21
1.6. Взаимосвязь между нарушениями углеводного обмена и онкологическими заболеваниями 23
1.7. Диагностическое значение определения уровня Hb Aic 27
1.8. Методы ранней диагностики нарушений углеводного обмена 27
1.9. Сравнительный анализ методов определения уровня НЬ А!С 28
Глава 2. Аффинный метод выделения биополимеров 33
2.1. Принцип аффинной хроматографии 35
2.2. Компоненты аффинного сорбента 36
2.3. Материалы, применяемые в качестве матрицы аффинного сорбента 37
2.3.1. Агароза 38
2.3.2. Поливиниловый спирт 40
2.3.3. Макропористое стекло 40
2.3.4. Полиакриламидный гель 41
2.4. Активация матрицы аффинного сорбента 42
2.5. Спейсеры 43
2.6. Лиганды 44
2.7. Аффинная модификация биополимеров 45
Глава 3. Материалы и методы исследования 49
3.1. Реагенты для синтеза аффинного сорбента с иммобилизованной м-АФБК 49
3.2. Реагенты для проведения цветных реакций 51
3.3. Реагенты для приготовления буферных растворов 51
3.4. Объекты исследования на аффинных сорбентах 51
3.5.Приборы, необходимые для работы 52
3.6. Определение рН растворов стеклянным электродом 52
3.7. Определение оптической плотности растворов 52
3.8. Определение альдегидных групп реактивом Шиффа 53
3.9. Определение альдегидных групп реактивом Несслера 53
3.10. Цветная реакция с ТНБС натрия 53
3.11. Определение оксирановых групп тиосульфатом натрия 54
3.12. Определение карбоксильных, гидразидных и аминных групп
кислотно-основным титрованием 54
3.13. Статистическая обработка результатов 55
Глава 4. Создание аффинных сорбентов с иммобилизованной лг-АФБК для количественного определения гликозилированного гемоглобина 56
4.1. Аффинный сорбент с иммобилизованной ,«-АФБК на основе гранулированной агарозы 57
4.1.1. Приготовление матрицы аффинного сорбента эпоксиактивацией гранулированной агарозы 58
4.1.2. Иммобилизация м-АФБК на модифицированную агарозную матрицу сорбента 58
4.2. Аффинный сорбент с иммобилизованной лг-АФБК на основе модифицированного ПААГ 59
4.2.1. Синтез широкопористого ПААГ в качестве матрицы аффинного сорбента 59
4.2.2. Модифицирование ПААГ гидразингидратом 60
4.2.3. Активация глутаровым алвдегидом гидразидного производного полиакриламидного геля 61
4.2.4. Иммобилизация л
4.2.5. Стабилизация азометимовых связей в аффинном сорбенте с иммобилизованной .«-АФБК 63
4.3. Аффинное выделение гликогемоглобина 65
4.4. Хроматограмма выделения гликозилированного гемоглобина 65
4.5. Формула расчета содержания НЬА|С 66
4.6. Механизм аффинного взаимодействия сорбентов с иммобилизованной.и-АФБК с гликозилированным гемоглобином 66
4.7. Исследование количественной характеристики параметров синтеза аффинного сорбента с иммобилизованной м- АФБК на основе
4.7.1. Исследование влияния бис-метиленакриламида на свойства полиакриламидного геля 68
4.7.2. Исследование зависимости изменения емкости сорбента от содержания бора в лиганде 69
4.7.3. Исследование зависимости соотношений между количеством связавшегося лиганда и концентрацией исходного раствора 70
4.7.4. Определение рН-оптимума буферной системы при иммобилизации л-/-АФБК 71
4.8. Исследование влияния температуры на сорбционнуго активность аффинного сорбента на основе ПААГ 72
4.9. Исследование изменения емкости сорбента от объема нагрузки .74
4.10. Исследование емкости сорбента при нагрузке гликогемоглобином от изменения рН буфера 75
4.1.1. Воспроизводимость результатов определения HbAic при многократном использовании одной колонки с аффинным сорбентом на основе ПААГ с иммобилизованной м- АФБК 75
4.1.2. Вариабельность показателей определения HbAic, многократно проведенных на одной колонке с аффинным сорбентом на основе ПААГ . 76
4.13. Исследование воспроизводимости результатов определения HbAic, полученных при многократном использовании одной колонки с аффинным сорбентом на основе агарозы 77
4.14. Оценка эффективности применения аффинного сорбента на основе макропористого стекла 79
Глава 5. Разработка методики количественного определения гликозилированного гемоглобина аффинной тест-системой 80
5.1. Техника безопасности при проведении работ по определению гликозилированного гемоглобина 80
5.2. Технология приготовления гемолизата крови 81
5.3. Изготовление миниколонок с аффинным сорбентом 81
5.4. Приготовление буферных растворов 82
5.5. Проведение анализа определения содержания HbAjc 83
5.6. Регистрация и оценка результатов определения НЬА1с 84
5.7. Регенерация и условия хранения миниколонок с аффинным сорбентом для количественного определения HbAic 85
Глава 6. Экспериментально-клинические испытания тест-системы для количественного определения HbAic... 85
6.1. Определение гликемического статуса пациентов поликлиники УНЦ РАН 85
6.2. Определение НЬА)с у больных сахарным диабетом, отягощенных офтальмологической патологией 86
6,2.1. Определение НЬА|С аффинной тест-системой на основе ПААГ с иммобилизованной .м-АФБК 87
6.2.2. Определение НЬА(с аффинной тест-системой на основе
модифицированной агарозы с иммобилизованной лг-АФБК 88
6.3. Определение НЬА,С аффинной тест-системой на основе ПААГ у пациентов эндокринологического отделения РДКБ 89
6.4. Сравнительная характеристика диагностику мов, использованных для определении НЬА]с 90
6.5. Исследования гликемического статуса онкобольных методом аффинной хроматографии 92
Глава 7. Разработка периодатного метода определения гликозилированного гемоглобина 95
7.1. Определение НЬА методом периодатного окисления с последующей детекцией альдегидных групп реактивом Несслера 97
7.2. Определение НЬА, методом периодатного окисления с последующей рН-метрической детекцией 98
Заключение 101
Выводы 106
Список литературы 108
Приложения
- Сосудистые осложнения и диагностические критерии сахарного диабета
- Принцип аффинной хроматографии
- Реагенты для синтеза аффинного сорбента с иммобилизованной м-АФБК
Введение к работе
Актуальность исследований. Аффинные сорбенты с использованием иммобилизованной аминофенилбороновой кислоты (АФБК) позволяют выделять биополимеры, содержащие г/иодиольные группы, например, нуклеозиды, гликопротеины, нуклеиновые кислоты, моносахариды, биологически активные вещества [1-3]. Монослой производного АФБК на ферментном электроде применяют для определения глюкозы [4], как сенсор моносахаридов [5], для ингибирования липазы [6]. Сорбент с иммобилизованной ФБК используется при испытании различных лекарственных средств на активность растворимой и связанной с мембраной дофамин-[3-гидроксилазой [7], удалении кетоз из реакционной смеси, содержащей алъдозы [8], стерическом блокировании адгезии клеток с биологическими тканями [9], при экстракции нуклеозидов из мочи [10].
Преимущества использования аффинных сорбентов очевидны, поэтому их применение ежегодно расширяется. Однако, несмотря на широкий выбор носителей и реагентов для иммобилизации, проблема поиска, разработки и исследования новых аффинных сорбентов является одной из актуальных задач биотехнологии. В рамках национальной программы «Развитие биотехнологии в Российской Федерации на 2006-2015 г.г.» [11] один из проектов направлен на совершенствование лабораторной диагностики.
В настоящее время сахарный диабет является глобальной медико-социальной проблемой. По данным ВОЗ, сахарным диабетом страдает 2-5 % населения всего мира, т.е. более 150 млн. человек. Заболеваемость и общее число больных во всех странах мира ежегодно увеличивается на 5-\0 %. После сердечно-сосудистых (51 %) и онкологических заболеваний (17 %) сахарный диабет занимает третье место (6 %) по инвалидизации и смертности населения в мире [12-16].
Разработка методов ранней диагностики нарушений углеводного обмена включает и поиск новых скринирующих биомаркеров, одним из которых является гликозилированный гемоглобин (НЬА(С). Величина HbAic представляет собой интегральный показатель уровня гликемии за период, определяемый временем полужизни эритроцита в кровотоке (90-120 дней), который не подвержен резким колебаниям в течение короткого промежутка времени, что характерно для уровня глюкозы в крови [17-19]. В настоящее время интерес к применению показателя НЬА|С для диагностики диабета возрос [20-25], но широкое использование этого надежного параметра в клиниках сдерживается из-за сложности методов его определения, дороговизны оборудования и импортных химических реактивов. Анализ существующих методов определения HbAic показывает, что аффинные методы являются одними из наиболее перспективных и разрабатываемых областей биотехнологии.
Цель работы заключалась в создании аффинной тест-системы на основе высокомолекулярных соединений с иммобилизованной мета-аминофенилбороновой кислотой для многократного количественного определения гликозилированного гемоглобина. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1). Синтезировать сорбенты с использованием различных материалов в качестве матрицы (агарозы, стекла, полиакриламидпого геля), с иммобилизованной м-АФБК и оценить их эффективность.
2). Определить оптимальные параметры синтеза аффинного сорбента с иммобилизованной ж-АФБК на основе модифицированного полиакриламидного геля.
3). Исследовать влияние температуры на сорбционную активность аффинного сорбента.
4). Разработать методику многократного количественного определения НЬА,с в крови человека аффинной тест-системой.
5). Определить степень корреляции уровня гликозилированного гемоглобина с содержанием глюкозы в крови.
6). Испытать аффинную тест-систему по определению гликозилированного гемоглобина на образцах крови здоровых доноров. больных сахарным диабетом и с онкологическими заболеваниями. Научная новизна. Разработан новый метод иммобилизации .м-АФБК на полиакриламидном сорбенте путем активации матрицы гидразин-гидратом с последующей обработкой глутаровым альдегидом. Синтезирован новый широкопористый аффинный сорбент с иммобилизованной м-АФБК, пригодный для многократного количественного определения HbAjc-Разработана аффинная методика количественного определения НЬАІС в микроколоночном исполнении, позволяющая выявлять ранние и латентные формы нарушений углеводного обмена у человека.
Основные положения, выносимые на защиту:
Разработан метод синтеза широкопористого полиакрил амид но го аффинного сорбента с иммобилизованной л-г-АФБК путем активации его гидразин-гидратом с последующей обработкой глутаровым альдегидом.
Определены условия получения аффинного сорбента с достаточным содержанием лиганда для выделения гликозилированного гемоглобина.
Аффинный сорбент с иммобилизованной м-АФБК на основе ПААҐ пригоден для многократного количественного определения НЬАіс-
Разработана методика многократного количественного определения НЪА|С.
Тест-система на основе модифицированного ПААГ с иммобилизованной .м-АФБК пригодна для проведения массовых скрининговых исследований и обладает следующими преимуществами: 1) высокой специфической емкостью; 2) достаточной механической прочностью, необходимой для микроколоночного варианта проведения анализов; 3) биологической инертностью; 4) воспроизводимостью результатов.
Практическая значимость. Аффинный сорбент с иммобилизованной .м-АФБК на основе модифицированного ПААГ может быть использован для контроля эффективности лечения сахарного диабета, в скрининге ранних и латентных форм сахарного диабета. Разработанную нами аффинную тест-систему в форме набора миниколонок с сорбентом и комплекта буферов можно использовать в любой клинической лаборатории. Аффинная тест-система не уступает зарубежным аналогам ("Diagnostics Glycated Hemoglobin [HbAj]", фирмы "Sigma", США), но в то же время экономически более выгодна ввиду того, что каждая микроколонка позволяет произвести определение HbAic многократно (7 циклов).
Внедрение в практику результатов исследований осуществлено в Республиканской клинической больнице, поликлинике УНЦРАН, Уфимском НИИ глазных болезней, Республиканском онкологическом диспансере.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на II на и III съездах биохимического общества РАН (Пущиио, 1997), на симпозиуме «Биохимия - медицине» (Санкт-Петербург, 2002), 1-ой Всероссийской научной internet-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофункциональных систем» (Уфа, 2002), на конференциях биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири «Актуальные проблемы прикладной биохимии и биотехнологии» (Уфа, 1998), биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 1999), «Современные методы диагностики» (Барнаул, 1999), «И.П. Павлов и современные проблемы биологии и медицины» (Уфа, 1999), «Безопасность - 2000: проблемы прогнозирования, предотвращения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций» (Уфа, 2000), «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2002), «Актуальные проблемы технических, естественных и гуманитарных наук» (Уфа, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в т.ч. 2 статьи в рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах, содержит 24 таблицы, 18 рисунков, 6 схем. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 285 источника (137 отечественных и 148 зарубежных), приложений наЗ листах.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Сосудистые осложнения и диагностические критерии сахарного диабета
Эти три формы поражения встречаются в коронарных, мозговых, почечных артериях и артериях верхних и нижних конечностей [16, 37-41 ], способствуют тромбообразованию, приводя к инфаркту миокарда, нарушению мозгового кровообращения. У 70-80 % больных диабетом диагностируется ишемическая болезнь сердца [42-48], т.е. в 6 раз чаще, чем у лиц того же возраста, не имеющих нарушений углеводного обмена. Почти у 55 % больных СД инфаркт миокарда является причиной смерти. По данным различных авторов, от 32 до 42 % больных СД не отмечали во время инфаркта миокарда болевого синдрома. Это создает трудности в диагностике инфаркта миокарда и нередко приводит к летальному исходу (до 47 %). Отсутствие болей связывают со снижением кардинальных висцеромоторных и висцеросенсорных рефлексов [49-50]. Предполагают, что безболевые формы инфаркта миокарда у больных диабетом обусловлены автономной (вегетативной) нейропатией, при которой повреждаются висцеральные нервы, определяющие болевую чувствительность миокарда [51, 52].
Поражения сосудов сетчатки носят общий характер диабетических ангиопатий, к этим изменениям присоединяются явления дегенерации перицитов, дегенеративные процессы в сетчатке, ее отторжение и глаукома [16, 53-56]. Самым характерным офтальмоскопическим проявлением диабетической ретинопатии являются микроаневризмы - цилиндрические расширения, расположенные проксимально в венных капиллярах сетчатки. Микроаневризмы могут наблюдаться при гипертонической болезни или после тромбоэмболии, но в таких случаях они располагаются, как правило, на периферии сетчатки, поражают артериальную сеть капилляров, бывают более массивными и имеют регрессивное развитие, чего не наблюдается при сахарном диабете [57-61].
Более 40 % больных СД страдают диабетической нефропатией [62-65], которая является основной причиной летального исхода. Это обусловлено тем, что гистологически диагностированная нефропатия не всегда сопровождается клиническими проявлениями. Диабетическая нефропатия обусловлена клеточной пролиферацией эндотелия и утолщением базальной мембраны [66-69].
Диабетическая нейропатия проявляется в нарушении глубокой и поверхностной чувствительности, снижении рефлексов, двигательных расстройств. Симптомы нарушения нервной системы отмечаются у 25-70 % больных СД [70-73].
Характерными проявлениями диабетической остеоартронатии являются так называемые "кубическая стопа" и трофические поражения костей [16, 74, 75]. Клинически при этом наблюдается медленное припухание стопы при отсутствии признаков воспаления или скапливания жидкости. В дальнейшем нарушается структура костей.
Гипергликемическая кома у больных диабетом обусловлена отравлением организма кетоновыми телами. Развивается диабетическая кома постепенно, на протяжении нескольких часов или дней. В результате нарушения сердечной деятельности и потере сознания может наступить летальный исход.
Гипогликемическая кома обусловлена резким снижением содержания сахара в крови - до 1,7-2,8 ммоль/л (30-50 мг %), в результате чего наступают изменения в ЦНС. Гипогликемическая кома развивается внезапно, за несколько минут, приводит к потере сознания и появлению судорог.
Таким образом, нарушение обмена веществ при СД приводит к изменению функциональной активности всех органов и систем. Нарушение кровообращения в пораженных сосудах нижних конечностей ведет к трофическим изменениям кожи голени и гангрене. Повреждения мелких сосудов (микроангиопатии) распространяются патологическим процессом на всю микрососудистую систему организма с вовлечением сосудов кожи, мышц, сосудов, питающих нервы и стенки крупных сосудов и др. [76-84].
Принцип аффинной хроматографии
Принцип АФХ очень прост и нагляден, однако конструирование аффинного обмениика для очистки нужного вещества является делом достаточно деликатным. Необходимо разумно выбрать матрицу, найти способ щадящего и вместе с тем надежного и вполне определенного ковалентного закрепления на ней соответствующего данной задаче лиганда через спейсер, который также надо выбрать как в отношении его размеров, степени гидрофильности, так и в отношении способов его связывания с матрицей и лигандом [3].
Любой из компонентов биоспецифических пар можно надежно закрепить на матрице в качестве так называемого «лиганда». С его помощью второй партнер пары может быть извлечен из смеси с другими, не комплементарными лиганду веществами и временно задержан на матрице е составе биоспецифического (аффинного) комплекса. Иногда это может быть не одно, а несколько родственных или схожих по своей структуре веществ, «узнающих» один и тот же лиганд, например, изоферменты или ряд ферментов, использующих один и тот же кофермент, различные виды антител к одному и тому же антигену.
После удаления посторонних примесей промывкой и изменив состав элюента можно нарушить биоспецифическую связь лиганда с веществом, что позволяет быстро вывести последнее из колонки или легко отмыть его на фильтре, если аффинную очистку ведут в свободном объеме.
Аффинную связь вещества с сорбентом можно нарушить либо непосредственно, путем создания неблагоприятных для биоспецифического взаимодействия условий, либо путем конкурентной аффинной элюиции. Биоспецифическое взаимодействие реализуется за счет сил связи между молекулами: электростатического притяжения разноименно заряженных групп, водородных и Ван-дер-ваальсовых сил, гидрофобного взаимодействия. Биоспецифичность определяется конформационным соответствием участков связывания, что приводит к суммированию различных взаимодействий, осуществляющихся одновременно в нескольких точках. Ослабление биоспецифических сил связи может быть достигнуто обычными приемами: изменением рН, увеличением ионной силы и температуры элюента, введением в его состав органических растворителей, детергентов или хаотропных агентов. Высокая степень аффинного сродства в некоторых случаях может быть нарушена только путем использования жестких воздействий, но они могут привести к необратимой денатурации очищаемого вещества. Это обстоятельство можно обойти, используя, конкурентный вариант элюции. В этом случае в состав элюента вводят растворенный лиганд, тоже обладающий биоспецифическим сродством к элюируемому веществу (аффинная элюция). Благодаря специфической конкуренции очищаемое вещество может постепенно сниматься с матрицы и элюироваться в виде комплекса с аффинным элюентом. Задачу получения очищенного вещества решают разрушением аффинного комплекса уже в растворе, элюированном с сорбента.
Реагенты для синтеза аффинного сорбента с иммобилизованной м-АФБК
гранулированную агарозу фирмы "Ferak" (Германия), МПС-1500, Акрилекс-350 ("Reanal", Венгрия), широкопористый ПААГ, полученный из реактивов фирмы "Reanal" (Венгрия); акриламид, И -метилен-бисакриламид, персульфат аммония, К,Ы,Н№-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД). Для активации матрицы сорбента использовали гидразин-гидрат, глутаровый альдегид ("Reanal", Венгрия), отечественный эпихлоргидрин (х.ч.), периодат натрия (х.ч.).
При синтезе аффинного сорбента в качестве лиганда была использована ж-АФБК фирмы "Sigma" (США). При иммобилизации лиганда были использованы этиловый спирт, NaOH, натрий-фосфатный буфер. Для стабилизации азометиновых связей в сорбенте использовали отечественный боргидрид натрия,
Акриламид CH2=CH-CONH2. М.в. 71,08. Белый кристаллический порошок. Токсичен; воздействует на кожу и нервную систему. Работать с ним в перчатках и под тягой. Его 5 %-ный водный раствор должен иметь рН не ниже 5, а оптическая плотность 1 %-ного раствора при 290 нм не должна превышать 0,15. Недостаточно чистый препарат можно перекристаллизовать: 70 г А. растворяют в 1 л хлороформа при 50 С, фильтруют при этой же температуре, затем охлаждают до -20 С, быстро промывают кристаллы холодным хлороформом и высушивают в вакуум-эксикаторе. Акриламид следует хранить сухим, в темной посуде, предпочтительно на холоде.
Персульфат аммония (NH)2S04. М.в. 228,20. Плотность 1,982. Белый кристаллический порошок или гранулы. Используется в качестве инициатора процесса полимеризации. Гомолитический разрыв связи между атомами кислорода в молекуле персульфата аммония приводит к образованию двух достаточно долго живущих свободных радикалов с одним неспаренным электроном у атома кислорода: следующей молекулы акриламида с образованием нового радикала и т.д. Цепная реакция полимеризации идет до тех пор, пока два радикала, встретившись между собой, не образуют обычную ковалентную связь. По тому же механизму в растущую цепочку линейного полимера может одной из своих концевых винильных групп встроиться и метиленбисакриламид. Второй его конец может точно так же оказаться в составе другой полимерной цепочки, и образуется "сшивка". Следует использовать только свежеприготовленные растворы персульфата аммония.
KN - Метиленбисакриламид (CH2=CHCO-NH)2-CH2. М.в. 154,] 7. Используется в качестве "сшивки" линейных полимеров акриламида. Дополнительная очистка: перекристаллизация в ацетоне (12 г/л) в тех же условиях, что и акриламида. Условия хранения и токсичность - такие же, как у акриламида.
ТЕМЕД (Тетраметилэтилендиамин) (CH3)2N(CH2)2N(CH3)2. Бесцветная жидкость с плотностью 0,78 г/см . Концентрация неразбавленного ТЕМЕД -около 6,7 М. ТЕМЕД служит катализатором процесса полимеризации.
Гидразин-гидрат H2N-NH2. М.в. 50,06. Плотность 1,03 г/см3. Температура кипения 118,5 С (740 мм. рт. ст.). Смешивается с водой и спиртом. Гигроскопичен, на воздухе поглощает С02, разрушает стекло и резину. Горячие пары при соприкосновении с воздухом взрываются. Ядовит, попадая на кожу, вызывает экзему. Работать под тягой и в защитных очках, резиновых перчатках. Нагревание гидразина гидрата и его перегонку проводят в токе азота. Получение 6 М. гидразин гидрата:
