Введение к работе
1. 1.1.Актуальность темы.
Стремительное распространение среди крупного рогатого скота губкообразной энцефалопатии (ГЭ) во многих странах мира в последнее десятилетие прошлого века заставило ученых вновь обратить внимание на прионные инфекции и послужило толчком к более тщательному изучению патогенеза болезни, биологии возбудителя, выявлению источников и факторов его передачи (White T.J., 1992.)
Помимо ГЭ к числу прионных болезней сельскохозяйственных и домашних животных, имеющих важную экономическую значимость относится также трасмиссивная энцефалопатия норок (ТЭН). Данное заболевание имеет длительный инкубационный период, сопровождается дистрофичными поражениями центральной нервной системы, развитием дегенеративного губкообразного состояния серого вещества головного мозга и 100%-ной летальностью. Возбудителем ТЭН, как и других трансмиссивных губкообразных энцефалопатий, является инфекционный прионный белок (PrPSc), являющийся модифицированной изоформой нормального прионового белка (PrPc). (Борисов Л.Б., 2002; Слугин В.С., 2004).
Установлено, что единственным источником возбудителя прионных болезней является мясокостная мука, полученная из тканей пораженных животных (Marsh R.F et al., 1990). Поэтому в конце 90-х годов XX века во всех странах Европейского Союза (ЕС) был введен запрет на использование мясо-костной муки из тканей млекопитающих .для кормления животных.
В эти же годы участились случаи ввоза из-за рубежа в различные регионы России кормов для животных разных видов, в том числе и пушных зверей, в состав которых входили ткани животного происхождения. Использование такой продукции несёт в себе риски заноса на территорию Российской Федерации возбудителей не только прионных, но и вирусных
болезней, представляющих серьёзную угрозу для пушного звероводства, в частности Алеутской болезни норок (АБН).
АБН наносит огромный экономический ущерб звероводческим хозяйствам в связи с высокой смертностью животных (70-80%), ухудшением качества пушнины, снижением плодовитости самок и необходимостью проведения дорогостоящих ветеринарно-санитарных мероприятий. Болезнь характеризуется медленным развитием инфекционного процесса и пожизненной виремией. В организме больных норок вирус локализуется в сыворотке крови, головном мозге, мезентериальных лимфатических узлах, почках, селезенке, печени, слюнных железах, кишечнике. Высокая восприимчивость животных к АБН, устойчивость возбудителя к внешним условиям, использование для кормления пушных зверей тушек забитых животных и мясокостной муки из таких тушек, высокая устойчивость возбудителя АБН к воздействию факторов внешней среды обусловили широкое распространение инфекции во всех странах, где занимаются разведением норок (Слугин В.С., 2004).
Средства специфической профилактики данных болезней не разработаны. Важнейшим мероприятием по предотвращению ТЭН, как и АБН, служит ветеринарно-санитарный контроль кормов, используемых в пушном звероводстве.
Несмотря на запрет в странах ЕС использования для кормления животных мясо-костной муки из тканей млекопитающих, вероятность попадания её в Российскую Федерацию достаточно велика, особенно с рыбной мукой, фальсифицированной добавками протеинов млекопитающих. В целях недопущения поставок на территорию Российской Федерации подобной продукции в 2004 году распоряжением Россельхознадзора (№ 13-3-6/1825 от 24.09.2004) был запрещен ввоз на территорию РФ кормов, кормовых добавок и сырья для их производства, предназначенных для пушного звероводства, содержащих ткани жвачных и плотоядных.
Установлен порядок проверки каждой партии поступающих в РФ кормов на наличие белков жвачных и плотоядных.
Однако, существующие методы определения видовой принадлежности животных белков в составе корма, такие как иммунодиффузия в геле, изоэлектрическое фокусирование, РИД и ИФА оказываются малоэффективными, т.к. корма проходят термическую обработку, ведущую к денатурации белков, следствием чего является потеря ими видовой специфичности. В отличии от белков, ДНК более устойчива к термической обработке и не утрачивает своей информативной функции.
Поэтому применение молекулярно-генетических методов является перспективным для определения видовой принадлежности ДНК в составе продуктов и кормов, подвергавшихся термической обработке. Учитывая отсутствие доступных и информативных методик, необходимых для мониторинга и контроля как отечественных, так и импортных кормов, предназначенных для пушного звероводства, разработка ПЦР - тест-системы для определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в составе кормов для пушных зверей является весьма актуальной.
1.2.Цель и задачи исследований.
Целью настоящей работы являлась разработка тест-системы для идентификации ДНК пушных зверей методом полимеразной цепной реакции.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Определить принципиальную возможность выявления ДНК пушных зверей с помощью полимеразной цепной реакции, провести поиск и анализ нуклеотидных последовательностей, синтезировать праймеры.
-
Оценить эффективность существующих способов выделения ДНК в различных видах кормов (комбикормах, премиксах, (в т.ч. рыбной и в мясокостной муке) в кормовых добавках.
3. Провести оценку аналитических характеристик разработанной ПЦР-тест-системы для идентификации ДНК пушных зверей при тестировании различных видов кормов и кормовых добавок.
4. Провести комиссионные испытания разработанной ПЦР-тест-системы.
1.3. Научная новизна.
Впервые сконструированы оригинальные олигонуклеотидные
праймеры для амплификации специфических последовательностей ДНК пушных зверей.
Разработан положительный контрольный образец ДНК (ПКО), являющийся генно-инженерной конструкцией, несущей вставку фрагмента гена cytB. ПКО позволяет контролировать работу амплификационной смеси и является маркером длины ПЦР-продуктов.
Впервые в России разработана тест-система ПЦР для идентификации ДНК пушных зверей в кормах, обладающая 100% специфичностью с пределом аналитической чувствительности 0,1% примеси тканей пушных зверей в исследуемом материале или 10 пг ДНК пушных зверей в пробе.
1.4. Практическая значимость работы.
Впервые в России разработана и внедрена в практику тест-система
«ПЗ-ком» для идентификации ДНК пушных зверей методом полимеразной цепной реакции.
Внедрение в систему государственного контроля ПЦР тест-системы «ПЗ-КОМ» с декабря 2005 года позволило выявлять фальсификацию рыбной муки и кормов тканями пушных зверей, что имеет важное эпизоотологическое значение.
Результаты проведенных исследований вошли в следующие разработанные нормативные документы:
- Инструкция по применению тест-системы «ПЗ-КОМ» для
идентификации ДНК пушных зверей в кормах методом полимеразной
цепной реакции;
- Технические условия на тест-систему «ПЗ-КОМ» для
идентификации ДНК пушных зверей в кормах методом полимеразной
цепной реакции (ТУ № 9388-152-00494189-06).
С 2006 года на базе ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора аттестовано производство и налажен серийный выпуск тест-системы «ПЗ-КОМ». Рекламаций на тест-систему не поступало.
1.5. Апробация работы.
Основные положения диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях ученого совета ФГУ «ВГНКИ» (2005–2009 гг.), а также на научных и практических конференциях: на научно-проблемных методических комиссиях ФГУ ВГНКИ (2005–2007 гг.); на 6-й Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика-2007» (Москва, 2007 г.); на Всероссийской научной конференции «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов», посвященной 75-летию ФГУ «ВГНКИ» (Москва, 2006 г.); Втором съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России (Казань, 2009 г.), VII Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, 2010 г.).
1.6. Публикации.
По материалам диссертации опубликовано пять печатных работ, том
числе две в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
1.7. Основные положения диссертационной работы, выносимые
на защиту.
-
Выбор праймеров для идентификации ДНК пушных зверей; оптимизация условий выделения и амплификации ДНК.
-
Определение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы.
3. Комиссионные испытания, разработка нормативной документации и государственная регистрация тест системы «ПЗ –КОМ» в Российской Федерации.
1.8. Объем и структура диссертации.
