Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 12
1. Парвовирусная инфекция свиней (ПВИС) 12
1.1 Клинические признаки 12
1.2 Пути передачи 13
1.3 Патогенез 13
1.4 Характеристика возбудителя 14
Классификация 14
Морфология и геном вируса 14
Устойчивость 16
Антигенная вариабельность 16
Патогенность 17
1.5 Диагностика ПВИС 17
2. Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) 21
2.1 Клинические признаки 21
2.2 Пути передачи 23
2.3 Патогенез 24
2.4 Характеристика возбудителя 26
Классификация 26
Морфология и химический состав 26
Устойчивость 26
Организация генома РРСС 27
Генетическая вариабельность вируса РРСС 28
2.5 Диагностика РРСС 29
3. Заключение по обзору литературы 33
Собственные исследования 34
Материалы и методы исследований 34
4.1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе 34
4.2. Биологический материал, использованный в работе 36
4.3. Проведение ПЦР-анализа 37
4.3.1. Экстракция НК методом осаждения изопропанолом 37
4.3.2. Экстракция НК наборами Qiagen 40
4.3.3. Проведение ПЦР (ПВС) и ОТ-ПЦР (вирус РРСС) 41
4.4. Клонирование ДНК и кДНК в плазмиду pGEM 44
4.5. Клонирование ДНК в фаг AgtlO 44
4.6. Очистка продуктов ПЦР 44
4.7. Секвенирование 45
4.8. Проведение филогенетического анализа 46
Результаты исследований 46
5. Разработка тест-системы для выявления ДНК парвовируса свиней 46
5.1. Выбор специфических праймеров и зондов для амплификации и детекции ДНК ПВС 46
5.2. Анализ специфичности работы олигонуклеотидов 47
5.3. Подбор оптимальных условий амплификации 48
5.4. Введение контрольных образцов 49
5.5. Анализ чувствительности тест-системы 50
6. Разработка тест-системы для выявления и генотипирования вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней 52
6.1. Выбор специфических праймеров и зондов для амплификации и детекции РНК вируса РРСС 52
6.2. Анализ специфичности работы олигонуклеотидов 53
6.3. Подбор оптимальных условий амплификации 53
6.4. Введение контрольных образцов 56
6.5. Анализ чувствительности тест-системы 56
7. Выбор метода экстракции нуклеиновых кислот 57
7.1. Подбор условий экстракции НК из спермы с использованием метода осаждения изопропанолом 57
7.2. Использование наборов Qiagen 58
8. Исследование вакцин против РРСС 60
9. Исследование биологического материала от свиней 60
9.1. Обнаружение образцов, содержащих ДНК ПВС 60
9.2. Обнаружение образцов, содержащих РНК вируса РРСС 62
9.3. Расследование вспышек, вызванных вирусом РРСС 64
9.4. Секвенирование образцов, содержащих РНК вируса РРСС 65
9.5. Филогенетический анализ вируса РРСС из неблагополучных свинокомплексов на территории РФ в2009-2013гг 65
9.6. Анализ биологического материала на наличие смешанных инфекций 68
10. Проведение комиссионных испытаний 69
11. Сравненительный анализ чувствительности и специфичности наборов для выявления ДНК ПВС 72
11.1. Сравнение с набором реагентов № 1 (производство Россия) 72
11.2. Сравнение с набором реагентов №2 (производство Россия) 73
12. Сравненительный анализ чувствительности и специфичности наборов для выявления РНК вируса РРСС 76
12.1. Сравнение с наборами реагентов №1 и №2 (производство Россия) 76
12.2. Сравнение с набором реагентов №3 (производство Россия) 79
12.3. Сравнение с набором реагентов №4 (производство Франция) 83
Обсуждение собственых исследований 84
Выводы 90
Практические предложения 91
Список использованной литературы 92
- Характеристика возбудителя
- Морфология и химический состав
- Биологический материал, использованный в работе
- Подбор оптимальных условий амплификации
Введение к работе
Актуальность темы.
Парвовирус свиней (ПВС) и вирус репродуктивно-респираторного синдрома (РРСС) являются вирусными этиологическими агентами репродуктивных патологий свиноматок, которые широко распространены в мире.
Так по данным Ковалишина В.Ф. среди импортируемого поголовья репродуктивная патология в 28% случаев вызвана вирусом РРСС (наиболее распространенный вирусный этиологический агент) и в 4% – парвовирусом, в случае респираторной патологии вирус РРСС является этиологическим агентом в 60% случаев и уступает по распространенности только цирковирусу 2 типа [Ковалишин В.Ф., 2009].
Для ПВС и РРСС характерны аборты, рождение мертвых, мумифицированных и нежизнеспособных поросят [Bachmann, P.A. et al., 1975; Surez . et al., 1994; Dokland, T., 2010; Molitor, T.W. et al., 1983]. Иногда наблюдают коинфицирование животного [Ануфриев, П.А. и др., 2003].
Парвовирусная инфекция и РРСС могут протекать в виде бессимптомного носительства. При этом животные-вирусоносители выделяют вирус в окружающую среду и являются источниками заражения здоровых животных. Поэтому для эффективной диагностики данных заболеваний необходимо использование современных методов лабораторной диагностики.
Классическим методом диагностики вирусных болезней является выделение вируса на культуре клеток, однако, этот метод длительный, дорогостоящий и трудоемкий. В РФ широко применяются ИФА и РТГА для обнаружения специфических антител. Данные методы не позволяют дифференцировать поствакцинальные антитела от постинфекционных, выявлять вирусоносителей при обследовании вакцинированного поголовья и исследовать сперму. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод, обладающий высокой специфичностью и чувствительностью, позволяющий выявлять вирусный геном даже при низкой вирусной нагрузке в любом биологическом материале.
Важной задачей является своевременное выявление ПВС, который может длительное время персистировать в стаде и проявляться только у супоросных свиноматок, не имеющих иммунитета к данному возбудителю.
Таким образом, разработка диагностикумов для выявления ПВС и вируса РРСС являются актуальными направлениям ветеринарной диагностики.
Цель и задачи исследования.
Целью данной работы являлась разработка тест-систем для выявления ДНК парвовируса свиней и генотипирования вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реальном времени».
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Подобрать праймеры и зонды, оптимизировать условия ПЦР для обнаружения НК парвовируса свиней и вируса РРСС, создать рекомбинантные положительные контроли.
2. Определить аналитическую специфичность и чувствительность тест-систем.
3. Провести комиссионные испытания, утвердить нормативную документацию и внедрить в лабораторную практику тест-системы для выявления парвовируса свиней и генотипирования вируса РРСС.
4. Идентифицировать ПВС и провести филогенетический анализ вируса РРСС из неблагополучных свинокомплексов на территории РФ.
Научная новизна работы.
Сконструированы оригинальные праймеры и зонды для амплификации и детекции ДНК ПВС и генотипирования РРСС.
Разработана тест-система на основе метода ПЦР в «реальном времени», обладающая 100% специфичностью и аналитической чувствительностью – 5х102 коп/мл ДНК парвовируса свиней в суспензии фекалий, сыворотке крови, суспензии внутренних органов и 5х103 коп/мл в сперме.
Разработана тест-система на основе метода ПЦР в «реальном времени», обладающая 100% специфичностью и аналитической чувствительностью – 103 коп/мл РНК вируса РРСС в крови, сыворотке крови, суспензии внутренних органов и 5х103 коп/мл в сперме.
При проведении филогенетического анализа установлено, что нуклеотидные последовательности вируса РРСС из неблагополучных свинокомплексов, отличаются от вакцинных штаммов и относятся к первому и второму субтипам европейского генотипа вируса.
В результате секвенирования показано, что нуклеотидные последовательности вируса РРСС из свинокомплексов отличаются от последовательностей штаммов, входящих в состав отечественных и зарубежных вакцин, применяемых для профилактики данной болезни на территории нашей страны.
Практическая значимость работы.
Разработана нормативная документация по применению следующих тест-систем: 1) «ПВС» для выявления ДНК парвовируса свиней; 2) «РРСС» для выявления и генотипирования вируса РРСС методом полимеразной цепной реакции.
ПЦР-тест-система «ПВС» для выявления ДНК парвовируса свиней методом полимеразной цепной реакции в «реальном времени» внедрена в ветеринарную практику с 2010 года, тест-система «РРСС» для генотипирования вируса РРСС – с 2013 года. Рекламаций на данные тест-системы не поступало.
При проведении сравнительного анализа ПЦР-наборов, применяемых на территории РФ, установлено, что разработанная тест-система «ПВС» имеет в 100 раз большую чувствительность, чем тест-система №1 и в 10 раз, чем тест-система №2. Показано, что только тест-система «РРСС» в образцах из 16–ти неблагополучных свинокомплексов выявляла вирус РРСС в отличие от тест-систем №1, №2 и имела чувствительность в 10 раз выше, чем наборы реагентов №3 и №4 в 4-х пробах патматериала.
Основные положения, выносимые на защиту
Разработанная тест-система для выявления ДНК парвовируса свиней методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» обладает 100% специфичностью и выявляет 5х102 коп/мл ДНК парвовируса свиней в суспензии фекалий, сыворотке крови, суспензии внутренних органов и 5х103 коп/мл в сперме.
Разработанная тест-система «РРСС» для генотипирования вируса РРСС обладает 100% специфичностью и выявляет 103 коп/мл РНК вируса РРСС в крови, сыворотке крови, суспензии внутренних органов и 5х103 коп/мл в сперме.
Филогенетический анализ вируса РРСС из неблагополучных свинокомплексов на территории РФ в 2009-2013гг.
Сравнительный анализ чувствительности и специфичности тест-систем, применяемых в отечественной ветеринарной практике.
Публикации.
По результатам работы опубликовано 8 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах рекомендуемых ВАК (1 статья в печати).
Объем и структура диссертации.
Характеристика возбудителя
Заражение до 36 дня супоросности приводит к прохолостам, рассасыванию эмбрионов и возврату в охоту [92]. При заражении свиноматок на 40 - 70 день супоросности, после кальцификации скелета плодов, наблюдаются мумификация, мертворождения: возможны аборты [84, 104]. После 70 дня супоросности плоды становятся иммунокомпетентными [84], и, несмотря на трансплацентарное заражение гибели плодов не наблюдается [137, 12]. Однако есть данные, что высокопатогенные штаммы (например, шт. Kresse) могут вызывать гибель даже у иммунокомпетентных плодов [148].
Поскольку передача вируса от плода к плоду происходит довольно медленно (в течение 10-14 дней) [99], то в одном помете могут быть как мумифицированные, мертворожденные, живые слабые так и совершенно здоровые поросята [9, 12, 104, 112].
В стабильно неблагополучных хозяйствах заболевание проявляется чаще у ремонтных свинок (осеменение заканчивается безрезультатно). У основных свиноматок (иммунные) беременность протекает нормально. В первично инфицированных хозяйствах нарушение воспроизводительной функции отмечают как у ремонтных, так и у основных свиноматок. При этом оплодотворяемость маток снижается и составляет 25-37%, а мертворождаемость возрастает до 100% [4].
У животных других возрастных групп парвовирусная инфекция обычно протекает бессимптомно [80, 81, 82]. В редких случаях ПВС может быть этиологическим агентом диарей [ПО, 74], кожных поражений [89, 109, 114, 148], инфекционных негнойных миокардитов [37, 105].
От инфицированных животных вирус выделяется с абортированными и мумифицированными плодами, последом, плацентой, носовыми и вагинальными выделениями, слюной, фекалиями, мочой и спермой [7, 141, 147].
Заражение происходит при алиментарном и аэрогенном попадании вируса в организм животного. Передача вируса от матери потомству происходит трансплацентарно [136, 98]. Кроме того распространенным является половой путь заражения, при осеменении инфицированными хряками или инфицированной спермой [84, 92]. Также возможно распространение вируса через кровь при массовых обработках животных (кастрация, вакцинация и др.)
При оральном заражении виремия наблюдается на 3-10 день, в то время как после внутримышечного заражения вирус в крови обнаруживается уже на 1-6 день [136, 84]. На 23-30 день после орального заражения свиноматок вирус проникает через плаценту в плод [84]. Размножение вируса происходит во всех органах и тканях организма в клетках лимфоидной системы.
Вирус проникает в клетку путем рецептор-опосредованного эндоцитоза или макропиноцитоза после связывания с сиаловой кислотой на поверхности мембраны [17]. Размножение ПВС происходит в Т- и В-лимфоцитах, в то время как в макрофаги и моноциты вирус проникает, но не реплицируется [118]. Для репликации вируса клетки должны находиться в S-фазе митоза, когда активны клеточные полимеразы [118].
При отсутствии условий, способствующих репликации вируса, он может находиться в цитоплазме клеток до 21 дня (время наблюдения в эксперименте) [118].
Вирус выделяется с фекалиями в течение 10 дней после заражения [147], виремия наблюдается на 3-10 день [136]. ПВС обнаруживается у поросят в лимфатических узлах в течение 28 недель, в легких в течение 6 недель после внутриутробного инфицирования [67]. Классификация Парвовирус свиней представитель рода Parvovirus, подсемейства Parvovirinae, семейства Parvoviridae. Семейство Parvoviridae включает подсемейство Parvovirinae, в которое входят роды Parvovirus, Erythrovirus, Dependovirus, Amdovirus, Bocavirus и подсемейство Densovirinae, в которое входят роды Densovirus Iteravirus, Brevidensovirus, Pefudensovirus и неклассифицированные виды подсемейства [70].
Наибольшее значение для ветеринарии имеет род Parvovirus, представителями которого являются парвовирусы собак, кошек, норок, крыс, кроликов, кур, гусей, крупного рогатого скота, свиней [98].
Морфология и геном вируса Зрелые вирионы парвовируса свиней - мелкие, около 20-28 нм в диаметре [102] частицы кубической симметрии [27, 24] не имеющие оболочки и липидов с молекулярной массой 5,3х106 Да [27, 7].
Геном представлен одноцепочечной молекулой ДНК длиной около 5000 нуклеотидов [123], кодирующей 4 основных белка: 3 капсидных (VP1, VP2, VP3) и один неструктурный (NS) белок. В вирионы упаковывается только отрицательная (геномная) цепь [123, 14].
Геном содержит два промотора (две открытые рамки считывания ORF). Промотор Р4 инициирует экспрессию неструктурных белков (NS1, NS2 и возможно, NS3), которые участвуют в ряде репликативных функций. Промотор Р40 вовлечен в экспрессию структурных белков VP1, VP2 и VP3 [13, 123].
Ранее сообщалось, что левая рамка считывания кодирует только один неструктурный белок (NS1) с мол. массой 84 кДа [101, 123]. Белок NS1 впервые был выявлен как иммунопреципитирующий продукт в ПВС-инфицированных клеточных лизатах, но не обнаруживался в самих вирионах [101]. Белок NS1 появляется в инфицированных клетках в начале синтеза вирусной ДНК и, вероятно, необходимым для репликации вирусной ДНК [101]. Позже было показано, что в результате транскрипции гена NS получаются 3 продукта. Транскрипт длиной 4,7 kb не подвергается сплайсингу и кодирует белок NS1 с мол. массой 75,5кДа. Два другие транстрипта подвергаются сплайсингу до 3,3 kb (кодирует белок NS2 с мол. массой 18,1 кДа) и до 2,9 kb (кодирует белок NS3 с мол. массой 12,4 кДа) [14].
Морфология и химический состав
Вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней принадлежит к семейству Arteriviridae, которое совместно с семейством Coronaviridae образует порядок Nidovirales [23]. Также в семейство Arteriviridae входят вирус артерита лошадей, вирус подъема лактат-дегидрогеназы (мышей) и вирус геморрагической лихорадки обезьян [121, 142].
Морфология и химический состав
Mardassi с соавт. в 1993г методом электронной микроскопии показали, что внутриклеточные вирионы РРСС это частицы размером 45-55 нм, окруженные оболочной и имеющие изометрическое ядро размером 25-30 нм [127]. Позже методами криоэлектронной микроскопии и томографии было обнаружено, что вирионы вируса РРСС плеоморфны с преобладанием сферической или овальной формы со средним диаметром 58 нм [38]. Вирусные частицы имеют гладкую поверхность с единичными выступающими элементам. Вирионы покрыты липидной оболочной толщиной около 4,5 нм и содержат внутреннее ядро диаметром 20-39 нм, которое отделено от оболочки 2-3 нм пространством [38]. Устойчивость
Вирус РРСС сохраняет инфекционность в течение месяца при +4С и в течение 4 месяцев при -70С, но инактивируется за 48 часов при 37С и в течение 45 минут при 56С [32]. Инактивируется неполярными растворителями, например, хлороформом, нестабилен даже в слабых растворах детергентов [32]. Организация генома РРСС Геном представлен одноцепочечной положительной цепью РНК приблизительно 15 тыс. оснований длинной и содержит 8 открытых рамок считывания (ORF). ORF 1а и ORFlb составляют 75-80% генома вируса и кодируют 14 неструктурных белков (nspl-nspl4), участвующих в репликации, включая четыре протеазы (nspla, nspip, nsp2, nsp4), РНК-зависимую РНК полимеразу (nsp9), хеликазу (nsplO) и эндонуклеазу (nspll) [39, 53]. ORFla и ORFlb транслируются в один полипротеин, который затем процессируется в более мелкие неструктурные белки (nonstructural protein, nsp) [111, 53]. Nsp2 является наиболее вариабельным неструктурным белком (гомология между субтипами составляет только 32%) [53].
ORF2-ORF7 располагаются на 3 конце генома и кодируют структурные вирусные белки. ORF2-ORF5 кодируют гликозилированные мембранные белки GP2-GP5, ORF6 - негликозилированный М белок, ORF7 -нуклеокапсидный N белок [53]. Белки GP5 и М являются главными белками вирусной оболочки. Белок GP5 участвует во взаимодействии вируса с клеточной мембраной на этапе проникновения вируса в клетку-хозяина, индуцирует выработку нейтрализующих антител, может вызывать апоптоз инфицированных клеток [53, 142, 107]. Гидрофобный, негликозилированный М-белок (membrane), как и GP5 играет важную роль в сборке и почковании вирусных частиц [57, 142]. N-белок (nucleocapside) экспрессируется в наибольшем количестве в инфицированным клетках [142], составляет 20-40% всех белков вириона и формирует его ядро [38, 39, 61]. Нуклеокапсидный белок также обнаруживается в ядре и ядрышке инфицированных клеток и, возможно, изменяет экспрессию белков хозяина [61]. Кроме М и N белков, составляющих примерно 90-95% белков, в вирионе обнаруживаются еще «минорные» белки, которые являются продуктами трансляции генов ORF2-4 [142, 146].
Генетическая вариабельность вируса РРСС Вирус РРСС отличается высокой вариабельностью: различают европейский и североамериканский генотипы. Референсным штаммом европейского генотипа является вирус Lelystad, выделенный в 1991г. в Нидерландах [103]. Референсным штаммом североамериканского генотипа считается выделенный на несколько месяцев позже вирус VR2332 [28].
Отличия между европейским и североамериканским генотипами довольно существенны. Так сходство между американским изолятом VR2385 и шт. Lelystad для генов ORF 5, 6 и 7 на белковом уровне составляет 54%, 78% и 58% соответственно [96]. Сравнения вирусов американского и европейского генотипов показали, что они имели общего предка (LDV), но значительные различия в последовательности геномов свидетельствуют, что эти два генотипа разошлись до их первого клинического проявления в конце 1980-х гг. [121,122].
Согласно исследованиям, проведенным Stadejek Т. et al., вспышки РРСС на территории России в период с 1996 по 2006 год были вызваны вирусом европейского генотипа [40]. Этим коллективом авторов проведено субтипирование российских изолятов на основе секвенирования генов ORF5 и ORF7. В результате в европейском генотипе вируса было выделено 3 субтипа: паневропейский субтип 1 и восточноевропейские субтипы 2 и 3. Большинство российских изолятов были представлены первым субтипом, но часть изолятов оказались субтипов 2 и 3 [40].
Биологический материал, использованный в работе
Очистку продуктов ПНР проводили набором реагентов «Рибо-сорб» (ФСР 2008/03993), основанном на модифицированной методике аффинной сорбции на силикагелевом сорбенте по Boom R. [20]. Методика основана на лизисе исследуемого материла при помощи специального хаотропного агента (гуанидина тиоционата) и последующем связывании нуклеиновых кислот частицами силикагеля в присутствии этого агента. Общий принцип метода заключался в следующем:
К 450 мкл лизирующего раствора добавляли по 10 мкл продуктов, перемешивали на вортексе и вносили в каждую пробирку отдельным наконечником по 25 мкл ресуспендированного сорбента. Перемешивали на вортексе и оставляли в штативе на 5 мин. Центрифугировали пробирки для осаждения сорбента при 10 тыс. об/мин в течение 30 с на микроцентрифуге и удаляли надосадочную жидкость. Затем добавляли в пробирки по 400 мкл раствора для отмывки 1, перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, центрифугировали 30 с при 10 тыс. об/мин на микроцентрифуге и удаляли надосадочную жидкость. Поле этого вносили в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3, ресуспендировали сорбент на вортексе, центрифугировали 30 с при 10 тыс. об/мин на микроцентрифуге и удаляли надосадочную жидкость. Повторяли отмывку раствором для отмывки 3 еще раз. Затем добавляли в пробирки по 400 мкл раствора для отмывки 4, ресуспендировали сорбент, центрифугировали 30 с при 10 тыс. об/мин и удаляли надосадочную жидкость. Пробирки помещали в термостат при температуре 60 С на 10-15 мин для подсушивания сорбента. При этом крышки пробирок были открыты. Затем в пробирки вносили по 50 мкл РНК-буфера, перемешивали на вортексе и прогревали в термостате при температуре 60С 2-3 мин. Затем перемешивали на вортексе и центрифугировали пробирки на максимальных оборотах микроцентрифуги (12-13 тыс. об/мин) в течение 1 мин. Надосадочная жидкость содержала очищенную ДНК, готовую для секвенирования.
Секвенирование фрагментов амплификации выполняли на базе ФБУН ЦНИИЭ и в отделе биотехнологии ФГБУ ВГНКИ методом циклического секвенирования по Сэнгеру с набором ABI PRISM Big Dye Terminator v. 1.1 («Applied Biosystems», США), согласно инструкции изготовителя с использованием капиллярного автоматического секвенатора Appleid Biosystems 3500XL Genetic Analyzer или Appleid Biosystems 3130x1 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США).
Реакция секвенирования проводилась по следующей программе: 1 мин при 96С, затем 25 циклов: 96С - Юсек, 55С - 5 сек, 60С - 4 мин и хранение 4С. В качестве праймеров для секвенирования использовались те же праймеры, которые были использованы в ПЦР.
Корректировку хроматограмм проводили в BioNumerics v.6.6. Выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили на основании выравнивания аминокислотных последовательностей с помощью пакета скриптов Revtrans. Поиск наилучшей эволюционной модели согласно полученному множественному выравниванию нуклеотидных последовательностей проводили в MEGA v.5.05. В результате была выбрана двухпараметрическая модель Кимуры [87]. Гомологию нуклеотидных последовательностей оценивали в MEGA v.5.05. Филогенетическое дерево и постериорную вероятность формирования монофилетических групп проводили с использованием программного обеспечения Mr.Bayes v.3.1.
Результаты исследований 5. Разработка тест-системы для выявления ДНК парвовируса свиней
Выбор специфических праймеров и зондов для амплификации и детекции ДНК ПВС На основе литературных данных и анализа нуклеотидных последовательностей, представленных в базе данных GenBank, в качестве гена-мишени выбран ген NS1. Для выбора специфичных олигонуклеотидов был проведен анализ всех нуклеотидных последовательностей, представленных в базе данных GenBank.
Анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей и поиск консервативных участков, необходимых для выбора праймеров проводили с помощью программы VectorNTI Suite 9.0.0 (AlignX). Специфичность выбранных олигонуклеотидов изучали с помощью компьютерной программы BLAST [151] on-line.
В результате показана гомология выбранных олигонуклеотидов только с NS1 геном парвовируса свиней, и не обнаружено их значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями генов других бактерий, вирусов или эукариот. Таким образом, предложенные праймеры, исходя из теоретических расчетов, должны обладать 100% специфичностью.
Подбор оптимальных условий амплификации
Для лабораторного подтверждения вируса РРСС МЭБ рекомендует выделение на культуре клеток, обнаружение вирусных белков или вирусоспецифических антител с помощью иммуноферментного анализа и выявление вирусного генома методом ОТ-ПЦР [106]. ПНР сочетает в себе быстроту и простоту исполнения, обладает высокой чувствительностью и специфичностью.
Целью данной работы была разработка тест-систем для выявления ДНК парвовируса свиней и дифференциации вируса РРСС на основе ПНР в режиме «реального времени». Исследование методом ПЦР состоит из трех этапов: экстракции НК, собственно полимеразной цепной реакции и детекции продуктов амплификации. При разработке тест-систем для выявления возбудителя методом ПНР необходимо учитывать каждый из них.
Экстракции НК - обработка биологических образцов, в результате которой происходит очистка нуклеиновых кислот от других клеточных или внеклеточных компонентов, удаление ингибиторов ПЦР (белков, полисахаридов, солей и др.). Для экстракции НК мы использовали метод осаждения изопропанолом. Поскольку в настоящее время большое внимание уделяется автоматизации лабораторий, также был предложен метод выделения, позволяющий проводить одновременную экстракцию ДНК и РНК на автоматизированных станциях.
Полимеразная цепная реакция основана на многократном увеличении количества копий тестируемых специфических последовательностей ДНК (матрицы) с помощью фермента ДНК-полимеразы. В результате, даже при наличии минимальных количеств возбудителя в исследуемом растворе после реакции амплификации происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2П, где п - число циклов амплификации. Для проведения реакции амплификации кроме матрицы и фермента необходимы специфические олигонуклеотидные праймеры. Высокие показатели чувствительности и специфичности методики достигаются оптимальным выбором мишени, олигонуклеотидных праймеров и зондов, условий амплификации и др. В нашей работе в качестве мишеней были выбраны наиболее консервативные участки геномов парвовируса и вируса РРСС - гены NS1 и ORF7 соответственно. Специфичность выбранных олигонуклеотидов проверяли на большом количестве вирусных и бактериальных возбудителей заболеваний свиней. Неспецифических реакций амплификации выявлено не было.
Для обнаружения продуктов реакции до последнего времени использовали электрофорез в агарозном геле. Данный метод не требует дорогостоящего оборудования, но создает высокий риск контаминации продуктами амплификации. Введение в реакционную смесь флуоресцентно-меченых зондов дает возможность детектировать результаты амплификации в режиме «реального времени». Флуоресцентные зонды при появлении специфического продукта амплификации гибридизуются с ним, вызывая увеличение уровня флуоресцентного сигнала. Использование флуоресцентных зондов позволяет избежать этапа открытия пробирки с ампликонами, повысить чувствительность и специфичность метода, а также детектировать большее количество возбудителей в одной пробирке.
В своей работе мы уделили большое внимание дизайну флуоресцентных зондов. Для увеличения специфичности работы зонды имеют высокую температуру плавления. Для снижения начального уровня фона и увеличения конечного уровня флуоресценции в последовательности зондов введены дополнительные нуклеотиды, обеспечивающие наличие вторичной структуры при которой в отсутствии специфической мишени флуорофор находится в непосредственной близости к гасителю. При гибридизации флуоресцентного зонда с мишенью вторичная структура теряется, расстояние между флуорофором и гасителем увеличивается и регистрируется флуоресцентный сигнал, свидетельствующий о наличии в реакционной смеси ДНК возбудителя.
Условия ПЦР были оптимизированы подбором оптимальной температуры отжига праймеров и их количества в реакционной смеси.
Для обеспечения контроля качества и предотвращения получения ложноотрицательных результатов в тест-системы введен внутренний контрольный образец (ВКО), который вносится в каждую пробу на этапе экстракции НК. Это позволяет контролировать качество выполнения всех этапов ПНР-исследования. Ложноотрицательные результаты могут быть вызваны недостаточной очисткой ДНК от ингибиторов, потерями ДНК при выделении из исследуемого материала или ошибкой оператора при постановке анализа. ВКО добавляется в каждую исследуемую пробу и должен быть детектирован в каждой пробе. Амплификация и детекция данного препарата происходит с помощью отдельной пары праймеров и зонда одновременно с амплификацией специфической мишени. Отсутствие сигнала ВКО свидетельствует о некорректном проведении анализа данной пробы и необходимости повторного более тщательного ее исследования.
Для предотвращения появления ложноположительных результатов в результате контаминации на этапе экстракции НК введен отрицательный контрольный образец (ОКО).
Для контроля этапа ПНР, достоверности анализа и исключения некорректных результатов в тест-системы введены отрицательный (К-) и положительный (К+) контрольные образцы. Наличие амплификации в К+ свидетельствует о правильной постановке ПНР и работе амплификатора. Получение положительного результата в К- или ОКО говорит о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации
