Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Некробактериоз 11
2.2. Характеристика возбудителя 13
2.2.1. Историческая справка, таксономическое положение 13
2.2.2. Морфология, тинкториальные свойства, метаболическая активность 14
2.2.3. Патологоанатомические изменения 16
2.3. Биохимическая характеристика возбудителя 19
2.3.1. Гемолизин 19
2.3.2. Липополисахаридный эндотоксин (ЛПС) 21 2.3-3. Лейкотоксин 24 2.4- Профилактика и меры борьбы 26
2.4.1. Чувствительность к антибиотикам 27
2.4.2. Специфическая профилактика 28
2.5. Диагностика 28
2.5 1. Иммуноферментный метод для диагностики некробактериоза крупного рогатого скота 29
2.5.2. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) 33
2.5.3 .Гистохимический вариант ИФА 35
2.6. Исследование клеточного иммунитета 37
2.6.1. Роль клеточного и гуморального иммунитета при бактериальных инфекциях 37
2.6.2. ELISPOT-метод 40
2.7. Заключение но обзору литературы 41
3. Материалы и методы 43
4. Собственные исследования. 56
4.1. Выделение и очистка антигена. 56
4.1.1. Электрофорез и иммуноблоттинг 56
4.1.2. Белковый состав антигена 57
4.2, Изучение клеточного и гуморального иммунитета КРС при некробактериозе, 59
4.3, Разработка иммунофлюоресцентной тест системы для определения F.necrophorum в патматериале 63
4,3,1 .Получение коньюгата анти-F.necrophorum IgG - ФИТЦ, 64
4.3,2. Получение коньюгата анти-IgG КРС IgG - ФИТЦ 65
4,3-3.Про верка работы иммунофлюоресцентной тест-системы. 65
4.4.Разработка тест-системы для индикации антител к
F.necrophorum в сыворотке КРС 66
4.4.1. Выделение иммуноглобулина класса G из сыворотки
крови крупного рогатого скота 66
4.4.2. Получение анти-IgG КРС гипериммунной сыворотки 70
4.4.3. Выделение антивидовых иммуноглобулинов (анти-IgG КРС) 71
4.4.4. Мечение антивидовых иммуноглобулинов (анти-IgG КРС) ферментом пероксидазой из хрена 74
4.4-5. Оптимизация условий проведения иммуноферментного
анализа с целью определения антител к F.necrophorum КРС 78
4.4.6- Сравнительная оценка чувствительности ИФА для
детекции антител в сыворотке крови больных животных 81
4.4.7.0предсление диагностического титра антител 82
4,5, Разработка тест-системы для индикации типоспецифичных антигенов F.necrophorum в патматериале и
гнойно-некротических поражениях КРС 84
4.5Л. Получение анти-F.necrophorum IgG 85
4.5-2, Получение коньюгата ainii-F.necrophorum антител с пероксидазой хрена. 87
4.5,3, Оптимизация условий проведения иммуноферментного анализа с целью индикации F.necrophorum 87
4.5.4, Сравнительная оценка конкурентного и «сэндвич» - ИФА для детекции F.necrophorum в патматериале с РТГА- 88
4.6. Разработка тест-системы для гистохимической индикации антигенов F.necrophorum в патматериале 89
5. Обсуждение, 91
6. Выводы 97
7. Практические предложения, 99
8. Список литературы, 100
9. Приложение. 111
Введение к работе
Актуальность темы
Одно из центральных мест в инфекционной патологии крупного рогатого скота Занимает некробактериоз. Некробактериоз - инфекционная болезнь, проявляющаяся гнойно-некротическими поражениями всех органов и тканей организма. Это заболевание наносило и продолжает наносить значительный экономический ущерб.
Кроме того, в последние годы прослеживается тенденция к обострению эпизоотической ситуации по некробактериозу, что связано с усложнившимися хозяйственно-экономическими условиями ведения животноводства.
Экономический ущерб, причиняемый этой инфекцией, огромен. Он складывается из затрат, связанных с профилактикой и лечением больных, гибелью или преждевременной выбраковкой животных, потерей продуктивности и других расходов, обусловленных мероприятиями по ликвидации болезни, Некробактериоз поражает все виды домашних и диких животных, птиц, пресмыкающихся и человека. Наиболее чувствительны к данной инфекции олени и овцы, а также крупный рогатый скот, свиньи, лошади. Географически некробактериоз распространен на всех континентах, во всех странах, даже с высоко развитым животноводством. В Российской Федерации некробактериоз поражает ежегодно до 7% крупного рогатого скота и 16% мелкого рогатого скота, занимая, таким образом третье по распространенности место после лейкоза и туберкулеза. Огромный ущерб болезнь наносит оленеводству: из заболевших за год 50-70 тыс, оленей погибает 30-35% животных. Существенны потери от некробактериоза в хозяйствах, содержащих крупный рогатый скот.
В настоящее время для выявления и идентификации возбудителя некробактериоза применяют серологические, биохимические, микробиологические методы, а также постановку биопробы на лабораторных животных.
Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) с успехом используют для обнаружения микробных антигенов в различных патологических материалах. Предложены и применяются несколько вариантов РИФ,
Длительность, трудоемкость, недостаточная специфичность и чувствительность» применяемых в настоящее время методов, заставляет исследователей обратить особое внимание на разработку и внедрение в ветеринарную практику новых высокочувствительных и специфичных методов диагностики некробактериоза. В этой связи актуальным является внедрение методов диагностики на основе иммуноферментного анализа (ИФА). Основными достоинствами ИФА являются высокая чувствительность, возможность анализа соединений с различной молекулярной массой, строго инструментальный учет результатов, что позволяет увеличить число проб, унифицировать методы и реагенты, а также вести прямую обработку информации.
Таким образом, создание тест-систем для ускоренной диагностики некробактериоза на сегодняшний день является важной и актуальной задачей,
1.2. Целью настоящей работы являлась разработка диагностикумов на основе очищенного антигена F.necrophorum, определение белкового состава и изучение иммуногенных свойств его отдельных компонентов для использования их при создании иммуноферментной и люминесцентной тест-систем для диагностики некробактериоза при определении уровня антител в крови больных и переболевших животных и определения наличия антигенов F.necrophorutn в гнойно-некротических очагах.
Решались следующие заданы:
1.2 Л. разработать метод получения очищенного антигена F.necrophorum и изучить белковый состав антигена F.necrophorum;
1.2.2. изучить клеточный и гуморальный иммунитет КРС при некробактериозе;
1.2.3- выделить IgG КРС, получить анти-IgG КРС сыворотки на кроликах;
1.2.4. выделить &\Ym-F.necrophorum антитела из сывороток клинически больных животных;
1.2.5. изготовить коньюгат пероксидазы из хрена с анти-IgG КРС и кролика, коньюгаты анти F.necrophorum IgG с ФИТЦ и ПХ;
1.2.6. провести сравнительную оценку эффективности определения уровня SLHTH-F.necrophorum антител и антигена F.necrophorum в патологическом материале традиционными методами и ИФА;
1.2.7 разработать тест-систему для диагностики некробактериоза при определении уровня антинекробаїсгериозньїх антител в крови больных и переболевших животных и определения наличия антигенов F.necrophorum в гнойно-некротических очагах методом иммуноферментного анализа.ЛЛ Научная новизна,
- разработан метод получения очищенного антигена F,necrophorum\
- определен белковый состав F.necrophorum и изучены иммуногснные свойства его отдельных компонентов;
- установлено, что в крови вакцинированных животных наблюдалось увеличение абсолютного количества спонтанных Т-лимфоцитов (Е), ЕАС-В-лимфоцитов и АСК на 7-е сутки, что свидетельствует о совпадении динамики образования спонтанных Е-лимфоцитов с таковой ЕАС-В-лимфоцитов и АСК;
- показана возможность выделения антинекробактериозных антител из сыворотки переболевших животных с помощью аффинной хроматографии на нерастворимой фракции бактериальных клеток;
- впервые в Российской Федерации разработана иммуноферментная тест-система для диагностики некробактериоза КРС на основе очищенного антигена F.necrophorum, 1.4. Практическая значимость работы
Разработана иммуноферментная, люминесцентная и гистохимическая тест-системы, предназначенные для диагностики некробактериоза КРС,
Созданы «Набор для серологической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-С», «Набор для иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-А» и «Набор для люминесцентной диагностики некробактериоза КРС Н-Л». Материалы работы использованы при составлении научно-технической документации (НД) которая утверждается в установленном порядке. Наборы предназначается для индикации антигенов F.necrophorum и количественного определения анти- F.necrophorum антител в сыворотках крови КРС.
Внедрение в практику указанных наборов позволит проводить диагностику некробактериоза КРС в племенных и пользовательских хозяйствах при первых проявлениях клинических признаков, что будет способствовать оздоровлению хозяйств, обеспечению эпизоотологияеского благополучия, повышению сохранности и продуктивности поголовья, улучшению качества продукции. L5. На защиту выносятся следующие положения; 1.5Л. результаты разработки оптимальных условий очистки антигена
F.necrophorum; 1.5.2, результаты исследования белкового состава антигена F.necrophorum; L5.3. результаты испытания антигенов F.necrophorum, полученных на базе очищенных препаратов, в качестве компонентов в серологических реакциях (РТГА и ИФА); 1.5.4. результаты исследования напряженности клеточного и гуморального иммунитета при некробактериозе КРС;
1.5.5- результаты разработки тест — системы ИФА для определения уровня анти- F.necrophorum антител в сыворотках вакцинированных, больных и переболевших животных и проведения сравнительной оценки определения уровня антител в РТГА и ИФА;
1.5.6-результаты разработки тест — системы ИФА для детекции антигенов F.necrophorum в различных патологически материалах и сравнения чувствительности и специфичности с традиционными методами;
1.5.7. результаты разработки люминесцентной тест - системы для детекции антигенов F.necrophorum в различных патологически материалах и сравнения чувствительности и специфичности с традиционными методами;
\ .5.8. результаты испытания и промышленного изготовления наборов для нммуноферментной и люминесцентной диагностики некробактериоза КРС.
Некробактериоз
Некробактериоз - инфекционная болезнь, проявляющаяся гнойно-некротическими поражениями всех органов и тканей организма. Экономический ущерб, причиняемый этой инфекцией, огромен. Он складывается из затрат, связанных с профилактикой и лечением больных, гибелью или преждевременной выбраковкой животных на мясо, потерей продуктивности и других расходов, обусловленных мероприятиями по ликвидации болезни.
Некробактериоз поражает все виды домашних (72) и диких животных, птиц, пресмыкающихся и человека (114, 86, 148, 126). Наиболее чувствительны к данной инфекции олени и овцы, а также крупный рогатый скот, свиньи, лошади. Географически некробактериоз распространен на всех континентах, во всех странах, даже с высоко развитым животноводством, В Российской Федерации некробактериоз поражает ежегодно до 7% крупного рогатого скота и 16 % мелкого рогатого скота, занимая, таким образом, третье по распространённости место после лейкоза и туберкулёза (57, 35, 53). Огромный ущерб болезнь наносит оленеводству: из заболевших за год 50 — 70 тыс. оленей погибает 30 - 35% животных (21), Существенны потери от некробактериоза в хозяйствах, содержащих крупный рогатый скот. Даже, несмотря на то, что поголовье скота за последние годы резко сократилось, заболеваемость не только не имеет тенденции к снижению, но и даже несколько возросла (57),
Основным источником каждой вновь начинающейся эпизоотии среди крупного рогатого скота в первую очередь следует считать здоровых животных микробоносителей, а не больных, которые присоединяются позднее, так как бактерия представляет собой нормального обитателя пищеварительного тракта- Заселение желудочно - кишечного тракта F.necrophorum происходит в первые дни жизни. Поэтому по месту обитания возбудителя некробактериоз следует отнести к факторным инфекциям (50).
В основном некробактериоз не заносится в хозяйство с больными животными, а возникает при появлении соответствующих условий, ведущих к нарушению существующего биологического равновесия между микро- и макроорганизмом. Нарушение рубцового пищеварения, вследствие дефицита микроэлементов и витаминов, влекущее за собой нарушение обменных процессов и снижение естественной резистентности организма, сырость в помещениях и недостаточно качественная очистка стойл, создающая агрессивную среду и ведущая к размягчению копытного рога и мацерации кожи, травмирование тканей разного рода колющими и режущими предметами - все это является предпосылкой для вспышки заболевания (50, 12), Следствием многообразия клинических форм болезни и полиморфностью возбудителя стало сравнительно недавнее присвоение некробактериозу статуса самостоятельной нозологической единицы. В 1932 году А. Г. Ревнивых своими опытами на северных оленях доказал, что возбудителем заболевания является F.necrophorum (42), хотя установлено» что в этиологии некробактериоза помимо основного возбудителя огромную роль играет гнойно-некротическая микрофлора: Clostridium perfringens, Staphihcoccus aureus, Corynebacterium pyogenes и др. Микробные ассоциации своими ферментативными системами усиливают действие основного возбудителя, тем самым существенно повышая его вирулентность (54, 138).
У животных F.necrophorum вызывает абсцессы внутренних органов, аборты, копытную гниль, некротический ларингит (дифтерия телят) и другие поражения (123, 137)- У человека некробактериоз клинически проявляется некротическим тонзиллитом, септицемией, стоматитом, периодонтитом, абсцессами печени и внутренних органов, эндокардитами (125, Возможные факторы патогенности F.necrophorum - лейкотоксин, лилополисахаридный эндотоксин, гемолизин, гемагглютинин, ферменты (ДНКазы, лецитиназа, фосфатидаза, коллагеназа, фибринолизнн, стрептокиназа, декарбоксилаза, щелочная фосфатаза, липаза) (159, 67). 2.2, Характеристика возбудителя
Материалы и методы
Бактериальная масса Fusobacterium necrophorum была получена с Щелковского биокомбината (производственный штамм F.necrophorum «O-l» (ВИЭВ)).
Реактивы отечественного производства:
НС1, H2S04, NaOH, NaCl K2HPOd, KH3P04, Na2HP04, KC1, NaHC03, ZnSO , NaJ04, ортофеншіендиамин (ОФД), З-амино-9-этилкарбазол, тетрагидрохлорвд 3,3-диаминобензидина (ДАБ), трихлоруксусная кислота (ТХУ), додецилсульфат натрия (ДСН), Н2О2, ацетон, изопропанол, глицин, бикарбонат натрия, боргидрид натрия, сульфат аммония, лимонная кислота, уксусная кислота,
ЗЛЛ.2. Импортные реактивы
Трис (гидроксиметиламинометан) (Reanal), ЭДТА, додецилсульфат натрия, бычий сывороточный альбумин (BSA), сахароза, ацетат натрия, Кумасси R-250 («Amersham»), акриламид (Reanal), бисакриламид (Reanal), TEMED (Serva), Тритон X-305(Sigma), Тритон Х-100 (Sigma), Твин-20 (Serva), Фикол-400 (Pharmacea), Декстран-Т-70 (Pharmacea), моноэтаноламин (Sigma), веронал-мединал (Reanal), пероксидаза из хрена RZ 3,0, Агароза для РДП, Агар «Дифко» для иммуноэлектофореза, BrCn-Сефароза (Fluka), Протеин-А-Сефароза (Pharmacea), Сефадекс G10, 15, 25, 50, 100, 200, С 50, SP 50, DEAE 50 (Pharmacea), DEAE Trisacryl М, CM Trisacryl М (LKB), Toyopearl HW40, HW 50, HW 55, HW65(Toyosoda).
0,01M калий фосфатный буферный раствор, содержащий 0,15М NaCl, рН 7,3 ± 0,1 (ЗФР); 0,01М фосфатный буферный раствор, содержащий 0,15М NaCl и 0,15 Твин-20 рН 7,3 ± 0,1 (ЗФР-Т); 0,15М фосфатно-цитратный буферный раствор, рН 5,0; 0,15М фосфатно-цитратный буферный раствор, содержащий 0, 4мг/мл о-фенилендиамина (ОФД) и 0,012% Н202, рН 5,0 (субстратный раствор); 62,5 мМ Трис, 2,25% ДСН, 0,2% Кумаси в 50% метаноле и 7% уксусной кислоте (окрашивающий раствор); 6,5 мМ трис-НС1 буфер содержащий 64 мМ глицина, 20% этанола, рН 8,3 (буфер для переноса); физиологический раствор содержащий 0,5% Твин - 20 (ФР-Т); блокирующий раствор - ЮмМ калий-фосфатный буфер, содержащий 0,15М NaCl и 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), рН 7,4 (ЗФР-БСА); ЮмМ калий-фосфатный буфер, содержащий 0,15М NaCl, 1% БСА и 0,05% Твин-20 рН 7,4 (ЗФР-БСА-Т); 0,1М глицин НС1, рН 2,0 (элюирующий буфер)
Кролики массой 2,5 — 3,0 кг; телята в возрасте 9-11 мес. Содержание и кормление животных проводили согласно принятым нормам.
Спектрофотометр с X 280нм и 490нм; центрифуги с бакет роторами на 5000 и 20 000 об/мин; ультрацентрифуги (60 000 и более об/мин); коллектор фракций (насос, рекордер с отметкой фракций, проточный спектрофотометр с изменяющейся Х)\ система для вертикального и горизонтального электрофореза; система для электрофоретического переноса белков; градиент-миксер; магнитные мешалки; ячейки для ультрафильтрации (25, 50, 100, 200, 500 и 1000мл); система для детекции результатов ИФА (автоматический спектрофотометр, система для промывки плашек, инкубатор для микропланшет); комплект типа «Эппендорф» (центрифуга, термостат, миксер, автоматические микропипетки); шейкер; колонки для хроматографии; холодильники на + 4 , -20 и -70С; водяная баня;
Электрофорез и иммуноблоттинг
Бактериальную массу Fusobacterium necrophorum, полученную с Щелковского биокомбината (производственный штамм F. necrophorum «0-1» (ВИЭВ)), ресуспендировали в фосфатном буферном растворе (рН 7,2), разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 15 секунд импульсивно 6 раз. Затем разрушенную ультразвуком бактериальную массу Fusobacterium necrophorum вновь ресуспендировали в фосфатном буферном растворе и центрифугировали 30 мин при 5000 об/мин. Полученный супернатант фракционировали методом гель-фильтрации на хроматографической колонке К 25/100 (Pharmacia) с Тоуореагі 55 S, Получаемые фракции собирали с помощью коллектора фракций. Измерение оптической плотности полученных фракций проводили на спектрофотометре СФ - 26 при длине волны 280 нм.
Как видно из хроматограммы, представленной на рисунке 1, содержимое надосадка разделялось на два выраженных пика.
С целью определения наиболее активных в иммунологическом отношении фракций была построена кривая отношения ОП450 нм (активность в ИФА) к ОПЬБОНМ (рис. 2). Молекулярная масса белков специфичных в ИФА распределялась в диапазоне от 300 до 30 килодальтон.
Наиболее активные фракции были объединены, сконцентрированы ультрафильтрацией, предварительно очищены от низкомолекулярных продуктов на Сефадексе G-25 и иммобилизованы на на BrCN Сефарозе 4В по стандартной методике.
4 L2 Белковый состав антигена
Сравнительное изучение полипептидных профилей полученных фракций проводили с помощью электрофореза в 7,5% ПААГ с окрашиванием амидочерным- Фракции с наибольшей иммунной активностью в ИФА состояли из 13 полипептидов с молекулярными массами от 30 до 300 кДа (рис, 3),
Результаты исследования белков методом иммуноблоттинга показали, что антитела сыворотки переболевшего некробактериозом животного реагировали с большинством белков, присутствующих в объединенной фракции. Наиболее яркие полосы соответствовали полипептидам с м.м. 300, 93?75 55кДа,
Клеточный и гуморальный иммунитет КРС при некробактериозе.
Одним из основных показателей оценки состояния иммунной системы является определение количества и функциональных свойств им мунокомпетентных клеток. Использование реакций розеткообразования (РОК) для выявления популяций лимфоцитов, а так же характеристика АСК дает возможность оценить потенциал иммунного ответа на инфицирование организма F.necrophorum.
До настоящего времени количественную оценку Т- и В-субпопуляций лимфоцитов проводят в основном методом розеткообразования- Каждая реакция РОК типирует определенные субпопуляции лимфоцитов: спонтанные (Е) - Т-лимфоциты, так как они имеют рецептор на своей поверхности к определенным эритроцитам, комплементзависимые (ЕАС) - В-лимфоциты с рецептором к СЗ компоненту комплемента.
Сравнительно недавно введенный в практику метод точечного иммуноферменшого анализа ELISPOT в настоящее время широко применяется при исследованиях в области иммунологии. Данный метод предоставляет возможность выявлять даже единичные антителосекретирующиеВ-лимфоциты.
Для изучения напряженности клеточного и гуморального иммунитета при некробактериозе использовали опытную (п=6) и контрольную (п=6) группы телят. Предварительно все животные были проверены на отсутствие антител к F.necrophorum. Телятам опытной группы вводили некробактериозную вакцину производства ГЩБК (Щёлковский
