Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Носители для построения биосенсорных тест-систем 13
1.2. Биосенсорные тест-системы на основе иммобилизованных биологически активных веществ 32
Глава 2. Материалы, оборудование и методы исследования 43
2.1. Материалы и реактивы 43
2.2. Оборудование 44
2.3. Методы исследования
2.3.1. Определение удельной активности растворимого фермента ацетилхолинэстеразы 44
2.3.2. Приготовление фосфатного буферного раствора 46
2.3.3. Метод определения прочности полимерных материалов при деформации растяжения (ГОСТ 17035-86) 46
2.3.4. Определение относительного удлинения при разрыве 46
2.3.5. Определение статического коэффициента трения 47
2.3.6. Определение номинальной толщины пленки (ГОСТ 17035-86). 47
2.3.7. Определение массовой концентрации меди (ГОСТ 7388-72) 47
2.3.8. Приготовление буферного раствора (рН = 8,4) 49
2.3.9. Методы математической и статистической обработки данных 49
Глава 3. Конструирование композиционных материалов с иммобилизованными ферментами 52
3.1 Формирование структуры основы высокомолекулярных композиций для иммобилизации ферментов 52
3.2. Иммобилизация фермента ацетилхолинэстеразы 56
3.2.1 Оптимизация количества фермента ацетилхолинэстеразы в со ставе биосенсорной тест-системы 60
3.2.2. Влияние количества субстрата на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы 67
3.2.3. Изучение влияния рН среды на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы 68
3.2.4. Влияние температуры на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы 70
3.2.5. Влияние времени ингибирования и времени постановки ферментативной реакции на изменение удельной активности растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы 71
3.2.6. Конструирование тест-системы и разработка способа обнаружения инсектицида карбофоса в почве 78
3.3. Иммобилизация фермента панкреатина 86
3.3.1. Оптимизация количества фермента панкреатина в составе биосенсорной тест-системы 89
3.3.2. Изучение влияния рН среды и температуры на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов панкреатина 94
3.3.3. Влияние времени ингибирования на изменение удельной активности растворимого и иммобилизованного ферментов панкреатина 98
3.3.4. Влияние времени ферментативной реакции на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов панкреатина 99
3.3.5. Конструирование биосенсорной тест-системы на основе фермента панкреатина и разработка методики обнаружения ионов меди в воде 103
3.3.6. Изучение влияния сопутствующих ионов тяжелых металлов на определение ионов меди с использованием биосенсорной тест-системы 108
Заключение 111
Выводы 117
Список литературы
- Приготовление фосфатного буферного раствора
- Приготовление буферного раствора (рН = 8,4)
- Влияние количества субстрата на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы
- Влияние времени ферментативной реакции на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов панкреатина
Введение к работе
Актуальность проблемы. На сегодняшний день одним из перспективных направлений развития биотехнологии является разработка композиционных материалов различной структуры. Полученные композиции обладают уникальными свойствами, которых не имеют отдельные их составляющие, что значительно расширяет спектр их применения. Преимуществом высокомолекулярных композиций перед обычными материалами является возможность варьирования различных свойств и характеристик в зависимости от предназначения получаемого материала.
Технологии создания композиционных материалов включают в себя ряд открытий последних лет в области химии и физики высокомолекулярных систем и структур (Володькин Д.В., 2005; Тулинов А.Б., Корнеев А.А., Овчаренко Л.В., Гармаш И.И., 2007; Андрианова Г.П., 2010; Буниятзаде И.А., Мамедов Г.Г. и др., 2010; Межиковский С.М., 2010; Олтаржевская Н.Д., Коровина М.А., 2010).
Использование научных подходов при конструировании композиционных материалов, направленных на изменение их структуры, реакционной способности и др., позволяет получить новый материал с заранее заданными свойствами в качестве основы для иммобилизации ферментов.
Иммобилизация открывает новые перспективы применения биокатализаторов, повышая их стабильность при хранении и позволяя использовать фермент многократно.
Работы по созданию биосенсоров на основе иммобилизованных ферментов актуальны и востребованы. Все большее количество ферментов используется при получении уникальных устройств, детектирующих наличие ингибиторов в различных объектах окружающей среды.
В настоящее время проблема загрязнения окружающей среды имеет приоритетное социальное и экономическое значение. Отходы производства, газообразные, жидкие и твердые вещества, поступающие в окружающую среду от различных источников, вызывают деградацию среды обитания и наносят ущерб здоровью населения, влияя на нервную и сердечно-сосудистую системы, органы кроветворения, репродуктивную сферу (Ушаков И.Б., Володин А.С., Губин В.В. и др., 2003).
Для повышения урожайности в сельском хозяйстве часто используются разнообразные фосфорорганические и хлорорганические пестициды (дихлор- дифенилтрихлорэтан (ДДТ), гексахлоран, хлорофос, метафос, тиофос, карбофос, метилмеркаптофос, дихлофос, диазинон, хлорпирифос), медьсодержащие ядохимикаты (бордосская жидкость, сульфат меди, хлорокись меди), обладающие высокой токсичностью и избирательным действием, значительная часть которых попадает в продукты растениеводства и животноводства.
Одним из наиболее часто используемых пестицидов в агропромышленности является карбофос - высокотоксичный фосфорорганический инсектицид, хорошо проникающий через кожу, способный угнетать действие фермента ацетилхо- линэстеразы.
В результате прямого окисления сульфидов меди кислородом воздуха или сульфатредуцирующими бактериями происходит загрязнение природных гидросистем токсичными ионами меди. Миграция меди в природных поверхностных и грунтовых водах связана с высокой подвижностью ее иона в сульфатных средах (Патент RU № 2182131).
Существующие физико-химические методы контроля достаточно трудоемки и малопригодны для проведения анализа вне лаборатории (Стойкова Е.Е, 1997; Евтюгин Г.А., 1999).
Ферментативные методы анализа являются перспективным направлением в диагностике окружающей среды при проведении эколого-аналитического мониторинга. Высокая селективность и чувствительность к ингибиторам ферментов - загрязнителям окружающей среды - является основанием для создания на их основе биосенсорных тест-систем с такими параметрами, как простота и удобство в применении, высокая чувствительность и надежность (Ильичева Н.Ю., 2002).
Цель диссертационной работы: разработка биотехнологии получения высокомолекулярных композиционных полимерных материалов, обладающих ферментативным действием, и биосенсорных тест-систем на их основе.
Основные задачи исследования:
-
Синтезировать композиционные материалы на основе высокомолекулярного природного полисахарида, белкового комплекса и пластификатора.
-
Исследовать физико-химические свойства полученного биополимерного материала (спектры поглощения в УФ - области, предел прочности, статический коэффициент, относительное удлинение при разрыве).
-
Разработать метод иммобилизации фермента ацетилхолинэстеразы и исследовать влияние различных факторов на его активность (рН среды, температура). Изучить динамику потери удельной активности в различных температурных условиях в процессе хранения.
-
Иммобилизовать фермент панкреатин в композиционные материалы и исследовать влияние некоторых факторов на его удельную активность (рН среды, температура). Изучить влияние времени постановки реакции, динамику потери удельной активности фермента панкреатина при хранении в течение длительных интервалов времени в различных температурных условиях.
-
Сконструировать биосенсорные тест-системы на основе высокомолекулярных композиционных материалов с иммобилизованными ферментами аце- тилхолинэстерой и панкреатином.
-
Провести апробацию биосенсорных тест-систем на содержание токсикантов в модельных системах.
Научная новизна работы. Получены новые композиционные материалы, способные к разложению в естественных условиях и обладающие следующими преимуществами: прозрачность, пластичность, механическая прочность структуры при разрывном напряжении.
Впервые проведена иммобилизация ферментных препаратов ацетилхо- линэстеразы и панкреатина в структуру высокомолекулярных композиционных материалов с высоким процентом сохранения их удельной активности.
Проведены исследования факторов, влияющих на чувствительность, селективность и снижение удельной активности ферментов при их иммобилизации в структуру композиционных материалов.
Впервые разработаны биосенсорные тест-системы на основе композиционных материалов с иммобилизованными ферментами ацетилхолинэстеразой, панкреатином, которые могут быть использованы для контроля остаточных количеств карбофоса и ионов меди (II) в объектах окружающей среды.
Теоретическая и практическая значимость работы. Разработаны технологические приемы получения высокомолекулярных композиционных материалов, обладающих ферментативным действием.
Получены высокомолекулярные композиционные материалы с иммобилизованными в их структуру ферментами, способные выступать в качестве биосенсорных тест-систем для определения ионов меди (II) и карбофоса в анализируемых образцах.
Разработан метод определения активности фермента панкреатина по прототипу определения амилазной активности. Упрощена методика определения активности фермента ацетилхолинэстеразы относительно ранее известной.
Разработаны методические подходы к использованию полученных биосенсорных тест-систем.
Материалы диссертации используются в лекциях и на практических занятиях курсов «Высокомолекулярные соединения» (лекция «Композиционные
биополимерные материалы как основа для иммобилизации ферментов»), «Введение в нанотехнологии» (лекция «Структура и свойства наноматериалов») ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский федеральный университет». Имеются акты испытаний: «Акт испытаний биосенсорной тест-системы на основе панкреатина» (от 10 октября 2012 г.), составленный в лаборатории биогеохимии и экологической экспертизы Института естественных наук ФГАОУ ВПО «СевероКавказский федеральный университет»; «Акт испытаний биосенсорной тест- системы на основе ацетилхолинэстеразы» (от 18 сентября 2012 г.), составленный в лаборатории защиты растений ГНУ Ставропольский НИИСХ Россельхоз- академии. На разработанные биосенсорные тест-системы составлены стандарты организации: «Тест-система биосенсорная для обнаружения остаточных количеств карбофоса в объектах внешней среды» (СТО 02067965-003-2012 от 15 октября 2012 г.); «Тест-система биосенсорная для обнаружения остаточных количеств меди в объектах внешней среды» (СТО 02067965-002-2012 от 15 октября 2012 г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
-
Методические подходы к конструированию композиционных полимерных материалов нелинейной архитектуры на основе природного полисахарида - метилцеллюлозы, пластификатора - глицерина и белкового комплекса - желатина, их физико-химические свойства.
-
Определены физико-химические параметры иммобилизации ферментов ацетилхолинэстеразы и панкреатина в структуру композиционной матрицы, обеспечивающие сохранение их высокой удельной активности.
-
Сконструированные биосенсорные тест-системы на основе композиционных материалов с иммобилизованными ферментами для обнаружения инсектицида карбофоса, детектирования ионов меди (II) в объектах окружающей среды и методические подходы к их использованию отличаются экспрессностью, специфичностью, не требуют дорогостоящего оборудования.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на: Московской международной конференции «Мир биотехнологии» (Москва, 2010), 55 научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2010), I Международной научной конференции «Наука в современном обществе» (Ставрополь, 2011), IV Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2011), 56 научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2011), 57 научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2012).
Личный вклад автора. Диссертационная работа выполнена самостоятельно. Отдельные этапы работы были выполнены совместно с кандидатом биологических наук Воробьевой О.В. (ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский федеральный университет»).
Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 15 опубликованных работах (в ведущих научных журналах, рекомендуемых ВАК - 6 статей).
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 139 страницах, содержит 19 таблиц и 42 рисунка. Список литературы включает 126 отечественных и зарубежных литературных источников.
Приготовление фосфатного буферного раствора
Целлюлоза не вступает в реакцию с белками, нуклеиновыми кислотами и их компонентами. Но при этом возможна сорбция биологических молекул на целлюлозе. Целлюлоза неустойчива к воздействию сильных кислот, щелочей и окислителей. Рабочий интервал рН составляет 3-10. Целлюлоза охотно атакуется микроорганизмами даже на холоде, поэтому ее водные суспензии хранят в присутствии антисептиков.
Водородные связи между линейными цепями целлюлозы на отдельных участках могут образовывать псевдокристаллические структуры, которые чередуются с более рыхлыми, аморфными областями - "порами". Так формируются макроскопические нити целлюлозы, легко набухающие в поперечном направлении. "Кристаллические" участки целлюлозы малодоступны для присоединения модифицирующих заместителей, которые из-за этого располагаются главным образом на поверхности нитей и в порах. В целом получается микрогетерогенная структура, характер которой зависит от исходного материала и технологии обработки целлюлозы.
Весьма существенно представлять себе влияние сушки на свойства целлюлозы. При удалении воды образуется множество дополнительных водородных связей на аморфных участках матрицы, так что объем пор резко уменьшается.
Для повышения жесткости проводят частичный кислотный гидролиз целлюлозы, разрушающий аморфные участки матрицы. На место разрушенных аморфных участков для сохранения пористости между "кристаллическими" участками вводят химические сшивки, одновременно увеличивая степень "кристалличности" и размеры пор. Такая микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) обладает повышенной жесткостью, она более гомогенна, что обеспечивает более высокую по сравнению с обычной (волокнистой) целлюлозой сорбционную емкость (Трофимова Н.Н., Бабкин В.А., 2003).
Существуют различные способы гидролиза целлюлозы. Брыляков В.М., Хасанханова М.Н., Шаповалов О.И. (1974) обрабатывали целлюлозу 40-70% раствором диметилсульфоксида с целью повышения выхода и качества носителя. Другие авторы выдерживали образцы целлюлозы в 95% три-фторуксусной кислоте от одного до трех часов при комнатной температуре, перемешивая. Затем в реакционную смесь добавляли 100% азотную кислоту и нитровали в течение 60 и 90 минут при температуре 30С. Полученный продукт стабилизировали стандартным методом (1% раствором аммиака). Далее нитраты целлюлозы подвергали кипячению в течение 4 часов, меняя воду через каждый час, и высушивали в сушильном шкафу при температуре 70С до постоянной массы. Синтезированные нитраты целлюлозы использовали для дальнейшего модифицирования и получения новых полимерных материалов (Касько Н.С., Панченко О.А., 2007).
Шишмаков А.Б., Еранкин СВ., Микушина Ю.В. и др. (2009) получали порошковую целлюлозу (ПЦ) гидролизом сульфатной целлюлозы. Карбонизацией полученной порошковой целлюлозы с диоксидами кремния и циркония авторами получены активные углеродные и углерод-оксидные композиционные материалы, выступающие в качестве носителей для катализаторов, энтеросорбентов, гемосорбентов, адсорбентов для хроматографии.
Голязимова О.В., Политов А. А. (2009) изучали механо-ферментативный гидролиз целлюлозы, используя сульфатную предгидролиз-ную целлюлозу с ферментным комплексом целлолюкс-А. Другие авторы для структурной модификации целлюлозы применяли целлюлазы - ферменты, катализирующие реакции гидролитического расщепления Р-(1,4)-гликозидной связи полисахаридной цепи. Полученный материал обладает сорбирующей способностью в 2-2,5 раза превышающей исходную (Белова А.В., Юданова Т.Н., Гальбрайх Л.С., 2010).
В настоящее время в качестве основообразующих компонентов все чаще применяют полусинтетические производные целлюлозы.
Котельникова Н. Е. (2009) отметила большой интерес к исследованию МКЦ в течение последних 10 лет. Исследования заключаются в получении различных образцов МКЦ из новых природных источников и их модификации с целью получения на их основе материалов, обладающих перспективными свойствами. К таким материалам относятся биологически активные полимерные системы на основе целлюлозы, целлюлозных волокон и целлюлозных материалов с синтетическими водорастворимыми биологически активными веществами (БАВ), такими, как поливинилпирролидон (ПВП), комплексы ПВП и четвертичного аммониевого основания, а также с белками (трипсин, альбумин), получаемыми путем адсорбционного взаимодействия. В последнее время возрос интерес к использованию природных полимеров в качестве матриц для наночастиц, что определяется особыми свойствами, которые приобретают полимеры при введении в них наночастиц. Котельникова Н.Е., Лысенко Е.Л. и др., начиная с 1995 года, проводят исследования по получению нанокомпозитов на основе целлюлозы, в том числе МКЦ и таких металлов, как серебро, медь, платина, палладий, никель и кобальт. Они впервые установили особенности и закономерности восстановления ионов металлов непосредственно в целлюлозной матрице, образования наночастиц металлов и их стабилизации в матрице. Было показано, что нанокомпозиты МКЦ и серебра или меди обладают бактерицидными свойствами, а нанокомпозиты МКЦ и никеля или кобальта являются ферро-магнетиками (Котельникова Н.Е., Лашкевич О.В., Панарин Е.Ф., 2005, 2007).
В фармацевтической промышленности МКЦ используется как наполнитель, связующий элемент, стабилизатор эмульсий или как матрица для лекарственных препаратов таблеточной формы. Кроме того, МКЦ способна поглощать токсины и шлаки и выводить их из организма (Атаханов А.А., 2009).
Приготовление буферного раствора (рН = 8,4)
Фермент ацетилхолинэстераза (ацетилхолин-ацетилгидролаза КФ 3.1.1.7) содержится в синапсах и играет ключевую роль в процессах нейро-гуморальной и синаптической передачи. Ацетилхолинэстераза катализирует гидролиз нейромедиатора ацетилхолина до холина и остатка уксусной кислоты. Реакция, катализируемая ферментом, необходима для дезактивации ацетилхолина в синаптической щели и перехода клетки-мишени в состояние покоя (например, для расслабления мышечной клетки). Ингибиторы ацетилхолинэстеразы (фосфорорганические инсектициды (паратион-метил, карбофос и др.), зарин, зоман, фасцикулин и некоторые другие пептиды змеиных ядов) — мощные токсины, воздействие которых на организм человека обычно приводит к смерти от судорог дыхательной мускулатуры (Белинская Д.А., Шестакова Н.Н., 2005; Актов Р.Х., Акберова Н.И., Тарасов Д.С., 2011).
Фосфатный участок инсектицида карбофоса, имитируя сложную группу ацетилхолина, выступающего в качестве субстрата для фермента ацетил-холинэстеразы, блокирует активный центр фермента. Положительно заряженный атом фосфора притягивается к свободной гидроксильной группе се-рина, а один из спиртовых остатков притягивается к карбоксилат-аниону.
Способность карбофоса ингибировать действие фермента ацетилхо-линэстеразы можно использовать для построения биосенсорной тест-системы по обнаружению остаточных количеств инсектицидов в объектах окружающей среды.
Для иммобилизации ацетилхолинэстеразы в структуру композиционного материала (раздел 3.1) использовали 0,15% водный раствор фермента. Фермент вводили в раствор компонентов, входящих в состав композиции, в объеме 0,1 мл.
Композиционные материалы формовали методом свободного растекания по гладкой стеклянной поверхности желаемой формы толщиной 2-3 мм с испарением растворителя в течение 36-48 часов при температуре 20-ь24С.
Полученные композиции сравнивали с композициями, не содержащими иммобилизованный фермент, на предмет поглощения в УФ-области. Данные представлены на рисунке 7.
Влияние содержания фермента ацетилхолинэстеразы на оптические свойства композиций на основе МЦ, желатина, глицерина
При включении фермента ацетилхолинэстеразы в композиционные материалы их оптические свойства не меняются.
При иммобилизации фермента ацетилхолинэстеразы в высокомолекулярные композиции важным параметром было сохранение его активности.
Для анализа активности растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы была модифицирована методика с использованием в качестве субстрата ацетилхолин хлорида, основанная на количественном определении уксусной кислоты, образующейся при гидролизе ацетилхолин хлорида в ферментативной реакции, катализируемой ацетилхолинэстеразой, с ингибированием карбофосом (Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А., 1982). Уксусная кислота сдвигает рН инкубационной смеси в кислую область, что выявляется с помощью индикатора и количественно определяется колориметрическим методом.
За единицу ферментативной активности принимали такое количество фермента, которое в стандартных условиях катализирует превращение 1 ммоль субстрата в единицу времени.
Суть предлагаемой методики состоит в следующем: к 0,1 мл раствора фермента ацетилхолинэстеразы (15 мг в 10 мл дистиллированной воды) добавляли 2 мл буферного раствора (рН 8,4) и термостатировали 30 минут при 37С. Параллельно термостатировали 2% водный раствор ацетилхолин хлорида, используемого в качестве субстрата. Для постановки ферментативной реакции к анализируемому раствору ацетилхолинэстеразы добавляли 0,5 мл 2% водного раствора ацетилхолин хлорида, смесь инкубировали в течение 30 минут при температуре 37С. Ферментативную реакцию останавливали, добавляя по 0,2 мл 1% водного раствора карбофоса. В качестве опытной пробы использовали смесь, в состав которой ингибитор вносили перед термостати-рованием. По окончании реакции в каждую пробу вносили по 2,1 мл дистиллированной воды и по 0,3 мл индикатора фенолового красного (0,02% водный раствор). Выделившееся количество уксусной кислоты оценивали по малиновой окраске на ФЭК-КФК-2 при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Количество выделившейся кислоты определяли по разности экстинкции контрольной и опытной проб с учетом калибровочной кривой в координатах оптическая плотность/количество кислоты (мг).
Активность рассчитывали по формуле: __ 1000хтук,к_ТЬ1 " j МГ уксусной кислоты Г фермента J (Р) фермента где тук.к.ты — масса уксусной кислоты, мг; Шфермента_ масса фермента, мг; 1000 - единица перевода мг в г. По количеству уксусной кислоты в растворе рассчитывали удельную активность фермента. Калибровочный график в координатах оптическая плотность/количество уксусной кислоты представлен на рисунке 8.
Влияние количества субстрата на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы
Разработка биосенсорной тест-системы для определения ионов меди предполагает использование в качестве одного из компонентов тест-системы фермента, активность которого зависит от воздействия ионов меди на активный центр. В качестве такого фермента может выступать панкреатин.
Панкреатин - это пищеварительное ферментное средство, представляющее собой экстракт содержимого поджелудочной железы. В его состав входят панкреатические ферменты: амилаза, липаза и протеаза, участвующие в переваривании углеводов, жиров и белков.
Установлено, что за ферментативную амилазную активность панкреатина ответственны свободные аминогруппы, поэтому при действии ионов меди, вероятнее всего, образуется комплекс аминогруппы с ионами меди, который блокирует фермент.
Для иммобилизации фермента панкреатина в структуру композиционного материала была разработана следующая методика.
Готовили 3% раствор метилцеллюлозы в воде. Для исключения образования пузырьков воздуха в растворе его выдерживали в течение 12-15 часов при температуре +44-6С. В полученный коллоидный гель метилцеллюлозы вводили реагент для модификации реологических характеристик, раствор фермента в воде, пластификатор, придающий изделию гибкость, и перемешивали до однородного состояния (раздел 3.2).
Фермент в структуру композиций вводили в виде его раствора объемом 1 мл (15 мг порошка панкреатина в 50 мл дистиллированной воды).
Композиционные материалы формовали методом свободного растекания по гладкой стеклянной поверхности желаемой формы толщиной 2-3 мм с испарением растворителя в течение 36-48 часов при температуре 20-ь24С.
Для анализа использовали пять экспериментальных серий препарата иммобилизованного фермента панкреатина. При иммобилизации фермента панкреатина в структуру композиционного материала его оптические свойства не меняются. Активность фермента панкреатина определяли по амилазной активности, где в качестве субстрата использовали крахмал. Выбор метода определения активности обусловлен тем фактором, что фермент амилаза в составе панкреатина проявляет наибольшую активность.
Суть разработанного метода определения амилазной активности панкреатина состоит в следующем: к 0,1 мл раствора фермента панкреатина (15 мг в 500 мл дистиллированной воды) добавляли 1,6 мл фосфатного буферного раствора (рН 6,9) и термостатировали 30 минут при температуре 37С. Параллельно термостатировали 0,1% раствор крахмала, используемого в каче 87 стве субстрата, в 0,9% растворе хлорида натрия. Для постановки ферментативной реакции к анализируемому раствору панкреатина добавляли 1 мл 0,1% раствора крахмала в 0,9% растворе хлорида натрия, смесь инкубировали в течение 5 минут при температуре 37С. В качестве контроля использовали смесь, в состав которой вместо раствора фермента вносили 0,1мл 0,9% раствора хлорида натрия. Ферментативную реакцию останавливали, добавляя 0,1 мл 1М раствора соляной кислоты. Остаточное количество крахмала оценивали по сине-фиолетовой окраске с раствором йода на ФЭК-КФК-2 при длине волны 670 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Затем, исходя из оптической плотности, определяли количество крахмала в растворе и рассчитывали удельную активность фермента. Количество расщепленного крахмала определяли по разности экстинкции контрольной и опытной проб с учетом калибровочной кривой в координатах оптическая плотность/количество крахмала (мг).
Так как в основе биосенсорной тест-системы для обнаружения ионов Си2+ в объектах окружающей среды лежит ферментативная реакция с участием фермента панкреатина, необходимо исследовать все факторы, влияющие на ход реакции. Поэтому, создание оптимальных условий при использовании биосенсорной тест-системы для детекции ионов Си2+ в анализируемом растворе предполагало исследование таких факторов, как температура, рН буферного раствора, время ингибирования и время ферментативной реакции и др.
Для того, чтобы оптимизировать количество фермента в составе биосенсорной тест-системы, проводили постановку ферментативной реакции с различным содержанием растворимого и иммобилизованного ферментов панкреатина: 1,5 мкг; 3,0 мкг; 4,5 мкг; 6,0 мкг и одинаковым количеством крахмала в них (1 мл 0,1% крахмала - 1 мг крахмала). Ферментативные реакции проводили в присутствии и отсутствии ингибитора — ионов Си2+.
Для анализа использовали пять экспериментальных серий препарата иммобилизованного фермента панкреатина. Исследуемые пробы имели состав: 1 мл 0,1% раствора крахмала в 0,9% растворе хлорида натрия; 1,6 мл фосфатного буферного раствора (рН = 6,9). В одни пробы добавляли по 0,1 мл раствора композиционного материала (композиционный материал (ш = 36 мг), содержавший фермент панкреатин (т = 0,3 мг), растворяли в 10 мл дистиллированной воды). В другие пробы добавляли по 0,1 мл раствора растворимого фермента (15 мг в 500 мл дистиллированной воды). В опытную пробу добавляли 1 мл 0,0001% раствора CuS04 в начале реакции, а в контрольную -в конце реакции. Полученные образцы термостатировали 5 минут при температуре 37С. Активность фермента панкреатина определяли согласно методике (раздел 3.3.).
Влияние времени ферментативной реакции на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов панкреатина
Процесс построения биосенсорной тест-системы для обнаружения карбофоса предполагал разработку и оптимизацию метода иммобилизации фермента ацетилхолинэстеразы в высокомолекулярные композиционные материалы и метода определения активности растворимого и иммобилизованного фермента, где в качестве субстрата использовали ацетилхолин хлорид. Удельная активность иммобилизованного фермента - 43,1 ммоль УК/г фермента, что составляет 96% удельной активности растворимого фермента ацетилхолинэстеразы.
Оптимизация количества фермента, необходимого для анализа, показала, что при использовании 0,2 мг фермента ацетилхолинэстеразы наблюдается максимум разности удельной активности фермента в реакции без ин-гибирования и с ингибированием.
Следующим этапом являлось исследование количества субстрата, необходимого для анализа. Полученные данные свидетельствуют о том, что оптимальное количество субстрата ацетилхолин хлорида на 0,2 мг растворимого и иммобилизованного фермента ацетилхолинэстеразы составляет 0,055 ммоль.
С целью анализа влияния рН буферного раствора на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы был поставлен ряд экспериментов, которые показали, что для растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы рабочий диапазон рН - от 7 до 9, оптимум рН - 8,4.
Анализ влияния температуры на удельную активность растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы показал, что оптимум температуры, при которой разность удельной активности растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы в контрольной и опытной пробах максимальна, соответствует 37С. В опытной пробе с увеличением температуры удельная активность растворимого и иммобилизо ванного ферментов увеличивается вследствие снижения его активности как ингибитора. В контрольной пробе с увеличением температуры активность фермента снижается, что связано с термоинактивацией фермента.
Установлено, что время ингибирования и время постановки ферментативной реакции растворимого и иммобилизованного ферментов ацетил-холинэстеразы одинаково и составило 30 минут.
В процессе длительного хранения иммобилизованный фермент сохраняет высокую ферментативную активность по сравнению с растворимым ферментом. В результате хранения иммобилизованного препарата в течение четырех месяцев при температуре +4С удельная активность фермента составила 64%, а при температуре +18-25С - 11,2%. Следует отметить, что ферменты, являясь биологически активными субстанциями, способны терять активность в процессе хранения.
Проведенные исследования по сохранению удельной активности иммобилизованного фермента и фермента, находящегося в растворе во времени (температура хранения +4С) показали, что к третьему месяцу хранения иммобилизованный фермент ацетилхолинэстераза сохраняет 75% удельной активности, а фермент ацетилхолинэстераза, находящийся в растворе, сохраняет 8,4% удельной активности. Полученные данные по сохранению активности фермента-анализатора, иммобилизованного в композиционные материалы, подтверждают возможность создания на его основе биосенсорной тест-системы.
Сконструированная тест-система для обнаружения остаточных количеств инсектицида карбофоса в объектах окружающей среды представляет собой композиционный материал (ш = 37 мг), включенный в него фермент ацетилхолинэстеразу (т = 0,2 мг) и индикатор феноловый красный (т = 0,02 мг). Для разработки способа обнаружения инсектицида была составлена модельная система, которая представляла собой образцы почвы с внесенными количествами карбофоса. Полученные данные свидетельствуют о том, что количество карбофоса, равное 0,76x10"3 ммоль, снижает удельную актив ность растворимого и иммобилизованного ферментов ацетилхолинэстеразы на 21,4% и 20,8% соответственно. Дальнейшее увеличение количества инсек-тицида с 0,76x10" до 45x10" ммоль полностью угнетает действие фермента. Таким образом, чувствительность разработанной тест-системы при определении концентрации инсектицида карбофоса лежит в диапазоне от 0,76x10 3 до 45,0x10"3ммоль.
С целью получения биосенсорной тест-системы для детекции ионов меди был разработан и оптимизирован метод иммобилизации фермента панкреатина в высокомолекулярные композиционные материалы и метод определения активности растворимого и иммобилизованного фермента, где в качестве субстрата использовали крахмал. Удельная активность иммобилизованного фермента составляет 2,73x105 мг крахмала/г фермента или 97,5% удельной активности растворимого фермента панкреатина.
В результате оптимизации количества фермента панкреатина, выяснили, что количество фермента, приходящееся на 1 мг субстрата крахмала, составляет 3 мкг и соответствует оптимуму разности удельной активности в контрольной и опытной пробах. Повышение удельной активности фермента при увеличении его количества в условиях количественного сохранения ингибитора (2,5 мкг) связано с высокой каталитической активностью амилазы, входящей в состав панкреатина.
Установлено, что оптимумы рН среды и температуры проведения ферментативной реакции совпадают как для растворимого, так и для иммобилизованного фермента панкреатина и равны 6,9 и 37С соответственно.
Анализ влияния времени ингибирования фермента панкреатина показал, что в опытной пробе с увеличением времени ингибирования удельная активность растворимого и иммобилизованного ферментов уменьшается. Оптимум времени ингибирования для растворимого и иммобилизованного ферментов совпадает и равен 30 минутам, при этом наблюдается максимум разности удельной активности в опытной и контрольной пробах.
Похожие диссертации на Разработка технологии формирования биосенсорных тест-систем на основе композиционных материалов
-
