Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы . 14
1.1. Гибридомная технология получения МКА . 14
1.2. Серологические методы исследования в лабораторной диагностике холеры . 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы 40
2.1. Лабораторные животные . 40
2.2. Бактериальные штаммы . 40
2.3. Клеточные линии позвоночных 40
2.4. Питательные среды и реактивы 41
2.5. Гибридизация клеток 42
2.6. Клонирование гибридом . 44
2.7. Культивирование гибридом in vitro и in vivo 45
2.8. Криоконсервирование гибридом 46
2.9. Подъем из жидкого азота гибридом . 46
2.10. Очистка специфических иммуноглобулинов 46
2.11. Маркировка иммуноглобулинов ФИТЦ 47
2.12. Метод иммунофлуоресценции . 47
2.13. Иммуноферментные методы . 49
2.14. Иммуноблоттинг 50
2.15. Иммунодиффузия в геле по Оухтерлони . 50
2.16. Реакция агглютинации 51 2.17 Методы статистической обработки результатов CLASS ГЛАВА 3. Гибридомы-продуценты мка к антигенам v. cholerae o1 и o139 53 CLASS
3.1. Подъем из азота и оптимизация условий культивирования гибридом-продуцентов МКА, направленных к поверхностным эпитопам V. cholerae О139 53
3.2. Получение и выведение в массовую культуру гибридом, продуцирующих видоспецифические МКА О1 56
3.3. Оценка продукции специфических иммуноглобулинов гибридомами в условиях in vitro . 59
3.4. Получение и накопление в препаративных количествах МКА в виде АЖ 62
3.5. Выделение и очистка специфических иммуноглобулинов различными методами . 65
ГЛАВА 4. Характеристика мка, направленных к видоспецифическим эпитопам v. cholerae O1 и O139 67
4.1. Определение специфичности и активности МКА из АЖ и КЖ в различных серологических реакциях . 67
4.2. Определение класса специфических иммуноглобулинов 72
4.3. Оценка сохранности О-антигенных детерминант холерных вибрионов при различных способах инактивации . 73
4.4. Эпитопная направленность МКА О1 и О139 77
ГЛАВА 5. Иммунофлуоресцентные диагностикумы на основе мка для идентификации и дифференциации холерных вибрионов о1 и о139 серогрупп 79
5.1. Оптимизация условий получения видоспецифических флуоресцирующих моноклональных препаратов для идентификации V. cholerae O1 и O139 . 79
5.2. Наработка экспериментальных серий флуоресцирующих препаратов для испытания на широком наборе штаммов гомологичных и гетерологичных микроорганизмов и подготовка нормативно-технических документов 82
5.3. Лиофилизация флуоресцирующих МКА . 87
5.4. Оценка серологической активности флуоресцирующих препаратов после лиофилизации и в процессе хранения . 88
ГЛАВА 6. Применение агглютинирующих мка для идентификации холерных вибрионов о1 и о серогрупп в реакции слайд-агглютинации 91
6.1. Исследование агглютинабельности МКА, выделенных из АЖ и КЖ, в реакции слайд-агглютинации 91
6.2. Получение экспериментальных серий диагностических агглютинирующих МКА и их испытание на широком наборе штаммов 94
6.3 Стабильность лиофилизированных диагностических агглютинирующих МКА при хранении . 98
6.4. Оценка возможности применения диагностических наборов для выявления холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, подвергнутых воздействию различных факторов 99
Заключение 103
Выводы 113
Список литературы 115
- Серологические методы исследования в лабораторной диагностике холеры
- Питательные среды и реактивы
- Получение и выведение в массовую культуру гибридом, продуцирующих видоспецифические МКА О1
- Оценка сохранности О-антигенных детерминант холерных вибрионов при различных способах инактивации
Введение к работе
Актуальность проблемы. Трудность в борьбе с холерой, как
отмечалось на 64-ой сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения, вызвана
недостаточным количеством диагностических экспресс-тестов для выявления
холерных вибрионов и своевременного принятия мер, что определяет
необходимость дальнейших научных исследований по разработке таких
тестов. К настоящему времени для диагностики возбудителя холеры
рекомендованы к практическому использованию препараты, в основе
которых поликлональные иммунные сыворотки лошадиного происхождения,
имеющие ряд недостатков: разнородность и гетерогенность популяции
антител, низкие титры специфических иммуноглобулинов и, как следствие,
наличие перекрестных реакций при их применении внутри вида и с
гетерологичными микроорганизмами. Предпринимались попытки улучшения
качества препаратов за счет получения кроличьих сывороток (Мазрухо Б.Л.,
Ишина Е.В., 1998; Абрамова Е.Г. с соавт., 2002; Аленкина Т.В. с соавт., 2010,
2012). Однако проблема обеспечения высокоспецифичными препаратами
остается актуальной. Привлечение МКА в лабораторную диагностику холеры
позволяет решить проблему качества реагентов. Так, первые публикации,
касающиеся использования МКА в серодиагностике холеры, появились за
рубежом еще в начале 80-х годов (Gustafsson B. et al., 1982; Robb M. et al.,
1982; Gustafsson B., 1984, 1985). Позже другие зарубежные авторы
сконструировали на основе МКА высокоэффективные тест-системы: для
слайд-агглютинации (Adams L.B. et al., 1988), набор CholeraeScreen для
реакции коагглютинации (Colwell R.R. et al.,1992), дот-блот-ИФА (Supawat K.
et al., 1994), флуоресцирующие иммуноглобулины (Hasan J.A. et al., 1994;
Castillo L. et al., 1995). В отечественной практике сведения о холерных
моноклональных препаратах, имеющих диагностическую значимость,
представлены в работах Л.П. Алексеевой с соавт. (1988), О.С. Бурлаковой
(1993), З.Л. Девдариани с соавт. (1999), Н.Е. Терешкиной (2004),
Н.А.Сыровой (2005), О.С. Чемисовой (2006), В.А. Федоровой с соавт. (2007),
О.В. Маркиной (2008). Начиная с 2000 г. в ГНЦ ФГУП «ГосНИИ
биологического приборостроения» (г. Москва) ведутся работы в области
создания отечественных иммунохроматографических (ИХ) тест-систем,
чувствительность и специфичность которых повышается, если используются
МКА (Шиленко И.В. с соавт., 2007; Ярков С.П. с соавт., 2008). В рамках
совместной темы нашего института с ГНЦ ПМБ (г. Оболенск) разработана
моноклональная ИХ тест-система для выявления V. сholerae О1 (Хомяков
А.Е. с соавт., 2009; Баранова Е.В. с соавт., 2010, 2013). Однако проблема
обеспечения высокоспецифичными диагностикумами сохраняет
актуальность. В первую очередь это касается препаратов, широко используемых в лабораторной практике, в частности для постановки слайд-
агглютинации и иммунофлуоресценции. Потребность в таких препаратах
диктуется и современной ситуацией. Так, в ходе мониторинга водных
объектов наблюдается увеличение числа штаммов холерных вибрионов
неО1/не О139, которые давали положительную слайд-агглютинацию на
стекле с О1 холерной сывороткой, причем у части штаммов зарегистрировано
образование агглютината при постановке развернутой реакции в пределах
титров от 1/100 до 1/200, у отдельных до 1/400 и типоспецифическими
сыворотками Инаба - от 1/50 до 1/100 (Григоренко Л.В. с соавт., 2011). Этот
факт не исключает возможности диагностических ошибок при проведении
исследований на наличие возбудителя холеры лабораториями
территориального уровня, что подтверждает необходимость введения либо
дополнительного теста дифференциации, например реакции
иммунофлуоресценции (РИФ), либо высокоспецифичных диагностикумов. Одновременно существует и проблема низкоагглютинабельных штаммов холерных вибрионов О1 серогруппы, их идентификация на этом фоне представляется возможной только при условии использования препаратов, отличающихся высокой чувствительностью и специфичностью, применение которых в перспективе позволит исключить постановку развернутой реакции агглютинации, что сократит объем лабораторных исследований.
Цель исследования – совершенствование лабораторной диагностики холеры путем конструирования диагностических препаратов на основе МКА для идентификации холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в реакциях прямой иммунофлуоресценции и слайд-агглютинации.
Задачи исследования:
-
Расширить спектр имеющихся гибридом за счет получения новых, продуцирующих МКА к видоспецифическим эпитопам холерных вибрионов О1 серогруппы, охарактеризовать их изотип, направленность, аффинность, наличие перекрестной активности внутри вида, рода.
-
Получить в препаративных количествах видоспецифические МКА, провести их очистку с помощью различных методов, оценить их специфическую активность в реакциях непрямой иммунофлуоресценции, слайд-агглютинации, преципитации и иммуноферментном анализе.
-
Разработать на основе охарактеризованных МКА биотехнологическую схему получения флуоресцирующих моноклональных иммуноглобулинов для выявления V. сholerae О1 и О139 в реакции прямой иммунофлуоресценции, наработать экспериментальные серии препаратов в лиофилизированном виде.
-
Изучить агглютинирующие свойства видоспецифических МКА О1, МКА О139, выделенных из культуральных и асцитических жидкостей, в реакции слайд-агглютинации на наборе штаммов гомологичных и
гетерологичных микроорганизмов, отобрать диагностически значимые
агглютинирующие МКА.
5. Провести лабораторные испытания экспериментальных серий
видоспецифических флуоресцирующих и агглютинирующих МКА О1,
МКА О139, оформить нормативную документацию для их
государственной регистрации.
Научная новизна. Набор видоспецифических гибридом, которыми
располагает лаборатория, расширен за счет получения новых,
продуцирующих МКА, направленные к детерминантам О-антигена ЛПС V. сholerae О1. На основании иммунохимического анализа штаммов холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп установлены диагностически значимые МКА, отличающиеся тем, что они выявляют консервативные эпитопы ЛПС, с высокой плотностью представленные на клеточной поверхности, пространственно расположенные так, что при взаимодействии с антителами не возникает стерических помех. Установление эпитопов, в меньшей степени подверженных модификации и утрате при воздействии различных факторов, способствует повышению диагностической ценности препаратов.
Впервые показана возможность использования в качестве
полноценного источника МКА для изготовления препаратов не только асцитической, но и культуральной жидкости, которая в больших объемах накапливается при пассировании гибридом-продуцентов in vitro.
Отработана и оптимизирована технология изготовления
моноклональных флуоресцирующих иммуноглобулинов к V. сholerae О1 и О139, заключающаяся в выделении активной фракции иммуноглобулинов сульфатом аммония, обессоливании диализом, выборе оптимального соотношения флуорохрома и МКА, стабилизации конъюгатов путем лиофильного высушивания.
Теоретическая и практическая значимость работы. Набор гибридом, стабильно продуцирующих видоспецифические МКА О1 и О139, является источником стандартных моноклональных иммуноглобулинов, на основе которых сконструированы диагностические препараты нового поколения.
Разработана экспериментально-производственная технология
изготовления моноклональных флуоресцирующих конъюгатов для
диагностики холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в реакции прямой иммунофлуоресценции. Создан диагностический набор агглютинирующих МКА для идентификации и дифференциации V. сholerae О1 и О139 в реакции слайд-агглютинации. По результатам проведенных исследований оформлен комплект нормативной документации, включающий в себя инструкцию по применению, справку об изделии медицинского назначения и технические
условия на наборы реагентов «Иммуноглобулины моноклональные
диагностические флуоресцирующие сухие для серологической
идентификации V. cholerae О1 и О139 (in vitro) методом РИФ «Иг - V. cholerae О1/О139 – РИФ» и «Иммуноглобулины моноклональные диагностические cухие для серологической идентификации V. cholerae О1 и О139 (in vitro) методом РА «ИГ –V.cholerae О1/О139 — РА», которые в настоящее время находятся на регистрации в Росздравнадзоре.
На гибридомы, стабильно продуцирующие МКА к видоспецифическим
эпитопам возбудителя холеры О1 и О139, получены два патента на
изобретение №2425874 от 13.04.2010 «Штамм культивируемых гибридных
клеток животных Mus. musculus L-продуцент моноклональных антител,
специфичных к О-антигену холерных вибрионов О1 серогруппы» и
№2425875 от 07.06.2010 «Штамм культивируемых гибридных клеток
животных Mus. musculus L-продуцент моноклональных антител,
специфичных к ЛПС холерных вибрионов О139 серогруппы».
Экспериментальные серии флуоресцирующих МКА О1 и МКА О139 были использованы при выполнении кандидатской диссертационной работы Куликаловой Е. С. на базе ФГУЗ «Иркутского научно-исследовательского противочумного института». Разработанные наборы используются при выполнении научно-исследовательских работ во ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, в работе СПЭБ, также для оценки качества препараты в коммерческом виде переданы в Волгоградский и Ставропольский противочумные институты, в ГНЦ ПМБ (г. Оболенск).
Методология и методы исследования. В работе использованы
различные методы исследования: микробиологические (культивирование
штаммов микроорганизмов), гибридомная технология, методы иммунохимии
(ИФА, РИФ, слайд-агглютинация, преципитация, иммуноблот),
биохимические и микроскопические.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Набор гибридом-продуцентов обеспечивает получение диагностически значимых, стандартных, воспроизводимых МКА, узнающих видоспецифические эпитопы О-антигена холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, позволяет конструировать диагностические препараты нового поколения.
-
Видоспецифические МКА выявляют консервативные эпитопы ЛПС, с высокой плотностью представленные на клеточной поверхности вибрионов и в меньшей степени подверженные модификации или утрате при воздействии различных факторов, что способствует повышению диагностической ценности препаратов.
-
Для создания диагностических препаратов впервые использована культуральная жидкость, являющаяся полноценным источником
иммуноглобулинов, получение которой не требует привлечения лабораторных животных.
-
Разработанная биотехнологическая схема экспериментально-производственного изготовления холерных О1, О139 флуоресцирующих иммуноглобулинов позволяет получать препараты, характеризующиеся высокой специфичностью и чувствительностью.
-
Набор диагностических агглютинирующих МКА без дополнительной постановки развернутой реакции агглютинации обеспечивает выявление холерных вибрионов О1, О139 серогрупп.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на научных конференциях: проблемная комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы» (г. Ростов-на-Дону, 2009 - 2013); научно-практическая конференция «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных природноочаговых болезней», посвященная 75-летнему юбилею ФГУЗ Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока (г. Иркутск, 2009); конференция молодых ученых ФГУЗ РостНИПЧИ (г. Ростов-на-Дону, 2011); Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора с международным участием: «Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения» (г. Пермь, 2012).
Диссертационная работа выполнена в рамках государственной темы
№ 121-4-10 «Создание видоспецифических моноклональных препаратов для
идентификации холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп с помощью
тестов слайд-агглютинации, прямой иммунофлуоресценции и
иммунохроматографии (2010 – 2014)» (номер государственной регистрации 01200907528).
Личный вклад соискателя. Основные разделы диссертационной
работы выполнены Кретенчук О.Ф. самостоятельно на базе группы гибридом
Ростовского-на-Дону противочумного института. Разработка идей,
постановка научных задач, методическая часть работы, конструирование препаратов, получение научных результатов и их обоснование были выполнены автором под руководством д.б.н., профессора Л.П. Алексеевой.
Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, 5 из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК РФ. Получены 2 патента на изобретение № 2425874 (13.04.2010 г.) и №2425875 (07.06.2010 г.).
План диссертационной работы утвержден на заседании Ученого
совета ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института
Роспотребнадзора (протокол № 8 от 19.06.2012 г.)
Структура диссертации. Работа изложена на 134 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 156 источников, в том числе зарубежных – 37. Диссертация иллюстрирована 21 рисунками и 19 таблицами.
Серологические методы исследования в лабораторной диагностике холеры
Актуальность проблемы. Первое десятилетие ХХI века отмечено крупными эпидемиями и вспышками холеры в странах Африки и Азии, а также Северной Америки с заносами инфекции из эндемичных очагов практически ежегодно на все континенты, с тенденцией к росту мировой заболеваемости, что определяет неблагоприятный прогноз и для России [77]. Поэтому в нашей стране постоянно проводятся мероприятия, направленные на предупреждение заноса и распространения этого особо опасного заболевания. Одной из важнейших составных частей эпидемиологического надзора за холерой является своевременная диагностика, эффективность которой зависит от наличия высокочувствительных и специфичных препаратов для серологического анализа. Как отмечалось на 64-ой сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения, трудность в борьбе с холерой вызвана недостаточным количеством диагностических экспресс-тестов для выявления холерных вибрионов и своевременного принятия мер, что определяет необходимость дальнейших научных исследований по разработке таких тестов.
В последние годы активно развиваются инновационные технологии по созданию рекомбинантных белков, в частности антител, получаемых с помощью молекулярно-генетических манипуляций. Благодаря разработке гибридомной технологии широкое распространение в лабораторной диагностике получили и моноклональные антитела (МКА). Уже первые МКА продемонстрировали уникальные преимущества перед поликлональными сыворотками: высокая специфичность и активность, стандартность, стабильность, возможность получения в неограниченном количестве. Очевидно, что МКА в силу своей уникальной направленности к индивидуальным антигенным детерминантам позволяют разработать на их основе препараты для серологической идентификации и дифференциации холерных вибрионов, отвечающие современным требованиям. Процесс замены поликлональных антител в диагностических наборах на моноклональные начался еще в начале 80-х годов и активно продолжается в настоящее время в направлении создания новых препаратов на основе МКА [37]. Зарубежные публикации, касающиеся использования МКА в серодиагностике холеры, появились еще в 1982 году, то есть намного раньше, чем отечественные. B. Gustafsson et al. получили МКА к коровой области ЛПС V. cholerae О1, которые выявляли в реакции слайд агглютинации антигенную детерминанту, общую для всех представителей вида V. cholerae [132]. Также этой группе авторов удалось получить МКА к A-, B- и С антигенам V. cholerae О1, на основе которых были приготовлены флуоресцирующие препараты для экспресс-диагностики холерных вибрионов О1. Позже другие зарубежные авторы сконструировали на основе МКА высокоэффективные тест-системы: для слайд-агглютинации [120], набор CholeraeScreen для реакции коагглютинации [125], дот-блот-ИФА [152], флуоресцирующие иммуноглобулины [123, 134]. J.A. Hasan с соавторами в 1994 г. создали набор для выявления V. cholerae О139, включающий реагенты для реакции коагглютинации и прямой иммунофлуоресценции [134]. Несомненно, такие препараты эффективны и полезны как в случае ранней диагностики холеры, так и на различных этапах исследования. В России работы по получению и созданию набора стабильных гибридом-продуцентов МКА к антигенным детерминантам возбудителей особо опасных инфекций целенаправленно были начаты в 90-е годы прошлого столетия. В отечественной практике сведения о холерных моноклональных препаратах, имеющих диагностическую значимость, появились в 1988 году в публикациях Л.П. Алексеевой с соавторами [5, 8, 28, 30]. В диссертации О.С. Бурлаковой (1993 г.) показана возможность использования МКА к О-антигену V. cholerae О1 для конструирования коагглютинационных и иммунофлуоресцентных диагностикумов [29]. Для экспресс-диагностики токсигенных штаммов V. cholerae З.Л. Девдариани с соавторами в 1999 г. предложили использовать МКА в дот-иммуноанализе [38]. В работе Н.Е. Терешкиной (2004 г.) описано создание на основе разноэпитопных МКА и поликлональных антител к ЛПС V. cholerae О139 экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем, предназначенных для детекции возбудителя холеры независимо от наличия у него капсулы [102]. С 2000 г. в Государственном Научном Центре ФГУП «ГосНИИ биологического приборостроения» (г. Москва) ведутся работы в области создания отечественных иммунохроматографических тест-систем, чувствительность и специфичность которых повышается, если используются МКА. В ФГУН ГНЦ ПМБ была оценена возможность использования в иммунохроматографических (ИХ) тест-системах МКА, продуцируемых гибридомами, полученными в Ростовском противочумном институте. Проведенные экспериментальные исследования показали, что антитела сохраняют свою иммунохимическую активность после конъюгирования с коллоидным золотом, поэтому на их основе были разработаны ИХ-полоски [11].
Результаты испытания полученных ИХ тест-систем для выявления V. cholerae О1 показали, что их применение позволяет выявить холерные вибрионы О1 серогруппы, если их концентрация в исследуемых пробах будет не ниже 108 м.к./мл. В случае низкоагглютинабельных штаммов содержание вибрионов в пробах должно быть не менее 109 м.к./мл. Е.В. Баранова с соавторами (2010 г.) сконструировали на основе МКА, высокоспецифических к холерному токсину, предназначенный для обнаружения токсигенных штаммов V. cholerae диагностикум «Тест-полоска V. cholerae tox+» [22]. Однако следует отметить, что ИХ тест-полоски не лишены недостатков: сравнительно низкая чувствительность порядка 108 - 109 м.к./мл зависит от качества используемых антител и концентрации антигена в биоматериале. Экономически затратным является и производство ИХ полосок, так как их себестоимость в итоге получается достаточно высокой. Из современных технологий обращает на себя внимание технология биомикрочипов. Так, в работе Е.С. Петровой с соавторами [80] описано создание тест-системы на основе специфичных к холерному токсину МКА в формате микрочипа и в планшетном варианте иммуноферментного анализа. Предел обнаружения токсина достигает 0,2 нг/мл в планшетном формате ИФА и 0,44 нг/мл в формате микрочипа.
Питательные среды и реактивы
Конъюгацию специфических иммуноглобулинов с ФИТЦ осуществляли по методу [17, 50, 66] с некоторыми модификациями: концентрация белка не ниже 5 мг/мл, ФИТЦ - 5 мг на 100 мг белка, 10% КББ, рН реакционной смеси 9,0 (достигалась предварительным диализом раствора иммуноглобулинов против КББ). Процесс конъюгирования происходил при температуре 6 ± 2 C в течение 18 ч или при комнатной температуре в течение 4 ч при постоянном перемешивании на магнитной мешалке.
Для удаления химически несвязанного белка от флуорохрома раствор флуоресцирующих антител диализовали против ФСБ с трехкратной сменой буфера в течение 24 часов или пропускали через колонку с сефадексом G-50, предварительно промытую ФСБ. На колонку сверху осторожно наслаивали флуоресцирующий конъюгат, подлежащий очистке от непрореагировавшего с белком флуорохрома. Для элюирования меченого белка из колонки применялся ФСБ. В процессе фильтрации в колонке появлялись 2 интенсивно окрашенные зоны: верхняя зона - непрореагировавший с белком свободный флуорохром, а нижняя - белок, связанный с ФИТЦ. На выходе из колонки белковую фракцию собирали с момента появления первых окрашенных капель и прекращали после прохождения через колонку всей интенсивно окрашенной нижней зоны.
Различают прямую (РПИФ) и непрямую иммунофлуоресценцию (РНИФ) [50]. В основе прямой иммунофлуоресценции лежит реакция взаимодействия искомого антигена и видоспецифических флуоресцирующих иммуноглобулинов. Непрямая иммунофлуоресценция позволяет обнаружить комплексы антигенов с предварительно нанесенными немечеными антителами с помощью антиглобулиновых конъюгатов. РПИФ. На фиксированные мазки холерных вибрионов микропипеткой наносили по 30 мкл раствора флуоресцирующих моноклональных антител. Препараты помещали во влажную камеру (чашку Петри с увлажненной ватой) при температуре 37C, не допуская высыхания нанесенного раствора антител. Через 30 минут мазки промывали 2 раза по 5 минут в промывающем растворе (ФСБ) и 1 раз ополаскивали дистиллированной водой. Препараты высушивали на воздухе и просматривали под люминесцентным микроскопом с применением иммерсионного нефлуоресцирующего масла.
РНИФ. На первом этапе на фиксированные мазки холерных вибрионов микропипеткой наносили по 30 мкл раствора МКА. Препараты помещали во влажную камеру при температуре 37C, не допуская высыхания нанесенного раствора антител. Через 30 минут мазки промывали 2 раза по 5 минут в промывающем растворе (ФСБ) и 1 раз ополаскивали дистиллированной водой. Препараты высушивали на воздухе. Второй этап – окраска специфического комплекса антиген–антитело люминесцирующей сывороткой против глобулинов мыши производства института им. Н.Ф. Гамалеи в течение 30 мин при 37C. Затем окрашенные мазки так же промывали в ФСБ и в дистиллированной воде, высушивали и просматривали под люминесцентным микроскопом.
Результаты реакции в зависимости от степени яркости флуоресценции бактерий, «окрашенных» люминесцирующими иммуноглобулинами, оценивали по четырехкрестовой системе: «4+» - сверкающая флуоресценция желтовато-зеленого цвета по периферии микробной клетки, четко контрастирующая с темным телом клетки; «3+» - яркая флуоресценция по периферии микробной клетки; «2+» - слабое свечение всей клетки; «1+» - едва заметные контуры клетки.
Специфическим считается свечение с яркостью на «4+» и «3+», свечение с яркостью на «2+» или «1+» принято считать неспецифическим. Обнаружение светящегося ореола на 3+/4+ хотя бы у единичных клеток свидетельствует о наличии в исследуемом материале холерного вибриона [50]. 2.13. Иммуноферментные методы
Благодаря методической простоте, специфичности и высокой чувствительности широкое распространение получил твердофазный вариант ИФА (ТИФА). Его несложно модифицировать в «дот»-ИФА.
Постановку ТИФА осуществляли общепринятым методом [101] в 96-луночных плоскодонных планшетах («Costar»). Процедура включала в себя следующие основные этапы: 1. Сенсибилизация микропланшетов антигеном (2 часа при 37C или 24 часа при 6 ± 2 C), использовали миллиардную взвесь холерных вибрионов в дозе 107 -108 микробных клеток на лунку. 2. Отмывка планшетов от не связавшегося с пластиком антигена ФСБ (рН 7,4) с добавлением 0,1 % Твин-20 (ФСБ - Т). 3. Внесение в лунки исследуемых антител, инкубация в течение 1 часа при 37С. 4. Отмывка ФСБ - Т. 5. Внесение в лунки антимышиного пероксидазного конъюгата производства института им. Н.Ф. Гамалеи, инкубация 1 час при 37С. 6. Отмывка ФСБ. 7. Внесение хромогенной смеси (5 мг ортофенилендиамина «Serva» растворяли в 10 мл 0,1 М натрий-цитратного буфера, рН 4,5 и добавляли 50 мкл 30 % Н2О2), инкубация при комнатной температуре в течение 20 минут в темном месте. 8. Остановка цветной реакции путем внесения 1М серной кислоты. 9. Учет реакции с помощью спектрофотометра при длине волны 492 нм и визуально. Принцип ДИА аналогичен принципу ТИФА, но в качестве твердой фазы используется нитроцеллюлозная мембрана (НЦМ) с диаметром пор 0,2 мкм. Схема реакции включала следующие этапы: 1. Нанесение на НЦМ («Schleicher&Schuelle») раствора антигена в количестве 105 - 106 микробных клеток на точку, высушивание. 2. Отмывка НЦМ от несвязавшегося антигена ФСБ - Т.
Получение и выведение в массовую культуру гибридом, продуцирующих видоспецифические МКА О1
В задачи данного этапа работы входило изучение агглютинирующих свойств препаратов МКА, источником которых являются КЖ или АЖ гибридом-продуцентов. Чтобы получить АЖ (препараты №2 и №4), мышам внутрибрюшинно вводили значительное количество гибридомных клеток (10 млн.), наращивая их путем многократных пассажей в жидкой питательной среде. Пассирование гибридом-продуцентов в условиях in vitro сопровождалось накоплением больших объемов КЖ. Специфические иммуноглобулины из КЖ концентрировали преципитацией с помощью насыщенного раствора сульфата аммония (препараты №1 и №3).
Изучение агглютинирующей способности препаратов проводили на ограниченном наборе штаммов холерных вибрионов О1 (27 штаммов) и О139 (7 штаммов) серогрупп, RO (6 штаммов) и V. cholerae О22 (1 штамм). Вначале был установлен минимальный титр иммуноглобулинов, обеспечивающих образование агглютината с клетками холерных вибрионов, а затем проведена реакция слайд-агглютинации исследуемых штаммов с препаратами в установленном титре и в разведении, превышающем его в два раза. Результаты таблицы 15 свидетельствуют, что все штаммы V. cholerae О1 агглютинировались препаратом МКА №1, выделенном из КЖ гибридомы ГХ-F8/О1, в титре 1/4, а при разведении 1/8 – только 18 из 27. Высокая агглютинабельность зарегистрирована в отношении препарата №2 – иммуноглобулинов, осажденных из АЖ. Как видно, из 27 штаммов V. cholerae О1 он агглютинировал 27 в титре 1/64 и 21 – 1/128, что в 16 раз превышает активность первого препарата. Это объясняется большим содержанием специфических иммуноглобулинов в АЖ, имеющей МКА порядка 10 – 15 мг/мл. Также вполне возможно, что это связано не только с концентрацией Ig в препаратах, но и со структурной организацией и эпитопным составом О-антигена V. cholerae О1. Как видно, при большем разведении препаратов №1 (1/8) и №2 (1/128) не все штаммы холерных вибрионов серовара Инаба давали положительную реакцию. Так, первый препарат в титре 1/8 агглютинировал только с тремя штаммами V. cholerae Inaba, а №2 — с шестью из двенадцати, в свою очередь V. сholerae Ogawa обеспечивали образование агглютината в полном объеме.
Из данных литературы и наших предыдущих публикаций [6, 7, 67, 130, 131] известно, что у холерных вибрионов О1 серогруппы Огава видоспецифические детерминанты с высокой частотой экспонированы на поверхности клетки. В то же время у Инаба вибрионов часть из них экранирована и не открыта для взаимодействия с антителами. Особенности структурной локализации и представленности видоспецифических детерминант на поверхности холерных вибрионов О1 серогруппы также отражаются на их агглютинирующей способности. Известно, что для образования агглютината необходимо определенное соотношение микробных клеток и специфических иммуноглобулинов и для V. cholerae eltor серовара Inaba оно является оптимальным, если используются концентрированные препараты.
Что касается МКА О139, то они независимо от источника выделения (КЖ или АЖ) давали положительную реакцию со всеми взятыми в опыт штаммами V. choleraе О139. Объяснить этот факт вероятно можно принадлежностью МКА О139 к классу IgM, которые благодаря наличию 4-х субъединиц в составе молекулы агглютинируют лучше, чем IgG.
Свидетельством специфичности препаратов является отрицательная реакция с V. cholerae О22 и V. cholerae RО.
Таким образом, можно констатировать, что МКА О1 и МКА О139 подобно диагностическим поликлональным сывороткам агглютинируют клетки холерных вибрионов соответствующих серогрупп. Однако их преимущество в том, что они отличаются высокой специфичностью, свидетельство тому – отсутствие перекрестных реакций. На агглютинирующие свойства препаратов МКА, как свидетельствуют полученные данные, влияют частота экспонирования видоспецифических О детерминант на поверхности холерных вибрионов, количество специфических иммуноглобулинов в составе препарата, класс Ig. С практической точки зрения каждый из препаратов имеет свой плюс: МКА в виде АЖ могут не подвергаться предварительной очистке, так как пул сопутствующих иммуноглобулинов невысок в сравнении со специфическими и не вызывает перекрестных реакций; МКА из КЖ несмотря на более низкие титры по отношению к асцитным, не требуют наличия лабораторных животных и процесс их получения технологически проще, а по агглютинабельности они сопоставимы, как в случае с V. choleraе О139. По совокупности этих показателей для конструирования препаратов использовали асцитные МКА, наиболее отвечающие диагностическим требованиям.
Получение экспериментальных серий диагностических агглютинирующих МКА и их испытание на широком наборе штаммов
На основании полученных результатов агглютинабельности был укомплектован набор реагентов «Иммуноглобулины моноклональные диагностические cухие для серологической идентификации V. cholerae О1 и О139 (in vitro) методом РА «ИГ –V.cholerae О1/О139 — РА», в состав которого входят: 1. иммуноглобулины моноклональные диагностические холерные О1 агглютинирующие; сухие – 1 флакон (6 мг); 2. иммуноглобулины моноклональные диагностические холерные О139 агглютинирующие; сухие – 1 флакон (6 мг). К набору прилагается инструкция по применению и аналитический паспорт на поставляемую серию. На рисунке 20 представлено фотоизображение медицинского изделия.
Оценка сохранности О-антигенных детерминант холерных вибрионов при различных способах инактивации
В задачи работы входило конструирование диагностикумов на основе МКА с последующим применением их в лабораторной практике, поэтому предпочтение отдавали гибридомам - продуцентам МКА, специфически взаимодействующих с детерминантами, наиболее устойчивыми к различным воздействиям, а также представленные на клеточной поверхности с высокой частотой и в доступной для связывания форме. Если сравнивать активность специфических иммуноглобулинов гибридом ГХ-F8/О1 и F11 в отношении инактивированных штаммов, то более высокие показатели ОП отмечены в отношении ГХ-F8/О1, что позволяет говорить не только о большей чувствительности к внешнему воздействию детерминант, выявляемых F11, но и об их содержании в составе ЛПС в меньшем количестве или замаскированном другими структурами. Что касается эпитопной направленности исследуемых гибридом, то результаты конкурентного ТИФА свидетельствуют о пространственной разобщенности детерминант, узнаваемых МКА О1 ГХ-F8/О1 и F11, а в случае 3Е4 и 3В5 эпитопы оказались пространственно сближенными на молекуле антигена. Поэтому для конструирования моноклональных препаратов решено было использовать в качестве основного источника МКА О1 гибридому ГХ-F8/О1, 109 а МКА О139 - 3Е4 и 3В5, которые выявляют консервативные эпитопы ЛПС, с высокой плотностью представленные на клеточной поверхности вибрионов и в меньшей степени подверженные модификации или утрате при воздействии различных инактивирующих факторов, что способствует повышению диагностической ценности препаратов.
Ставя перед собой задачу получения флуоресцирующих иммуноглобулинов, нами были подобраны оптимальные условия конъюгации: концентрация белка (МКА) не ниже 5 мг/мл, флуоресцеин-5 изотиоцианат - 0,5 мг на 10 мг белка, 10% КББ, рН реакционной смеси 9,0. В ходе экспериментов установлено снижение рН после добавления красителя, в результате чего значительная часть ФИТЦ не вступала в реакцию с белком, поэтому мы проводили либо предварительный диализ раствора иммуноглобулинов против КББ, либо корректировку рН в течение первых 30 минут раствором КББ. Конъюгация проходила в условиях холодильника в течение 18 часов или при комнатной температуре 4 часа. Но предпочтительным, по нашему мнению, является методический вариант, предусматривающий сокращение времени реакции до четырех часов. Для повышения стабильности и сроков хранения препаратов проводили их лиофильное высушивание. По отработанной схеме мы приготовили экспериментальные образцы флуоресцирующих моноклональных препаратов для выявления V. cholerae О1 и V.cholerae О139. Установлено, что красящий титр ФИТЦ-МКА О1 равняется 1:16, ФИТЦ-МКА О139 - 1:8. Определение чувствительности препаратов показало, что она находится на уровне 105м.к./мл. Также следует отметить, что специфическое свечение наблюдалось и в мазках с меньшей концентрацией холерных вибрионов, но в поле зрения выявлялись единичные вибрионы. ФИТЦ-МКА были укомплектованы в Набор реагентов «Иммуноглобулины моноклональные диагностические флуоресцирующие сухие для серологической идентификации V. cholerae О1 и О139 (in vitro) методом РИФ «Иг - V. cholerae О1/О139 - РИФ». Флуоресцирующие иммуноглобулины в комплекте 110 находятся в рабочем разведении с целью эффективного их использования. Набор рассчитан на выявление холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в 30 исследуемых образцах (расход на одно исследование – 30 мкл). Для оценки диагностической значимости «Иг - V. cholerae О1/О139 - РИФ» были проведены лабораторные испытания на широком наборе штаммов, которые продемонстрировали высокую специфичность набора и явились основанием для оформления нормативной документации (инструкции по применению, справки об изделии медицинского назначения и технических условий (ТУ 9398-001-01898316-2012). В течение 2012 года были проведены технические и медицинские испытания, по результатам которых исследуемые серии набора соответствовали основным характеристикам нормативно-технической документации. Изучение стабильности показателей вскрытых регидратированных реагентов набора «Иг - V. cholerae О1/О139 – РИФ» позволило установить, что приготовленные серии препаратов после растворения сохраняют специфическую активность в течение 7 суток при температуре от 2 до 8C, но для более длительного хранения мы рекомендуем раствор антител разлить на аликвоты и хранить при температуре минус 20C. Исследование стабильности специфической активности набора реагентов при хранении позволило установить срок годности – три года.
