Введение к работе
Актуальность темы
Бешенство, являясь летальной, острой зоонозной природно-очаговой инфекцией, представляет большую опасность для человека и, по оценке ВОЗ, по наносимому экономическому ущербу среди инфекционных болезней занимает пятое место. Заболеваемость бешенством регистрируется на территории большинства стран мира, где ежегодно свыше 10 миллионов человек получают различные повреждения от животных и более 4 миллионов человек — специфическую антирабическую помощь. Бешенство до сих пор остается практически неизлечимым заболеванием, от него ежегодно погибает до 50 тысяч человек. В Российской Федерации социально-экономическое значение проблемы бешенства в последние годы неуклонно растет, в том числе вследствие формирования новых очагов инфекции. В Российской Федерации на протяжении последних 11 лет не снижается опасность распространения заболеваний бешенством среди животных и возникновения случаев заболевания людей. Почти во всех регионах страны периодически отмечается активизация природных очагов бешенства, растет число случаев заболевания среди диких плотоядных животных, вовлекаются в эпизоотический процесс домашние и сельскохозяйственные животные. В период с 2000 по 2006 годы в 35 субъектах Российской Федерации было зарегистрировано 99 случаев гидрофобии среди людей (Хадарцев с соавт., 2006; Государственный доклад о санитарно-эпидемиологической обстановке…, 2007).
Оптимальным методом системной антирабической постэкспозиционной профилактики бешенства является комбинированное введение антирабической вакцины и антирабического иммуноглобулина (WHO Expert Consultation on Rabies…, 2004). Для пассивной иммунизации людей применяют гетерологичный или гомологичный иммуноглобулин. Отрицательной стороной всех гетерологичных препаратов антирабического иммуноглобулина является опасность развития аллергических осложнений. Согласно данным ВОЗ, у 1-2% пациентов при введении гетерологичного иммуноглобулина могут возникнуть побочные реакции (WHO Expert Consultation on Rabies…, 2004). При использовании гомологичного иммуноглобулина таких осложнений не возникает, но его себестоимость в несколько раз превышает таковую гетерологичного иммуноглобулина. Перспективным направлением является создание препаратов с менее выраженными реактогенными свойствами, но в то же время с доступной ценой.
Наиболее рациональным направлением совершенствования лошадиных иммуноглобулинов представляется разработка способов дополнительной очистки c помощью ферментативного гидролиза иммуноглобулина с последующим фракционированием на хроматографической колонке. Настоящее исследование посвящено разработке нового препарата с улучшенными свойствами на основе антирабического иммуноглобулина.
Цель работы состояла в разработке оптимальной схемы получения препарата F(ab’)2-фрагментов антирабического гетерологичного иммуноглобулина с применением иммобилизованного пепсина.
Задачи исследования:
-
Выбрать оптимальный способ получения препарата иммобилизованного пепсина, стабильного в условиях ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина.
-
Охарактеризовать биохимические свойства иммобилизованного пепсина.
-
Разработать экспериментальную схему эффективного ферментативного гидролиза иммуноглобулина с помощью иммобилизованного пепсина.
-
Подобрать оптимальные условия для хроматографического фракционирования и концентрирования препарата F(ab’)2-фрагментов антирабического иммуноглобулина.
-
Охарактеризовать препарат F(ab’)2-фрагментов антирабического гетерологичного иммуноглобулина по соответствию физико-химических свойств нормативным документам, предъявляемым к антирабическому иммуноглобулину.
-
Исследовать протективные и реактогенные свойства препарата антирабического иммуноглобулина на основе F(ab’)2-фрагментов в сравнении с коммерческим препаратом нерасщепленного гетерологичного антирабического иммуноглобулина на лабораторных животных.
Научная новизна
Получен антирабический препарат на основе F(ab’)2-фрагментов, для осуществления этапа ферментативного гидролиза предложено использование иммобилизованного пепсина. Сконструированы стабильные биокатализаторы, пригодные для осуществления ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина. Показано, что реактогенные свойства препарата F(ab’)2-фрагментов менее выражены, чем у нерасщепленного иммуноглобулина, при этом специфическая активность препаратов практически одинакова.
Практическая значимость работы
Разработана биотехнологическая схема получения препарата F(ab’)2 фрагментов антирабического иммуноглобулина, предназначенного для постэкспозиционной профилактики гидрофобии у людей. Схема включает следующие этапы: иммобилизацию пепсина, ферментативный гидролиз антирабического иммуноглобулина, хроматографическое отделение F(ab’)2-фрагментов от остатков Fc-части молекулы иммуноглобулина и нерасщепленного иммуноглобулина, концентрирование и стерилизующую фильтрацию. Показано, что для осуществления ферментативного гидролиза иммуноглобулина наиболее эффективно использовать пепсин, иммобилизованный на нерастворимых матрицах. В качестве матриц могут выступать AH-агароза, Dowex AG 1X8, природный силикат. Для очистки препарата подобраны условия хроматографического фракционирования на геле SP-Sepharose-XL. F(ab’)2-фрагменты элюировали вторым пиком без примесей низкомолекулярных пептидов и нерасщепленных молекул иммуноглобулина. Элюцию проводили 0,02 М ацетатным буфером (рН 5,5) на колонке размером 5,0 х 30 см со скоростью 4 мл/мин. Для концентрирования препарата подобраны условия лиофильного высушивания. Высушивание проводили в течение 48 часов, начальная температура материала составляла минус 40 С, давление в камере — 2-3 Па, температура испарителя — минус 90 + 2С. Полученный препарат на основе F(ab’)2-фрагментов нетоксичен, его специфическая активность не уступает таковой нерасщеплённого иммуноглобулина, при этом реактогенные свойства менее выражены.
По результатам проведенных научных исследований разработаны методические рекомендации «Получение F(ab’)2-фрагментов антирабического иммуноглобулина в лабораторных условиях». Методические рекомендации одобрены Учёным советом РосНИПЧИ "Микроб" (протокол № 2 от 17 апреля 2007 г.) и утверждены директором института 15.05.2007.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Способ иммобилизации пепсина на природном силикате с помощью растворимого карбодиимида является оптимальным для получения биокатализатора, предназначенного для ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина.
-
Разработанная схема с использованием ферментолиза гетерологичного антирабического иммуноглобулина при 37С и рН 4,5+0,5 в течение 24 часов и хроматографического фракционирования на геле SP-Sepharose-XL позволяет получать антирабический препарат, представляющий собой монофракцию F(ab’)2-фрагментов антител.
-
Препарат F(ab’)2-фрагментов антирабического иммуноглобулина соответствует нормативным физико-химическим параметрам, предъявляемым к коммерческому препарату гетерологичного антирабического иммуноглобулина: содержанию белка, прозрачности, цветности, электрофоретической однородности.
-
Уровень вируснейтрализующей активности экспериментальных образцов препарата F(ab’)2-фрагментов равен таковому коммерческого препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина.
-
Препарат на основе F(ab’)2-фрагментов антирабического иммуноглобулина не обладает анафилактогенными свойствами.
Работа выполнена в отделе профилактических препаратов РосНИПЧИ "Микроб" в рамках темы НИР: «Разработка и внедрение в производство новых медицинских иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики возбудителей опасных инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы» (шифр: 26205).
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на: ежегодных научно-практических конференциях РосНИПЧИ "Микроб" "Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте "Микроб" (Саратов, 2007 - 2008); Всероссийском научном форуме «Инновационные технологии медицины XXI века» (Москва, 2006); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); II Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Рязань, 2007); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными заболеваниями на территории государств-участников СНГ: Материалы» (Волгоград, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 2 статьи, одна в издании, рекомендованном «Перечнем ведущих рецензируемых научных журналов и изданий» ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, четырех глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследований и экспериментальную часть, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 192 источников, из них зарубежных – 100. Объём диссертации составляет 144 страниц машинописного текста, включает 28 рисунков и 5 таблиц.
