Введение к работе
Актуальность темы. Всесторонние исследования по изучению бактериофагов, выполненные за последние 40-45 лет, позволили широко использовать их для решения многих задач в микробиологии, вирусологии, генетике, биохимии, иммунологии, радиобиологии, биотехнологии и других областях биологических исследований. Поэтому учение о фагах, развивающееся вначале как узкая область медицинской и ветеринарной микробиологии, в настоящее время приобрела общебиологическое значение.
Однако, несмотря на накопленный большой научный материал по изучению биологических свойств бактериофагов, многие вопросы требуют дополнительных исследований. Так, например, у большинства, как считалось ранее, глубоко изученных модельных эшерихиозных фагов Т-серии, так и не удалось выяснить функцию двух третей синтезируемых ими продуктов (В.Н. Крылов, 2003). До сих пор нет единой схемы таксономии и морфологической классификации этих микроорганизмов, отсутствуют стандартные наборы бактериофагов многих возбудителей заболеваний животных и человека, а также схемы и регламенты их применения (B.C. Русалеев, 1990).
В последние годы, благодаря работам многих отечественных и зарубежных
исследователей, расширилось представление об этиологической роли условно-
патогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae в патологии животных и че
ловека. Энтеробактерии широко распространены в природе, и большая часть их
часто обитает в составе нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта
животных и человека. Эти микроорганизмы способны вызывать у жи-
вотных и людей как самостоятельные заболевания (эшерихиоз, иерсиниоз, клебсиеллезную и моганеллезную инфекцию и др.), так и в ассоциации с другими микробами различные воспалительные процессы (нагноение ран, абсцессы, маститы, эндометриты, менингиты, пневмонии, сепсис и т.п.), а также кормовые и пищевые токсикозы и токсикоинфекции. Особого внимания заслуживают работы разных ветеринарных исследователей по изучению роли этих микроорганизмов в этиологии инфекционной диареи молодняка животных.
До начала 90-х годов прошлого столетия ветеринарные лаборатории нашей страны бактериологические исследования патологического материала от больного и павшего молодняка животных сводили к выявлению в нем только патогенных эшерихий, сальмонелл, клостридий перфрингенс, стафилококков и диплококков не принимая во внимание многих представителей других родов и видов семейства Enterobacteriaceae ввиду отсутствия нормативных документов по диагностике болезней, вызываемых этими микроорганизмами. Последние были разработаны и утверждены лишь в конце 1991 года (Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями) и затем переработаны в 1999 году, согласно которым бактерии родов Proteus, Morganella, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Providencia, Yersinia и др. получили официальное признание возбудителей болезни. В конце прошлого и начале настоящего века также было установлено, что диарею у молодняка животных с признаками геморрагического гастроэнтерита, а также отечную болезнь у поросят могут вызывать отдельные штаммы эшерихий серогруппы 0157 (серовары 0157:Н7 и 0157Н-), ранее не принимавшиеся во внимание как непатогенные для животных (О.А. Тугаринов, М.К. Пирожков, Ю.А. Малахов, 2001).
Контаминируя пищевое сырье и продукты питания, вышеуказанные энте-робактерии представляют большую опасность для людей, вызывая у них тяжело протекающие токсикоинфекции и септический процесс.
При постановке диагноза бактериологическим методом нередко возникает ряд трудностей, связанных с тем, что основой идентификации этих бактерий являются их биохимические (ферментативные) свойства, изучение которых не позволяет быстро и всегда идентифицировать названные микроорганизмы. Современные методы лабораторной диагностики (ПЦР, ИФА, РИА), которые могут быть использованы для их индикации и идентификации, хотя и являются высокоспецифичными и чувствительными, но сложность методик, высокая стоимость оборудования и реактивов для постановки этих реакций, делает их пока недоступными для многих бактериологических лабораторий. В связи с этим возникла необходимость в разработке методов лабораторной диагностики выше указанных инфекций, которые были бы менее трудоёмкими, более быстрыми, достаточно специфичными, чувствительными и доступными для лабораторий любого уровня. Одним из таких методов является фагодиагностика.
Цель и задачи исследований. Целью наших научных исследований явилось конструирование диагностических фаговых препаратов на основе выделенных и селекционированных бактериофагов малоизвестных ранее в ветеринарии патогенных энтеробактерий и разработка методов индикации и идентификации вышеуказанных микроорганизмов.
Для достижения указанной перед нами цели стояли следующие задачи:
Выделить из объектов внешней среды бактериофаги, активные в отношении энтеробактерий родов Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, видов Morganella morganii, Yersinia enterocolitica и Escherichia coli сероваров 0157:H7 и0157:Н-.
Изучить основные биологические свойства изолятов фагов (литическую активность, антигенные свойства, интенсивность адсорбции, длительность латентного периода внутриклеточного развития, урожайность, диапазон логической активности, специфичность, множественность инфекции, морфологию негативных колоний, морфологию фаговых корпускул, тип и размер нуклеиновой кислоты) и дать сравнительную характеристику селекционированным штаммам.
Отобрать штаммы фагов с заданными биологическими свойствами для конструирования диагностических препаратов.
Определить.таксономическое положение этих фагов в соответствии с современной Международной классификацией и номенклатурой вирусов.
Определить оптимальные параметры культивирования бактериофагов для изготовления диагностических препаратов.
Разработать технологию получения и контроля фагодиагностикумов.
Разработать схемы и условия ускоренной идентификации патогенных энтеробактерий с применением сконструированных диагностикумов.
Разработать схемы и технологические параметры индикации вышеуказанных микроорганизмов с помощью РНФ.
Научная новизна. Выделены и селекционированы специфические фаги, лизирующие патогенные для животных и человека энтеробактерий, в результате чего создана коллекция новых штаммов фагов.
Изучены основные биологические свойства выделенных фагов (литическая активность, антигенные свойства, интенсивность адсорбции, длительность латентного периода внутриклеточного развития, урожайность, диапазон литиче-
ской активности, специфичность, множественность инфекции, морфология негативных колоний, морфология фаговых корпускул, тип и размер нуклеиновой кислоты) и дана их сравнительная характеристика. Определено классификационное положение изученных изолятов по биологическим свойствам согласно современной классификации и таксономии вирусов.
Разработаны технологические режимы и условия изготовления и контроля диагностических биопрепаратов из селекционированных изолятов фагов.
Впервые разработаны методы фагоиндикации и фагоидентификации энте-робактерий родов Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, видов Morganella morganii.Yersinia enterocolitica и Escherichia coli сероваров 0157:H7 и 0157:H-b объектах ветеринарного надзора. Доказана возможность использования созданных биопрепаратов с диагностической целью.
Практическая значимость. Четырнадцать выделенных и изученных штаммов бактериофагов депонированы в коллекции Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, признаны перспективными и рекомендованы для изготовления диагностических и лечебно-профилактических препаратов:
Штамм бактериофага Phagum Morganella morganii Ml7 УГСХА - ДЕП. Справка о депонировании от 11.02.1999 г.
Штамм бактериофага Phagum Morganella morganii М-20 УГСХА - ДЕП. Справка о депонировании от 11.02.1999 г.
Штамм бактериофага Phagum Escherichia coli О] 57 Е-61 УГСХА - ДЕП. Справка о депонировании от 29.05.2002 г.
Штамм бактериофага Phagum Escherichia coli 0157 Е-67 УГСХА - ДЕП. Справка о депонировании от 29.05.2002 г.
Штамм бактериофага Phagum Citrobacter С-61 УГСХА - ДЕП. Справка о депонировании от 23.04.04 г.
Штамм бактериофага Phagum Citrobacter С-66 УГСХА - ДЕП. Справка о депонировании от 23.04.04 г.
Штамм бактериофага Phagum Citrobacter С-52 УГСХА - ДЕП. Справка о депонировании от 23.04.04 г.
Штамм бактериофага Phagum Yersinia enterocolitica Y/9 УГСХА - ДЕП. Справка о депонировании от 23.04.04 г.
Штамм бактериофага Phagum Proteus П-16 УГСХА - ДЕП. Справка о депонировании от 21.02.06 г.
Штамм бактериофага Phagum Proteus П-261 УГСХА - ДЕП. Справка о депонировании от 21.02.06 г.
Штамм бактериофага Phagum Enterobacter Еп-2 УГСХА - ДЕП. Справка о депонировании от 21.02.06 г.
Штамм бактериофага Phagum Enterobacter En-13 УГСХА - ДЕП. Справка о депонировании от 21.02.06 г.
Штамм бактериофага Phagum Klebsiella К-10 УГСХА - ДЕП. Справка о депонировании от 21.02.06 г.
Штамм бактериофага Phagum Klebsiella К-81 УГСХА - ДЕП. Справка о депонировании от 21.02.06 г.
Разработаны нормативно-техничекие документы по изготовлению диагностических фаговых препаратов:
1. Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии эшери-хиозных бактериофагов E.coli 0157, Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА, утверждена
ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004 г.
2. Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бакте
риофагов Citrobacter С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА, утверждена
ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004 г.
Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Morganella morganii Ml7 УГСХА, и М20 УГСХА, утверждена ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004г.
Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофага Yersinia enterocolitica Y/9 УГСХА, утверждена ученым советом и ректором УГСХА 17.01.2005 г.
Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Proteus П-16 УГСХА и П-261 УГСХА, утверждена ученым советом и ректором УГСХА 17.01.2006 г.
Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Enterobacter Еп-2 УГСХА и En-13 УГСХА, утверждена ученым советом и ректором УГСХА 17.01.2006 г.
Инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Klebsiella К-10 УГСХА и К-81 УГСХА, утверждена ученым советом и ректором УГСХА 17.01.2006 г.
Результаты исследований по разработке методов фагодиагностики вошли в следующие нормативные документы:
Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки в Е. coli 0157:Н7 и 0157:Н- в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов, утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 4 октября 2004 года;
Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий вида Morganella morganii в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов, утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 4 октября 2004 года;
Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Citrobacter в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов, утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 4 октября 2004 года;
Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий айда Yersinia enterocolitica в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфического бактериофага, утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26 июня 2006 года;
Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Proteus в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов, утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26 июня 2006 года;
Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Klebsiella в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов, утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26 июня 2006
года;
7. Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Enterobacter в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов, утвержденных Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26 июня 2006 года.
Реализация результатов исследования. Выделенные и селекционированные штаммы фагов серии УГСХА родов Citrobacter (С-66, С-61, С-52), Enterobacter (En-2, En-13), Klebsiella (K-10, K-81), Proteus (П-16, П-261), видов Мог-ganella morganii (М-17, М-20), Yersinia enterocolitica (Y/9) и Escherichia coli ce-роваров 0157:H7 и 0157:Н- (Е-67, Е-61), депонированные в ФГУ «ВГНКИ», используются для изготовления диагностических бактериофагов.
Часть результатов диссертационной работы вошла в монографию: «Малоизученные энтеробактерий и их роль в патологии животных» (С.Н. Золотухин, 2004) и два учебных пособия: «Роль Morganella morganii в этиологии кишечной инфекции телят и поросят» (Л.С. Каврук, С.Н. Золотухин, В.Я. Ганюшкин, ДА. Васильев, 1998), «Смешанная кишечная инфекция телят и поросят, вызываемая патогенными энтеробактериями» (С.Н. Золотухин, Л.С. Каврук, Д.А. Васильев, 2005).
Материалы диссертационных исследований используются в учебном процессе на лекциях и лаборатоно-практических занятиях со студентами и слушателями ФПК по микробиологии, вирусологии, биотехнологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизе продуктов животноводства в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии, на факультете ветеринарной медицины и биотехнологии Оренбургского государственного аграрного университета, Кубанского государственного аграрного университета, Воронежского государственного аграрного университета им. К.Д. Глинки, Башкирского государственного аграрного университета, Алтайского государственного аграрного университета, Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева, Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины, Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана, Чувашской государственной сельскохозяйственной академии, Ивановской государственной сельскохозяйственной академии, Самарской государственной сельскохозяйственной академии, Брянской государственной сельскохозяйственной академии, Пермской государственной сельскохозяйственной академии, Ижевской государственной сельскохозяйственной академии, Вологодской государственной молочно-хозяйственной академии им. Н.М. Верещагина.
Апробация работы. Результаты основных исследований подтверждены актами комиссионных испытаний в ФГУ «ВГНКИ» (от 11.02.1999 г.; 30.05.02 г.; 23.04.04 г.; 21.02.06 г.), УГСХА (от 5.06.03 г.); актами испытаний в условиях производства, Чердаклинской районной ветеринарной лаборатории Ульяновской области (от 24.08.04г.,2005), в Сергиевской районной ветеринарной лаборатории (от 30.08.04г.) и в ЗАО «СВ-Поволжское» Самарской области.
Материалы диссертации доложены и одобрены на научно-практических конференциях: «Аграрная наука в условиях разнообразных форм общественной собственности и регионального хозрасчета», (Ульяновск, 1990) и «Экологические проблемы сельскохозяйственного производства» (Ульяновск, 1992); XII научно-практической конференции молодых ученых «Пути повышения производства и резервы повышения качества сельскохозяйственной продукции»
(Оренбург, 1993); Межгосударственных научных конференциях «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (Санкт-Петербург, 1995, 1997); Международной научной конференции «Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных» (Москва, 1996); научной конференции посвященной 50-летию Краснодарской НИВС «Состояние и перспективы развития научных исследований по профилактике и лечению болезней сельскохозяйственных животных и птиц» (Краснодар, 1996); Межгосударственных научных конференциях: «Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции» (Москва, 1995, 1997); научно-практической конференции «Проблемы экологии Ульяновской области» (Ульяновск, 1997); Международной научной конференции «Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе» (Москва, 1999); Международной научной конференции «Современные вопросы ветеринарной медицины и биологии» (Уфа, 2000); Международной научно-практической конференции (Воронеж, 2002); Всероссийской научно-производственной конференции (Ульяновск, 2003); Международном научно-практическом семинаре: «Перспективы использования препаратов бактериофага для превенции и лечения инфекций, вызываемых патогенными и условно-патогенными микроорганизмами» (Тбилиси, 2005); Международной научной конференции: «Диагностика, профилактика и лечение инфекционных болезней, общих для человека и животных» (Ульяновск 2006 г.).
Основные материалы диссертации заслушаны и одобрены на заседаниях Отделения ветеринарной медицины РАСХН (4.10.04 г. и 26.06. 06 г.), на расширенном межкафедральном совещании сотрудников факультета ветеринарной медицины ФГОУ ВПО УГСХА (31.10.2006 г.).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 303 страницах компьютерного текста и состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, описания собственных результатов исследований, обсуждения, выводов и практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 74 таблицами, 35 рисунками. Список литературы включает 354 источников.
