Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Литературный обзор 8
1.1 .Пищевой статус современного человека 8
1.2. Содержание селена в пищевых продуктах 20
1.3. Метаболизм селена в организме 33
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследований 45
2.1 Объекты исследований 45
2.2 Методы исследований 46
ГЛАВА 3 Результаты исследования и их обсуждения 57
3.1 Биотехнология обогащения пшеницы селеном 57
3.2 Изучение метаболизма селена в прорастающем зерне пшеницы ...66
3.3 Изучение изменения содержания селена при сушке пророщенной пшеницы и оценка качества селенированной муки 77
3.4 Схема технологического процесса получения БАД, оценка качества, безопасности и эффективности селенсодержащей БАД 81
3.5 Лабораторно-клинические испытания безопасности биологически активной добавки 84
3.5.1 Оценка эффективности применения БАД на лабораторных животных 85
3.5.1.Юценка наблюдения за состоянием животных 86
3.5.1.2 Результаты определения массы тела, почек(суммарно) и сердца у подопытных крыс 87
3.5.1.3Влияние БАД на показатели крови 88
3.5.1.4 Содержание селена в крови белых крыс 89
3.5.1.5 Оценка БАД по показателям перекисного окисления 89
3.5.1.6 Оценка БАД по общим клиническим показателям 90
Выводы 94
Библиографический список 95
Приложения 113
- Содержание селена в пищевых продуктах
- Изучение метаболизма селена в прорастающем зерне пшеницы
- Схема технологического процесса получения БАД, оценка качества, безопасности и эффективности селенсодержащей БАД
- Оценка БАД по общим клиническим показателям
Введение к работе
Актуальность работы. В современных условиях особую актуальность приобретают вопросы сохранения гомеостаза организма путем оптимизации рациона питания. Одной из основных проблем, которую предстоит решить, является снижение поступления с пищей ряда эссенциальных компонентов. Это, прежде всего, относится к незаменимому микроэлементу селену. В организме животного и человека могут возникнуть ряд заболеваний, связанных как с избытком, так и недостатком этого химического элемента. Поэтому при решении проблемы дефицита селена в организме важно решить две основные задачи – это, во первых, обеспечить высокую биодоступность микроэлемента и, во-вторых, обеспечить строгий контроль его поступления в организм.
В отличие от неорганических соединений селена, его органические формы не токсичны и обладают высокой степенью участия в процессах формирования физиологичного селенового статуса организма.
В этой связи создание биологически активной добавки, содержащей, органическую форму селена, представляется актуальной.
Цель работы. Создать биологически активную добавку с использованием пшеничной муки, содержащей органическую форму селена.
Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
1. Изучить процесс проращивания пшеницы с использованием раствора селенита натрия.
2. Исследовать метаболизм селена в прорастающем зерне пшеницы.
3.Разработать биотехнологию получения пшеничной муки, содержащей органическую форму селена.
4. Создать биологически активную добавку с селенированной мукой в виде драже.
5. Провести лабораторно-клинические испытания БАД с целью определения его эффективности и безопасности.
6. Разработать и утвердить нормативную документацию на производство селенсодержащей БАД.
Научная новизна. Установлена, что в процессе проращивания пшеницы, увлажненной раствором селенита натрия, накапливается органическая форма селена в виде селенметионина. На основе общей схемы метаболизма селена в различных организмах установлены особенности биохимических процессов, реализующих ключевые реакции биосинтеза его органической формы в проращиваемой пшенице. Показано, что ключевая форма селена при его метаболизме в проращиваемых зернах пшеницы – селеноводород образуется, в осовном, с участием глутатиона, восстанавливающегося в процессе проращивания пшеницы синтезируемой аскорбиновой кислотой. На основе гипотетической модели биосинтеза селенометионина при участии аспартата и результатов собственных исследований показано, что основной путь биосинтеза селенометионина при участии аспартата в проращиваемой пшенице лимитируется фосфорным эфиром альдегидной формы витамина В6 – пиридоксальфосфатом (PLP). Научно обоснована и экспериментально доказана эффективность создания БАД с использованием пшеничной муки, содержащей органическую форму селена.
Практическая значимость. Разработан биотехнологический способ получения пшеничной муки, содержащей органическую форму селена. Установлены рациональные режимы ведения биотехнологических процессов. Создана биологически активная добавка с высоким содержанием биодоступного селена, эффективность которой доказана лабораторно-клиническими испытаниями. Разработаны и утверждены технические условия на биологически активную добавку – ТУ 9199-014-12635471-06. Производство БАД организовано на предприятии ООО «Забайкальский научно-производственный центр медико-биологических и экологических исследований «Исинга».
Апробация работы. Основные результаты исследований доложены и обсуждены: в материалах различных конференций: (г. Чита, 2007 г.; г. Чита, 2008 г.; г. Улан-Удэ, 2008 г.; г. Чита, 2008 г.; г. Улан-Удэ, 2009 г.; г. Иркутск, 2009 г.; г. Улан-Удэ, 2010 г.; г. Иркутск, 2010 г., а также в журналах, рекомендованных ВАК: Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 2009, сборник научных трудов «Вестник ВСГТУ», 2009 г.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, выводов, списка использованных источников (189 наименований) и приложений. Работа изложена на 119 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 17 таблицами и 21 рисунком.
Содержание селена в пищевых продуктах
Содержание селена в продуктах питания варьирует в широких пределах и чаще всего обусловлено природно - географическими особенностями региона, поставляющего тот или иной продукт т.е. содержанием селена в почве, биодоступностью, видом продукта. Почвы ряда Европейских стран, например, Шотландии, Венгрии, Чехии, Польши, Литвы, Беларуси, Финляндии и т.д. бедны селеном и естественно выращенная на таких почвах продукция: рожь, пшеница, картофель, бобовые и любая другая продукция будет отличаться низким содержанием селена в ней. Содержание селена в пшенице, используемой для выпечки хлеба в Шотландии, колеблется от 0,28 мкг/г сухой массы пшеницы, выращенной в стране до 0,518 мкг/г для пшеницы, поступившей из Канады, 13,8 % которой также использовали для выпечки этого хлеба, такое сочетание обеспечило поступление в организм селена с хлебом около 31 мкг. Хотя рекомендуемая суточная доза селена в Шотландии для взрослых мужчин и женщин составляет 70 и 55 мкг соответственно [126]. Венгерские авторы считают, что введение в рацион хлеба, обогащенного селеном из расчета 100 мкг/ день, есть простой и быстрый метод усовершенствования селенового статуса. Употребление в течение 2-х недель селенового хлеба добровольцами, у которых средняя концентрация селена в крови была на уровне 52,5± 16,7 мкг/л, привело к увеличению содержания селена до 66,1± 11,9 мкг/л [174].
В Финляндии, почвы которой содержат мало селена, имеют низкий рН и высокое содержание железа, начиная с 1984 года, в дефицитных селеновых районах, вносили в почву минеральные удобрения с добавлением селена (в форме Na2Se04) - 16 мкг/кг удобрений - для производства пищевого зерна и 6 мг/кг удобрений в почвы - для производства фуража. Удобрение почв таким способом позволило увеличить содержание селена в злаках в 3 раза, что в конечном результате привело к увеличению концентрации селена в сыворотке крови людей на 70 %. В 1990 году внесение селена в удобрения для выращивания злаков снижено до 6 мг/кг удобрений. Необходимо признать, что дополнение удобрений селеном безопасный и эффективный метод увеличения поступления селена в организм животных и людей [123].
В некоторых районах Китая, где распространено заболевание селенозом, регистрируется высокое содержание селена в пшенице, рисе, сое (8,1; 4,0; 11,9 мкг/г, соответственно). В аналогичных продуктах, выращенных в районе болезни Кешана (с низким уровнем селена в почве), отмечается очень низкое содержание селена (в пшенице - 0,005 мкг/г, рисе - 0,007 мкг/г и сое - 0,010 мкг/г),[186] аналогичная ситуация наблюдается и с продуктами животного происхождения [143].
Содержание некоторых токсических элементов и ряда эссенциальных микроэлементов, в том числе и селена, было определено в говядине и свинине, импортируемой в Швецию из 6 различных стран. Уровень концентрации селена в этих продуктах колебался от 0,030 до 0,180 мг/кг сырой массы [157]. Содержание селена в свинине, полученной в Чехии находится на уровне 136,0-229,0 мкг/кг сырой массы [159].
Как известно, наиболее богаты селеном морепродукты, однако, наряду с эссенциальным микроэлементом селеном, морепродукты часто содержат в высоких концентрациях и тяжелые металлы, особенно ртуть. В мясе трески и камбалы содержание ртути возрастало пропорционально длине тела (0,0 -0,32 и 0,15 - 0,28 мг/кг соответственно). Содержание селена не зависело от длины тела рыбы и составляло 0,33 - 0,44 и 0,32 - 0,44 мг/кг соответственно. Концентрация селена и ртути в тканях креветок была 0,85 и 0,10 мг/кг, соответственно, в тканях моллюсков - 2,61 и 0,14 мг/кг, соответственно. Отмечено, что при повышенном содержании селена в образцах рыбы, наблюдается снижение содержание ртути в них [147]. Анализ проведенный в период с 1970 до 1993 года оценки содержания селена в рыбе, мясных продуктах, готовой пище показал, что селен содержится в убывающем порядке: дары моря коммерческая говядина свинина домашняя говядина цыплята готовая пища (стряпня) [188].
Среднее содержание селена в образцах готовой пищи из традиционной итальянской диеты варьирует от 7,0 мкг/кг сырой массы (свежие фрукты) до 226,0 мкг/кг (рыба). Особенно богаты селеном блюда, приготовленные из продуктов животного происхождения. За счет мяса и мясных продуктов до 78 % (около 50 мкг) селена в день получали итальянцы. Содержание селена в готовом рационе на уровне потребления 93,0-233,0 мкг/день удовлетворяет суточную потребность в этом элементе и не создает риска избытка или недостатка этого элемента в организме итальянца [122, 163] .
Высокие концентрации селена определены в сухих плодах, выращенных в Испании (111,8-294,6 мг/г), хотя среднесуточное потребление жителями этого региона селена составляет 15,3 мкг/ день для взрослого человека. Такое неадекватное суточное поступление селена в организм, можно объяснить низкой концентрацией селена в хлебных злаках (27,8 нг/г) [139]. Концентрация селена в различных фруктах не зависимо от места выращивания не превышает 10,0 мкг/кг, однако содержание селена в мякоти фиников, собранных в Саудовской Аравии, значительно выше и составляет 1,48 - 2,96 мкг/г [120].
Бразильские орехи - один из очень немногих потребляемых продуктов с исключительно высоким уровнем селена. Концентрация селена в орехах составляет 16-30 мкг/г массы. По биодоступности для организма селен в орехах не уступает селениту натрия и даже превосходит последний. Пищевой биопотенциал селена в орехах высок и потребление орехов может значительно повысить селеновый статус, содержание селена в крови и активность глутатионпероксидазы и тирозин-дейодиназы [154].
Изучение метаболизма селена в прорастающем зерне пшеницы
Из рисунка видно, что оптимальной температурой замочной воды является 22С, при которой достигается требуемое значение степени замачивания за 48-50 часов. При температуре 10С продолжительность процесса увеличивается более, чем на 20 часов, а при повышении температуры до 24С процесс замачивания ускорялся почти вдвое. Однако эффективность последующего проращивания уменьшалась. Вероятно, это связано с понижением интенсивности дыхания зерен ввиду понижения растворимости кислорода при высоких температурах воды. Кроме того, при повышении температуры усиливаются аэробные микробиологические процессы, также связанные с потреблением кислорода.
Также при обогащении зерна пшеницы селеном возможно задействованы системы специального транспорта: активный транспорт и облегченная диффузия. Активный транспорт селена происходит против градиента концентраций или градиента электрохимического потенциала и требует энергетических затрат, т.е. сопряжения с реакцией гидролиза аденозинтрифосфата (АТФ) [3, 71, 115].
В набухающем семени центром образования или высвобождения гиббереллинов, цитокинидов и ауксинов из связанного (конъюгированного) состояния является зародыш. Из зародыша первые порции этих гормонов, обеспечивают мобилизацию запасных белков, углеводов и др, способствуя питанию зародыша, а также стимулируют начало процессов деления и растяжения клеток в осевых органах зародыша, запуск всего ростового процесса молодого растения. Ведущая роль на этом этапе принадлежит гиббереллину. Гиббереллин вызывает в эндосперме синтез новых порций гидролитических ферментов, которые расщепляют связанные гормонально-белковые комплексы ауксинов и цитоксинов. Следствием этого являются запуск новых биохимических процессов, повышение ферментативной активности эндосперма семян (амилазы, протеазы, фосфотазы, эстеразы пероксидазы) [3, 89, 115].
Известно, что в пищевых и кормовых зерновых культурах степень преобразования селена в селен-метионин имеет значительные различия. В связи с этим следует думать, что одним из основных факторов, способствующих обогащению белков пшеницы селен-метионином, могут быть содержание и свойства его белкового компонента. Изменения компонентов зерна пшеницы в большей степени происходят при его проращивании. Процессы метаболизма селена катализируются ограниченным числом ферментов [35, 48, 63, 104]. Реакции, катализируемые ферментами при метаболизме селена, обычно разделяют на реакции 1 -ой и 2-ой фазы. Реакции 1-ой фазы — это гидролиз, восстановление и окисление. Эти реакции протекают с участием функциональных групп -ОН, -NH2, - SH и СООН. Реакции 2-ой фазы метаболизма включает глюконирование, сульфатирование, ацетилирование, метилирование, конъюгация с глутатионом и с аминокислотами. Поэтому на следующем этапе экспериментальных исследований изучали процесс проращивания пшеницы. Основным показателем глубоких биохимических изменений, происходящих в прорастающем зерне, является усиление действия ферментов, прежде всего амилолитического комплекса. При прорастании зерна активизируется и протеолитические ферменты. На первом этапе данной серии экспериментальных исследований изучили влияние концентрации селенита натрия на активность амилолитических и протеолитических ферментов.
Анализ данных, представленных на рисунках показывает, что с увеличением концентрации раствора селенита натрия в замочной воде активность амилолитических и протеолитических ферментов повышается. Однако увеличение содержания соли свыше 0,04 % активность исследуемых ферментов начинает понижаться. При концентрации раствора 0,05 % и выше активность ферментов резко понижается. Кроме того, выявлено, что раствор селенита натрия в большей степени способствует увеличению активности исследуемых ферментов, по сравнению с водой без соли. Повышение активности изучаемых ферментных комплексов зерна пшеницы, вероятно, связано с участием селена в диффузии того небольшого запаса низкомолекулярных веществ через щиток к зародышу. Также не исключается возможность участия селена в гидратации веществ зерна, в результате которой создаются благоприятные условия для процессов гидролиза высокомолекулярных соединений.
При проращивании зерна происходят глубокие изменения морфологического и биохимического характера. Эти изменения могут быть связаны, наряду с увлажнением зерна, и веществами, поступающими в него и с рН раствора селенита натрия.
Схема технологического процесса получения БАД, оценка качества, безопасности и эффективности селенсодержащей БАД
Из таблицы видно, что содержание малонового диальдегида, как одного из наиболее важных конечных продуктов перекисного окисления липидов, при использовании селенсодержащей БАД уменьшается и достигает значений обнаруженых в контрольном образце. Отмечено, что содержание МДА в печени животных, содержащихся на рационе с дефицитом селена, превышает значения данного показателя в опыте 2 более чем в 1,5 раза.
Содержание глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9) в крови животных, в рацион кормления которых вводили БАД, составило 242,56 мкмоль/мин/г, что почти в 2 раза больше, чем в крови животных контрольной группы и в 7,1 раза - в крови животных, содержавшихся на рационе с дефицитом селена. Аналогичная зависимость установлена при изучении содержания глутатионредуктазы. Из таблицы также видно, что высокий уровень глутатионредуктазы поддерживает на достаточно высоком уровне значения восстановленного глутатиона. Отмечено, что повышается суммарная антиоксидантная активность крови: почти в 5 раз по сравнению с показателями, установленными в крови животных, содержавшихся на рационе с дефицитом селена.
Таким образом доказано, что БАД с селеном угнетает перекисное окисление липидов, способствуя выработке эндогенных антиоксидантов, и предотвращает развитие окислительного стресса. Повышение общей антиоксидантной активности крови свидетельствует о высокой способности организма противостоять воздействию факторов, активизирующих свободнорадикальное окисление липидов. Клинические испытания БАД к пище проведены в стационарных условиях областной физиолого -терапевтической больницы. Программу клинических испытаний определяли с учетом особенностей химического состава и предполагаемого биологического действия исследуемого БАД на организм, применительно к тем нозологическим формам заболевания, при которых использование селенсодержащей добавки с профилактической целью представляется наиболее адекватным и перспективным. Кроме того, учитывали тип функциональных и метаболических нарушений, свойственных данной патологии. С целью получения достоверных данных о профилактическом действии селенсодержащей БАД к пище были сформированы две группы из здоровых лиц: опытная и контрольная. Группы сравнения состояли из мужчин 25-30 лет с примерно одинаковой массой тела и сходным пищевым статусом. В процессе проведения клинических испытаний контролировали органолептические свойства БАД, ее переносимость. Помимо общих клинических показателей в план исследований были включены специальные тесты, используемые при клинических испытаниях селенсодержащей БАД. Опытной группе лиц была назначена БАД в дозе 1 драже в сутки в течение 15 дней. Перед назначением и по окончании курса с использованием БАД были проведены лабораторные исследования по определению: общих показателей крови, артериального давления и в отдельных случаях — функционального состояния миокарда (ЭКГ). Как показал сравнительный анализ результатов исследований, 15 дневной курс с использованием БАД не вызывает существенных изменений изученных показателей состояния пациентов. Все исследования выполнялись в динамике, до применения БАД и после завершения курса. Для оценки переносимости апробируемого БАД применяли анкетно-опросный метод (табл. 16). Каждый показатель оценивали по 5-ти бальной системе. Как показал анализ анкет, у исследуемых лиц не отмечено аллергических проявлений и раздражающих действий БАД. Хорошее самочувствие зафиксировано у 93 % пациентов. Чувство психологического комфорта и бодрости отмечалось и через 5 дней после окончания эксперимента. Раздражающего действия БАД и аллергических реакций не отмечено.
Из таблицы видно, что после применения селенсодержащего БАД незначительно увеличивается содержание общего белка и глюкозы, существенных изменений в содержании холестерина и билирубина не отмечено. Как показывают данные таблицы, уменьшается количество аминотрансфераз. Установлено, что аспартатаминотрансфераза в случае применения селенсодержащей БАД уменьшается в большей степени. Вероятно, такая закономерность изменения АсАТ связана с состоянием миокарда, клиническая характеристика которого в большей степени зависит от селенового статуса организма. Известно, что одновременное определение активности двух аминотрансфераз сыворотки позволяет учесть их совместное влияние на организм. Поэтому весьма ценным диагностическим показателем считается коэффициент де Ритиса - отношение АсАТ к А1АТ. Данный коэффициент в наших экспериментах составил 1,29±0,24, что наиболее приближен к оптимальному значению - 1,33±0,41.
Таким образом, из результатов лабораторных и клинических испытаний следует, что селенсодержащая БАД отвечает требованиям, предъявляемым к безопасности и эффективности БАД к пище и может быть рекомендована в качестве дополнительного источника селена.
Оценка БАД по общим клиническим показателям
Большое разнообразие адаптационных неспецифических защитно-приспособительных реакций организма на раздражители различного рода крайне затрудняют оценку функциональной активности селенсодержащей БАД на системы сохранения динамического гомеостаза организма. Поэтому при выборе методических подходов к экспериментальной оценке эффективности разработанной БАД учитывали то, что эффективность данной категории БАД к пище подтверждается путем изучения динамики изменения концентрации селена в биологическом материале. Кроме того, акцентировали внимание на тех биологических эффектах, которые реализуются в организме в процессе накопления вводимого с БАД селена.
Эффективность селенсодержащей БАД изучали в соответствии со схемой, представленной на рис. 20. Животные контрольной крупы содержались на обычном кормовом рационе (овес, пшеница, ячмень и др.). Экспериментальные животные были разделены на три группы. Животные первой опытной группы кормили селенодефицитным кормом - зерно выращенное в Читинском районе с содержанием селена 28 мкг/кг. Животные второй опытной группы перевели на общевиварный рацион и перорально однократно вводили дозу 0,5 мг/кг действующего вещества -селена. С третьей опытной группой было проведено определение острого токсического эффекта. При однократном пероральном введении максимально возможной дозы действующего вещества — селена в количестве Уг от LDioo (LD для мышей — 7-8 мг/кг). За животными на протяжении всего опыта (30) суток вели наблюдение, регистрировали общее состояние, поведение и прирост массы тела. В конце опыта животных умерщвляли и подвергали патологоанатомическому исследованию, определяли массу печени, почек (суммарную) и сердца. В крови определяли общепринятыми методами количество эритроцитов и лейкоцитов. Результаты оценки показателей состояния животных (внешний вид, активность, масса тела, масса внутренних органов) представлены в табл. 10. В течение всего опыта животные контрольной группы были клинически здоровы: подвижны, шерсть гладкая, блестящая, аппетит сохранен, расстройства пищеварения не регистрировали. Патологоанатомических изменений внутренних органов не установлено. В первой опытной группе животные были вялые, в конце эксперимента зарегистрированы частичное облысение и ухудшение роста. Выявлено увеличение массы сердца. Во второй опытной группе животные были клинически здоровы: подвижны, шерсть гладкая, блестящая, аппетит сохранен, расстройства пищеварения не регистрировали. Патологоанатомических изменений внутренних органов не установлено. В третьей опытной группе у животных проявились выраженные признаки расстройства общего состояния, нарушения движения и позы, наблюдалась диарея. При скармливании драже в аггравированных дозах случаев падежа животных не отмечено. Результаты определения массы тела, почек (суммарно) и сердца у подопытных крыс отражены в таблицах 11 и 12. В первые 10 суток скармливания отмечено увеличение прироста живой массы белых крыс (опыт-2) по сравнению с контролем на 14,1 г, а у остальных групп прироста живой массы не отмечено. На основании этих данных можно сделать вывод о том, что селенодефицитный и селенонасышенный рационы кормления угнетающее влияют на физическое состояние животных.
Похожие диссертации на Исследование и разработка биотехнологического способа обогащения пшеницы селеном для создания БАД
