Содержание к диссертации
Введение
1.0. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Современное состояние проблемы получения и культивирования клеток человека и животных
1.2.Значение метода культур клеток при проведении научных исследований и в производстве препаратов для иммунопрофилактики, диагностики и лечения.
1.2.1. Применение метода культур клеток в современных исследованиях 22
1.2.2. Культуры клеток человека и животных в производстве препаратов для иммунопрофилактики 26
1.2.3. Культуры клеток для получения генно-инженерного эритропоэтина человека 29
1.2.4. Перспективы применения культур клеток для заместительной терапии 35
1.3. Анализ проблемы контроля и безопасности клеток, используемых в производстве препаратов для иммунопрофилактики, лечения или научных исследований 1.3.1. Создание коллекций культур клеток, анализ методов их контроля и паспортизации 50
1.3.2. Создание банков культур клеток и современные требования к их контролю 61
1.4. Заключение литературного обзора 66
2. Материалы и методы 71
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1. СОЗДАНИЕ И ПАСПОРТИЗАЦИЯ КОЛЛЕКЦИИ КУЛЬТУР КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ 79
3.1.1. Формирование специализированных коллекций культур клеток человека, насекомых и позвоночных животных 81
3.1.2. Паспортизация и идентификация культур клеток человека и животных 92
3.1.3. Заключение
СОЗДАНИЕ И АТТЕСТАЦИЯ БАНКОВ КУЛЬТУР КЛЕТОК ДЛЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ, ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИН И ДРУГИХ ПРЕПАРАТОВ
3.2.1. Создание и аттестация посевных и рабочих банков клеток .119
3.2.2. Перспективы применения клеток из аттестованных банков для производства и разработки новых технологий получения препаратов 135
3.2.3. Заключение 138
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ КЛЕТОК - ПРОДУЦЕНТОВ РЕКОМБИНАНТНОГО ЭРИТРОПОЭТИНА ЧЕЛОВЕКА
3.3.1. Сравнительный анализ культурально-морфологических и продуктивных свойств линий клеток- продуцентов рчЭПО 143
3.3.2. Получение и исследование экспериментальных образцов рекомбинантного эритропоэтина человека 153
3.3.3. Создание и аттестация рабочих банков культуры клеток СНО-рЕ-продуцента рчЭПО 157
3.3.4. Создание таблетированной формы лекарственного
препарата рчЭПО J^Q
3.3.4. Обсуждение полученных результатов „
ПОЛУЧЕНИЕ, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И КОНТРОЛЬ КЛЕТОК, ПРИГОДНЫХ ДЛЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ИЛИ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ
3.4.1. Выделение, культивирование и исследование первичных культур клеток из разных тканей и органов 172
3.4.2. Создание и аттестация банков первичных и диплоидных культур клеток, пригодных для проведения научных исследований или получения препаратов для заместительной терапии 3.4.3. Создание и аттестация банков культур диплоидных фибробластов человека и их аттестация
3.4.4. Выбор условий культивирования, транспортировки и поддержания клеток на ране
194
3.4.5. Эффективность применения аттестованных фибробластов при лечении ран различной этиологии 196
3.4.6. Обсуждение полученных результатов 199
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 210
5. ВЫВОДЫ 219
6. ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИКУ 222
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 224
8. ПРИЛОЖЕНИЯ 266
7.1 Каталог перевиваемых культур клеток (Титульные листы, содержание) 267
7.2 Патенты (титульные листы) 275
7.3 Выписка из проблемной комиссии НГМИ 289
7.4 Отзыв на применение культуры аллофибробластов 290
7.5 Экспериментально-производственный регламент (титул) . 291
7.6 Сертификат производства культур клеток диплоидных человека для заместительной терапии 292
7.7 ФСП «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, монослойная» (Титульный лист) 293
7.8 Акт внедрения в практику 333 Окружного военного госпиталя препарата культуры клеток 294
7.9 Акты о внедрении результатов диссертационной работы 295
- Современное состояние проблемы получения и культивирования клеток человека и животных
- Материалы и методы
- Формирование специализированных коллекций культур клеток человека, насекомых и позвоночных животных
Введение к работе
1.0. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Современное состояние проблемы получения и культивирования
клеток человека и животных , <-
1.2.Значение метода культур клеток при проведении научных исследований и в производстве препаратов для иммунопрофилактики, диагностики и лечения.
1.2.1. Применение метода культур клеток в современных
исследованиях 22
Культуры клеток человека и животных в производстве препаратов для иммунопрофилактики 26
Культуры клеток для получения генно-инженерного эритропоэтина человека 29
Перспективы применения культур клеток для заместительной терапии 35
1.3. Анализ проблемы контроля и безопасности клеток,
используемых в производстве препаратов для
иммунопрофилактики, лечения или научных исследований
1.3.1. Создание коллекций культур клеток, анализ методов их
контроля и паспортизации 50
1.3.2. Создание банков культур клеток и современные требования
к их контролю 61
1.4. Заключение литературного обзора 66
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 71
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1. СОЗДАНИЕ И ПАСПОРТИЗАЦИЯ КОЛЛЕКЦИИ КУЛЬТУР
КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ 79
3.1.1. Формирование специализированных коллекций культур
клеток человека, насекомых и позвоночных
животных 81
3.1.2. Паспортизация и идентификация культур клеток человека и
животных 92
3.1.3. Заключение ^g
СОЗДАНИЕ И АТТЕСТАЦИЯ БАНКОВ КУЛЬТУР КЛЕТОК
ДЛЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ, ПРОИЗВОДСТВА
ВАКЦИН И ДРУГИХ ПРЕПАРАТОВ {{8
3.2.1. Создание и аттестация посевных и рабочих банков
клеток . 1Q
Перспективы применения клеток из аттестованных банков для производства и разработки новых технологий получения препаратов 135
Заключение 138
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ КЛЕТОК - ПРОДУЦЕНТОВ
РЕКОМБИНАНТНОГО ЭРИТРОПОЭТИНА ЧЕЛОВЕКА {42
Сравнительный анализ культурально-морфологических и продуктивных свойств линий клеток- продуцентов рчЭПО 143
Получение и исследование экспериментальных образцов рекомбинантного эритропоэтина человека 153
Создание и аттестация рабочих банков культуры клеток СНО-рЕ-продуцента рчЭПО 157
3.3.4. Создание таблетированной формы лекарственного
препарата рчЭПО j^q
3.3.4. Обсуждение полученных результатов „
ПОЛУЧЕНИЕ, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И КОНТРОЛЬ КЛЕТОК,
ПРИГОДНЫХ ДЛЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ИЛИ
ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ {? j
3.4.1. Выделение, культивирование и исследование первичных
культур клеток из разных тканей и
172
органов
3.4.2. Создание и аттестация банков первичных и диплоидных
культур клеток, пригодных для проведения научных
исследований или получения препаратов для заместительной
терапии jgj
3.4.3. Создание и аттестация банков культур диплоидных
фибробластов человека и их аттестация 0
1о /
3.4.4. Выбор условий культивирования, транспортировки и
поддержания клеток на ране
3.4.5. Эффективность применения аттестованных фибробластов
при лечении ран различной этиологии 196
3.4.6. Обсуждение полученных результатов 199
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 210
ВЫВОДЫ 219
ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИКУ 222
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 224
ПРИЛОЖЕНИЯ 266
Каталог перевиваемых культур клеток (Титульные листы, содержание) 267
Патенты (титульные листы) 275
Выписка из проблемной комиссии НГМИ 289
Отзыв на применение культуры аллофибробластов 290
Экспериментально-производственный регламент (титул) ... 291
Сертификат производства культур клеток диплоидных человека для заместительной терапии 292
ФСП «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии, монослойная» (Титульный лист) .... 293
Акт внедрения в практику 333 Окружного военного госпиталя препарата культуры клеток 294
Акты о внедрении результатов диссертационной работы 295
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
FBS- сыворотка крови плодов коровы
FDA - Food and Drug Administration, США
БСА - бычий сывороточный альбумин
ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения
ВФС - временная фармакопейная статья
Г6ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа
ГАТ - гипоксантин, тимидин, аминоптерин
ИФА — иммуноферментный анализ
ИЦДГ - изоцитратдегидрогеназы
КОЕ-Э - колониеобразующая единица эритропоэза
ЛДГ - фермент лактатдегидрогеназа
МДГ - фермент малатдегидрогеназа
МИБП - медицинские иммунобиологические препараты
МКАТ - моноклональные антитела
МТХ - метатрексат
ПБК - посевной банк клеток
ПКАТ — поликлональные антитела
ГЩР - полимеразно-цепная реакция
РБК - рабочий банк клеток
РчЭПО - рекомбинантный эритропоэтин человека
СКРС - сыворотка крови крупного рогатого скота
ТБС- TWEEN фосфатный буфер
ФСБ - фосфатно-солевой буфер
ЦПД - цитопатогенное действие
ЭПО - эритропоэтин
ЭПР - эндоплазматический ретикулюм
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Прогресс современной биотехнологии в значительной степени обусловлен применением культивируемых in vitro клеток различного происхождения. Метод культур клеток является уникальным и вместе с тем широко применяется в настоящее время, как в практических, так и в научных исследованиях. Это обусловлено, в первую очередь, созданием адекватных питательных сред, ферментов для разделения тканей, антибиотиков, выделению факторов роста, созданию целой индустрии производства культуральной посуды и установок для выращивания клеток. Все это позволило получать не только перспективные линии клеток животных, широко использовать их в научных исследованиях, но и создавать на их основе новые современные технологии производства.
Число линий клеток постоянно растет, часто клетки внешне трудноотличимы. Они имеют сходную морфологию и ростовые свойства. Наличие нескольких линий клеток в лаборатории, особенно занимающихся получением собственных культур, создает предпосылки не только для загрязнения клеток посторонними микроорганизмами, но и контаминации клеток клетками других линий. Использование культур клеток с отсутствием идентификационных характеристик ставит под сомнение адекватность получаемых результатов. Эти данные подчеркивают чрезвычайную важность создания специализированных коллекций культур клеток и характеризации поступающих и вновь получаемых культур клеток, используемых в научных или прикладных исследованиях.
Современные питательные среды позволяют не только культивировать многие уникальные типы клеток в системе in vitro, но и производить достаточно большие количества продукта в клетках при масштабном их культивировании. Благодаря способности вирусов размножаться и вызывать цитопатогенное действие в культивируемых соматических клетках, культуры
7 клеток получили широкое распространение в проведении вирусологических
исследований и производстве вакцинных или диагностических препаратов.
Чрезвычайно важной является возможность использования клеток животных для получения генно-инженерных препаратов. Как оказалось, именно правильное гликозилирование и полноценная «сборка» полипептида ЭПО сделали культуру клеток животных перспективной для производства генно-инженерного гормона ЭПО с высокой биологической активностью in vivo. И, хотя, полученные разными группами исследователей генно-инженерные штаммы клеток секретируют достаточно высокий уровень рекомбинантного гормона, создание новых, более эффективных продуцентов ЭПО и потенциально пригодных для продукции рчЭПО в промышленных масштабах представляется целесообразным.
Стабильность производства препаратов для иммунопрофилактики, диагностики или лечения в значительной мере зависит от стабильности свойств и безопасности используемых клеток. Система создания посевного и рабочего банков клеток, аттестованных в соответствии с современными требованиями, является наиболее перспективной, актуальной и практически значимой.
Совершенно новым, уникальным и перспективным представляется направление применения клеток для заместительной терапии. Замена больного органа на «здоровый» путем трансплантации, несомненно, имеет свои преимущества, однако ограниченность в наличии жизнеспособных органов и необходимость ожидания органа иногда приводят к необратимым последствиям. В таком случае трансплантация клеток может стать альтернативным методом спасения больных как с острой недостаточностью органов (печени, почек, поджелудочной железы и др.), так и при их нарушении (ожоговые и трофические раны) или функциональных нарушениях (миодистрофия Дюшенна, болезнь Альцгеймера, паркинсонизм, инфаркт миокарда и др.).
8 Успешное применение метода трансплантации клеток показано как в
моделях на животных, так и в медицинской практике. Несомненна
эффективность метода при лечении болезней сердца, мышечных тканей или
эндокринных органов. Подтверждена высокая эффективность метода при
лечении ран различной этиологии. Широкое же применение клеток в
клинике, к сожалению, ограничено из-за проблемы выбора источника
получения клеток и проблемы получения аттестованного клеточного
материала. В связи с этим, разработка технологии выделения уникальных по
свойствам клеток, а также получение новых перспективных штаммов клеток,
пригодных для научных и медицинских исследований, представляется
актуальной, научно и практически значимой.
Техника культивирования клеток и тканей постоянно меняется, и
многие методические приемы модернизируются, одновременно с этим
совершенствуются методы контроля клеточных культур. Отсутствие
современных требований к культурам клеток для трансплантации и вместе с
тем совершенствование современных методов контроля клеток делает
целесообразным и актуальным разработку Методических указаний по
аттестации клеток, перспективных для трансплантации.
Основой получения безопасного продукта должна быть
стандартизованная и аттестованная культура клеток. Именно система
создания двухъярусного банка клеток, при котором создаются посевной и
рабочий банки клеток, является наиболее практичным подходом для
обеспечения продолжительного производства продукта. А аттестация банков
клеток в соответствии с современными требованиями, уделяя главное
внимание контролю биологической безопасности клеток и сохранению
свойств клеток при длительном культивировании, обеспечит стабильность и
безопасность производства и получаемого продукта. Чрезвычайно важными
при этом являются проверка онкогенной безопасности и подтверждение
отсутствия контаминации бактериями, грибами, микоплазмами и вирусами.
Контроль кариотипа и поиск маркерных хромосом, несомненно, позволяет
9 исключить и контаминацию клетками другой линии, что, к сожалению,
является не редким явлением при работе с разными культурами клеток.
Система банков позволяет иметь достаточный запас клеток для производства
препаратов на их основе.
Серьезным представляется факт, что не аттестованные клетки могут
быть опасными и для исследователей. Вместе с тем, адекватность
получаемых результатов и продуктов, получаемых с использованием культур
клеток, напрямую зависит от их чистоты, соответствия характеристикам и их
безопасности. Создание аттестованных в соответствии с современными
требованиями клеток является необходимым условием при проведении
исследований или разработки новых технологий, а также для обеспечения
стабильного безопасного и продолжительного производства
биотехнологических, препаратов
Таким образом, создание системы получения паспортизованных коллекций и аттестованных банков клеток, пригодных для научных исследований, разработки новых технологий, производства препаратов и лечения, является актуальным и позволит обеспечить гарантии качества, стабильности и безопасности клеток.
Цель исследования: создание системы аттестованных культур клеток, пригодных для научных исследований и производства препаратов для иммунопрофилактики, диагностики и лечения.
Задачи исследования
Создать специализированные коллекции культур клеток человека, насекомых и других животных.
Изучить условия получения новых линий клеток различного происхождения, перспективных для проведения научных исследований или производства препаратов.
10 Изучить паспортные характеристики, включая контаминацию, культур клеток, впервые полученных или поступивших в коллекцию из других источников.
Создать и аттестовать в соответствии с современными требованиями посевные и рабочие банки культур клеток, пригодных для разработки новых технологий и производства препаратов для иммунопрофилактики, диагностики и лечения.
Исследовать характеристики генно-инженерных штаммов клеток-продуцентов рекомбинантного эритропоэтина человека, создать и аттестовать банки клеток наиболее перспективного штамма клеток-продуцентов рчЭПО. Изучить возможность создания новых лекарственных форм рекомбинантного препарата
Создать и аттестовать банки культур диплоидных фибробластов человека, изучить условия культивирования, транспортировки и трансплантации клеток, пригодных для научных исследований и создания препаратов для заместительной терапии.
Изучить условия получения, культивирования и дифференцировки клеток для исследований или медицинского применения, учитывая влияние условий выделения, криоконсервации, культивирования и дифференцировки стволовых и малодифференцированных клеток из разных тканей и органов.
Разработать Методические указания по контролю первичных культур клеток, используемых для проведения научных исследований или использования в регенеративной медицине, с учетом современных требований и методов контроля.
Создать и аттестовать банки первичных малодифференцированных культур клеток для научных исследований или создания стандартных и безопасных препаратов для заместительной терапии.
Научная новизна
При нашем участии созданы и паспортизованы специализированные коллекции культур клеток человека, насекомых и других видов животных. Паспорта культур клеток оформлены и изданы в виде 4-х томов Каталога культур клеток.
Впервые отработаны условия выделения и культивирования клеток чешуекрылых насекомых и впервые в стране получены 4 новые линии клеток хлопковой, озимой и капустной совок, основных вредителей сельского и лесного хозяйства. Новые линии клеток высокочувствительны к видоспецифичным вирусам ядерного полиэдроза и пригодны для проведения научных исследований и наработки энтомопатогенных препаратов.
Показано преимущество клеток СНО-рЕ в качестве продуцента рчЭПО по сравнению с другими генно-инженерно конструированными культурами клеток СНО-23 и СНО-972. Рекомбинантный эритропоэтин, продуцируемый впервые созданными генно-инженерными клетками, по физико-химическим свойствам соответствует природному аналогу, обладает специфической активностью по стимуляции эритропоэза.
Впервые создана технология получения таблетированной формы рчЭПО, показана эритростимулирующая активность экспериментальных серий препарата при пероральном применении.
Установлено, что для получения жизнеспособных стволовых и малодифференцированных клеток из разных тканей и органов, высокоперспективных для исследований или трансплантации, важным является время доставки органа, выбор методов выделения, условий культивирования и криоконсервации клеток.
Показано, что новые штаммы диплоидных фибробластов ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 обладают стабильными свойствами, безопасны и пригодны для научных исследований и разработки новых технологий получения препаратов.
12 Впервые предлагаются способы выращивания фибробластов на специальных пленках, пористых подложках или микрононосителях, что позволяет увеличивать количество клеток, транспортировать и поддерживать функциональноактивные клетки на ранах различной этиологии. Способ транспортировки клеток в геле или на микроносителях позволяет сохранять жизнеспособность клеток в течение 5 и более дней, что актуально при доставке клеток в дальние районы и при чрезвычайных ситуациях.
Впервые создана технология получения препарата «Клеточные культуры диплоидные для заместительной терапии», высокоэффективного для лечения ожоговых и других ран. Система создания аттестованных посевных и рабочих банков фибробластов человека, впервые примененная к штаммам клеток для терапии ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2, позволяет обеспечивать стабильными по свойствам и безопасными по отсутствию контаминантов и туморогенных свойств клетками научные исследования и практическое применение при аллотрансплантации или заместительной терапии.
Предлагаемый подход к созданию и использованию клеток из аттестованных и криосохраняемых банков позволяет решать проблему дефицита донорского материала, актуальную в экстренных и чрезвычайных ситуациях.
Научная новизна и приоритет разработок диссертации защищены патентами и авторскими свидетельствами: № 1808009; № 1808010; №2182830; № 2152206; № 97108266; № 2189223; № 2142820; №2004126519; № 2004126518.
Практическая значимость
Аттестованные в соответствии с современными требованиями культуры клеток из коллекций могут быть использованы для проведения научных исследований, создания новых биотехнологий производства препаратов для иммунопрофилактики, лечения или диагностики.
13 Созданные и аттестованные посевные и рабочие банки линий клеток
МДСК, 293, 4647 и Л-68 соответствуют современным требованиям и
практически пригодны в качестве субстратов для производства вакцинных,
диагностических и лечебных препаратов.
Банки генно-инженерно конструированных клеток СНО-рЕ, характеризующихся стабильностью, безвредностью и обладающих высокой продуктивностью рчЭПО, стали основой для создания технологий получения новых лекарственных форм препарата.
Посевные и рабочие банки диплоидных фибробластов человека ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ-16-2, аттестованные в соответствии с современными требованиями ВОЗ, пригодны для научных исследований, создания новых технологий и являются основой получения стабильного препарата для заместительной терапии. Разработана технология получения препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии» для лечения ожоговых и других ран.
Технология культивирования и доставки фибробластов в геле, на подложках или микроносителях позволяет применять клетки в разных условиях с учетом дальности и длительности доставки до больного и лечения ран разной этиологии.
Подобранные в результате проведенных исследований условия
выделения малодифференцированных клеток, а также система создания
аттестованных банков первичных культур клеток могут служить основой
" получения безопасных клеток для научных исследований и регенеративной
медицины.
Впервые разработаны Методические указания «Аттестация первичных или диплоидных культур клеток, пригодных для трансплантации», включающие современные методы контроля безопасности клеток.
Создание банков, впервые полученных культур
малодифференцированных клеток, криоконсервированных и аттестованных в
14 соответствии с новыми Методическими указаниями, позволяет иметь
достаточные запасы аттестованного клеточного материала для проведения
фундаментальных исследований и заместительной терапии.
Положения, выносимые на защиту:
Создание коллекций, посевных и рабочих банков клеток, аттестованных в соответствии с современными требованиями ВОЗ, позволяет обеспечивать научные и экспериментально-производственные исследования стабильными и безопасными культурами клеток.
Стабильность характеристик и безопасность по отсутствию контаминантов и туморогенных свойств клеток линий МДСК, Л-68 и 4647 из посевных и рабочих банков позволяют рекомендовать их для применения в производстве препаратов для лечения, диагностики и иммунопрофилактики.
Изменчивость кариотипа при длительном культивировании линии клеток 293 из посевного и рабочего банков, но стабильность других характеристик и высокая продуктивная активность клеток позволяют рекомендовать культуру 293 для производства противоракового препарата «Канцеролизин».
Стабильность характеристик клеток культуры СНО-рЕ и высокая продуктивность рчЭПО по сравнению с другими линиями клеток-продуцентов СНО-23 и СНО-972 при длительном их пассировании in vitro, делают культуру клеток СНО-рЕ наиболее пригодной для наработки препарата, регулирующего эритропоэз.
Технология производства диплоидных фибробластов человека из аттестованных и криосохраняемых банков клеток позволяет обеспечивать стандартными и безопасными клетками при лечении больных с глубокими и обширными ожогами, в том числе и при чрезвычайных ситуациях.
Для получения жизнеспособных клеток из разных тканей и органов человека и животных, содержащих высокоперспективные стволовые и прогениторные клетки, необходим индивидуальный выбор способа выделения стволовых и малодифференцированных клеток, условий культивирования и криоконсервации клеток.
class1 Современное состояние проблемы получения и культивирования клеток человека и животных link1
Первые попытки культивирования кусочков ткани в виде органных культур относятся к началу прошлого века, а культивирование отдельных клеток не удавалось. Основной причиной неудач было отсутствие адекватной питательной среды. Начало успешного развития метода культивирования отдельных клеток следует отнести к 40-м годам прошлого столетия. В 1941 году W.R.Earle вывел первую перевиваемую линию мышиных клеток L, чрезвычайно широко распространенную и до настоящего времени в клональном варианте L929 (NCTC 929). Именно в это время были разработаны способы ферментативного диспергирования тканей и получения однослойных культур клеток, сконструированы первые адекватные и сравнительно доступные питательные среды.
Введение антибиотиков принципиально расширило возможность борьбы с бактериальной контаминацией. В результате исследователи смогли регулярно и с высокой эффективностью получать первичные, а затем перевиваемые клеточные культуры. Серьезным этапом развития метода стало получение из карциномы человека линии клеток HeLa, способных неопределенно долго расти in vitro и восприимчивых к большому числу различных вирусов человека.
Поворотным моментом, определившим бурное развитие и применение метода культур клеток, стало открытие J.F.Enders с сотрудниками способности вируса полиомиелита размножаться в культивируемых соматических клетках животного in vitro и обоснование производства полиовакцины в первичных культурах клеток почек обезьян. Теоретические изыскания в комплексе с практическими разработками привели к революционным изменениям в диагностике вирусных инфекций, выделении и идентификации вирусов, обусловили открытие новых таксономических групп вирусов, таких, как аденовирусы, риновирусы, и вызвали стремительное расширение состава известных групп. За полиовакциной последовала разработка других культуральных вакцин, в частности, против кори, краснухи, бешенства.
Усовершенствование методов и технологий получения и культивирования первичных и диплоидных культур привело к увеличению исследований с применением клеток [228, 343]. И практически все известные линии диплоидных и перевиваемых клеток были получены, в первую очередь, для исследования вирусов или наработки вакцинных препаратов [228]. Позднее, с развитием методов генетической инженерии, культуры клеток стали использовать для получения высокопродуктивных штаммов-продуцентов биологически активных и лекарственных препаратов [40,144].
Получение первичных, диплоидных и перевиваемых культур клеток. В настоящее время культуру клеток, потенциально, можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного. Чаще всего используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных, эмбриональный или фетальный материал. Культуры клеток могут быть первичными, диплоидными или перевиваемыми.
Первичные культуры клеток получают путем диспергирования тканей разными методами: механически измельчая ткани с помощью ножниц, гомогенизатора и т.д.; выделяя клетки с помощью ферментов, главным образом, растворов трипсина, коллазы, протеазы и т.д. Выделенные клетки выращивают в питательной среде in vitro в течение 1-3 пассажей и используют в производстве вакцин, для тестирования препаратов или типирования вирусов [67, 102, 272, 296, 343]. Наиболее часто используют первичные фибробласты эмбрионов японских перепелов либо куриные эмбриональные фибробласты [102]. В последние годы первичные культуры клеток рассматриваются как высокоперспективные для регенеративной медицины [73, 230].
При дальнейшем субкультивировании клетки могут формировать монослой, сохранять нормальный (диплоидный) набор хромосом и выдерживать субкультивирование до 50-60 пассажей. Такие культуры клеток считают диплоидными и их широко используют для производства вакцин [228, 343], получения диагностических препаратов или заместительной терапии [37, 69, 121]. Некоторые культуры клеток при длительном культивировании приобретают способность к размножению вне организма неопределенно длительное время. Полагают, что механизм происхождения перевиваемых культур клеток — результат их генетической изменчивости. Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, сохраняют, как правило, гетероплоидный набор хромосом, стабильны в условиях роста in vitro, некоторые из них обладают онкогенной активностью. Последнее свойство ограничивает их использование при производстве вакцин.
Перевиваемые линии клеток можно получить как из здоровых тканей животных, так и из опухолевых. Многие известные линии клеток человека или животных были получены из опухолевых тканей: Нер-2 (карцинома гортани человека); Hep -3 (лимфоидная карцинома человека), HeLa (раковая опухоль шейки матки женщины); или нормальных тканей человека и животных: СНО (яичники китайского хомячка), Vero, CV, 4647 (почка зеленой мартышки), ВНК (почка новорожденного хомячка); L929 (фибробласты нормальной подкожной ткани мыши), MDCK (почка щенка собаки) и другие.
Материалы и методы
Культуры клеток. В работе использовали первичные, диплоидные и перевиваемые культуры клеток человека и животных, впервые получаемые нами в рамках научных программ или поступавшие в институт из разных источников.
Культивирование клеток млекопитающих проводили при температуре 37С в питательных средах (Игла MEM, RPMI 1640, DMEM, 199 среда и т.д.) с добавлением 10% сыворотки крови животных (FBS или СКРС) в монослое или суспензии в соответствии с паспортными характеристиками клеток. Для снятия клеток со стекла применяли 0,25%-ный раствор трипсина и 0,02%-ный раствор версена в соотношении 1:1.
Культуры клеток насекомых выращивали при температуре 28С. Клетки чешуекрылых и колорадского жука культивировали в питательной среде Грейса, обогащенной 10% FBS, клетки комаров - в питательной среде с 0,5%-ным раствором гидролизата альбумина на растворе Хэнкса с добавлением 0,075г/л дрожжевого экстракта (фирмы "Serva" или "Difco"), 1 г/л сахарозы, 4 г/л глюкозы и 7-10%) СКРС или 10-15%) FBS для клеток Aedes albopictus и Aedes pseudoscutellaris.
Криоконсервация клеток. Среда для замораживания включала среду для культивирования клеток с добавлением 10% сыворотки крови животных и 10%) криопротектора (глицерин либо ДМСО). Клетки разливали по ампулам в объеме 1 мл, запаивали и маркировали. Температуру ампул снижали со скоростью 1С в минуту до температуры минус 25С, после чего ампулы помещали в криохранилище с жидким азотом для длительного хранения клеток. Восстановление клеток после хранения осуществляли по стандартной методике [3]. Количество живых клеток определяли путем подсчета клеток после окрашивания суспензии 0,04%-ным раствором трипанового синего согласно [10].
Морфологический анализ. Клетки исследовали под инвертированным микроскопом и фотографировали без дополнительной фиксации или окрашивания. Для получения окрашенных препаратов клетки выращивали на покровных стеклах, фиксировали в 70%-ном растворе этилового спирта, высушивали и окрашивали 0,01%-ным раствором акридинового оранжевого либо гематоксилин - эозином [131].
Светооптические исследования хондроцитов проводили на уровне 1-4 пассажей. Клетки фиксировали холодным метанолом, окрашивали гематоксилином и эозином; гликоген и гликопротеины выявляли постановкой ШИК-реакции по Мак-Манусу с ферментативным контролем амилазой; суммарные гликозаминогликаны (ГАГ) выявляли в реакции с альциановым синим по Стидмену [2].
Контроль контаминации бактериями и микоплазмами проводили методами микробиологического высева на тиогликолевую среду, гистохимического анализа (окраска флюорохромами Hoechst 33258, Dapi или оливомицином), электронно-микроскопически и методом ГШР-анализа согласно известным методам [3, 8, 70, 164]. Отсутствие посторонних вирусов в клетках при паспортизации подтверждали методом электронной микроскопии клеток.
Для контроля микробиологическим методом суспензию 3-4 суточных клеток, выращенных в питательной среде без антибиотика, высевали в пробирки с тиогликолевой средой и средой PPLO для микоплазм. Пробирки с тиогликолевой средой делили на 2 части и помещали в термостат при температуре 28С и 37С на 20 суток. Пробирки для контроля микоплазм выставляли при 37С в течение 3-4 недель. При выявлении подозрительных помутнений питательной среды и подозрении на рост бактерий или микоплазм проводили субпассирование образцов в свежую порцию питательной среды.
Формирование специализированных коллекций культур клеток человека, насекомых и позвоночных животных
Коллекции культур клеток для проведения вирусологических и биотехнологических исследований формировали, начиная с 1977 года. Линии клеток поступали, в первую очередь, из института цитологии и генетики СО РАН и института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН; из института молекулярной биологии (г. Киев), Киевского государственного университета, из Saint Chrisrol (Франция). Достаточно много линий клеток, поступило из фирмы "Flow" в 1983 году. Клетки из фирмы доставлялись в течение месяца, в летний период, и условия доставки не соблюдались. Поэтому часть линий приходилось восстанавливать из единичных живых клеток, доставленных в культуральном флаконе. Исследования по созданию коллекции перевиваемых линий клеток позвоночных животных были проведены под руководством Царевой А.А. и при участии коллектива специалистов, включая автора данного исследования. Создание коллекции линий клеток насекомых и коллекции диплоидных культур клеток человека были проведены под руководством и при непосредственном участии автора.
С 1978 года поступило более 300 культур клеток из разных источников. Основную часть представляли линии и сублинии клеток млекопитающих, наиболее часто используемые в вирусологических исследованиях. Это были, прежде всего, линии и сублинии клеток почек обезьян Vero, CV-1, Vero (Flow), CV-1 (Flow), BS-C-1, 6619, COS-1, COS-7, GMK AH-1, 4647; клетки человека: Hela, Hela Ohio, Hela S, АМН, Detroit, Hep, Fl, Chimp liver; NAMALVA, A-431, RH, Raji, L-41, K-562, IMR-32 и др., клетки кролика RK-13, хомячков -ВНК-21 cl.13, СНО; клетки почки собаки MDCK, клетки почки быка MDBK и многие другие.
Начиная с 1981 года, проводились работы по формированию коллекции культур клеток насекомых, как наиболее перспективных для проведения научных исследований по изучению арбовирусов (клетки комаров) или поиска высокопродуктивных штаммов клеток для получения бакуловирусных препаратов (клетки чешуекрылых). Клеточные линии насекомых собирали из разных институтов бывшего СССР, 3 линии клеток были получены из института Saint Christol (Франция). Всего в коллекцию поступило 26 линий и сублиний клеток насекомых.
Основную часть составляли культуры клеток чешуекрылых насекомых: клетки непарного, дубового и тутового шелкопрядов. Культуры клеток дубового шелкопряда и колорадского жука, представлявшиеся как интересный объект для исследования вирусов насекомых, были получены от автора из института Молекулярной биологии (г. Киев, Украина) и Киевского государственного университета. Отряд двукрылых был представлен 4 линиями клеток комаров 3 видов: Aedes aegypti, Aedes albopictus и Aedes pseudoscutellaris.
Помимо известных линий клеток, поступивших извне, коллекция пополнялась за счет новых первичных, диплоидных и перевиваемых культур клеток человека, животных и насекомых, полученных в рамках данного исследования.
Создание коллекции культур диплоидных фибробластов человека. Исследования по выделению и характеризации культур диплоидных фибробластов проведены при активном участии Юрченко Н.Д. и Шумаковой О.В. Для выделения фибробластов было исследовано более 50 образцов ткани, полученных от взрослого человека или 8-20 недельных плодов человека, абортированных по медицинским показаниям. Кусочки тканей взрослого человека поступали от ожоговых больных для получения клеток и последующей аутотрансплантации. Суспензию первичных клеток получали методами механической и ферментативной дезагрегации с использованием разных растворов ферментов трипсина и коллазы, меняя время воздействия ферментов на ткани [17]. После выделения суспензию клеток разводили питательной средой до концентрации (2-5) х105 клеток в 1 мл и культивировали при температуре 37С.
Похожие диссертации на Создание аттестованных коллекций и банков культур клеток для научных исследований, производства препаратов и лечения
