Содержание к диссертации
Введение
1 Введение
1.1 Актуальность темы
1.2 Цель и задачи исследований
1.3 Научная новизна
1.4 Практическая ценность
1.5 Апробация полученных результатов 1.6 Публикации
1.7 Объем и структура диссертации
2 Обзор литературы
2.1 Историческая справка
2.2 Специфическая профилактика ящура
2.3 Способы получения вирусного сырья при производстве противоящурных вакцин
2.4 Методы оценки противоящурных препаратов
2.5 Разработка технологической документации на предприятиях биологической промышленности
3 Собственные исследования
3.1 Материалы и методы
3.2 Результаты исследований
3.2.1 Изменение показателя инфекционной активности вируса ящура при адаптации к культуре клеток почки свиньи
3.2.2 Сравнительная оценка антигенной активности вируса ящура, репродуцированного в эксплантантах эпителия языка крупного рогатого скота и перевиваемой культуры клеток ВНК-21/13-02
3.2.3 Сравнительная оценка иммуногенной активности вакцин, изготовленных из инактивированного вируса ящура, репродуцированного в эксплантантах эпителия языка крупного рогатого скота и перевиваемой культуре клеток ВНК-21/13-02
3.2.4 Изменение показателя иммуногенной активности вакцины в зависимости от вирулентности контрольного вируса ящура
3.2.5 Разработка технологической документации 76
производства противоящурной вакцины
4 Обсуждение полученных результатов 83
5 Выводы 87
6 Практические предложения 89 Список литературы
- Апробация полученных результатов
- Разработка технологической документации на предприятиях биологической промышленности
- Изменение показателя инфекционной активности вируса ящура при адаптации к культуре клеток почки свиньи
- Изменение показателя иммуногенной активности вакцины в зависимости от вирулентности контрольного вируса ящура
Введение к работе
Актуальность проблемы. Ящур – остро протекающая высококонтагиозная вирусная болезнь домашних и диких парнокопытных животных, характеризующаяся лихорадкой и афтозными поражениями слизистой оболочки ротовой полости, бесшерстных участков кожи головы, вымени, венчика, межкопытцевой щели и сопровождающаяся нарушением движения; у молодых животных поражением миокарда и скелетных мышц (А.Н. Бурдов, А.И. Дудников, П.В. Малярец, 1990, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Е.А. Непоклонов, Е.С. Воронин, 2006).
Проблемы профилактики и борьбы с ящуром животных, снижения ущерба от его эпизоотий, способных вызывать чрезвычайные ситуации в животноводстве с тяжелыми социально-экономическими последствиями, актуальны для многих государств мира, в том числе и для России.
В разработку средств и методов борьбы с ящуром большой вклад внесли сотрудники ВНИИЗЖ, ВНИТИБП, ФГУП «Щёлковский биокомбинат» (А.И. Дудников, В.М. Захаров, В.В. Борисов, А.М. Рахманов, А.И. Собко, А.А. Сюсюкин, Е.Л. Салажов, А.З. Равилов, В.П. Онуфриев, А.А. Гусев, В.В. Михалишин, К.Н. Груздев, В.В. Соболев, А.Я. Самуйленко, В.И. Еремец, Н.Д. Скичко, Н.И. Зенов).
Эпизоотическая ситуация по ящуру в мире продолжает оставаться довольно напряженной. Россия с 1989 года благополучна по ящуру. Однако в 1991, 1993, 1995, 2000, 2005 годы регистрировали по 1, а в 2006 - 2 неблагополучных пункта – результат заноса вируса ящура из-за рубежа. В 2000 году ящур в России был обусловлен паназиатским штаммом тип О, который являлся антигенно измененным по сравнения с ранее выделенными и используемыми при производстве противоящурных вакцин. В 2005 году - эпизоотия ящура типа Азия-1 в Китае, занос его в Монголию и Россию (Амурская область, Хабаровский и Приморский край). 2006 - два очага ящура типа Азия-1 на границе с Китаем возникли в России (в Читинской и Амурской областях). В 2007 году 1 очаг в Западноказахстанской области, граничащей с Россией. В 2009 году – очаг в Китае, но за счет проведенных мер в Забайкальской области распространения вспышки в Россию не произошло (В.М. Захаров, Д.Г. Мусиев 2005, А.И. Дудников, 2006, К.Н. Груздев, В.М. Захаров, А.М. Рахманов, 2006 В.В. Борисов, А.М. Рахманов, 2009).
По южным границам РФ создана буферная зона, где ежегодно вакцинируют восприимчивое поголовье. В Московской и Владимирской областях также вакцинируют животных, так как на территории этих областей располагаются научно-исследовательские и биологические предприятия, работающие с вирусом ящура (А.А. Гусев, В.М. Захаров, А.И. Дудников, 1987).
На ФГУП «Щёлковский биокомбинат» с 1976 года ведется производство вакцин против ящура, сырьем для которых служил эпителий языка крупного рогатого скота. В 1990-е годы произошло уменьшение поголовья скота, разрыв экономических и политических связей между регионами, вследствие чего получение эпителиального сырья было затруднено, в связи с чем промышленное получение сырья переведено на метод суспензионного культивирования вируса в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 (В.И. Еремец, Н.Д. Скичко, Н.И. Зенов, 1999). Однако в научной литературе отсутствуют сравнительные данные об антигенности и иммуногенности вируса ящура, выращенного в различных культурах клеток.
Для дальнейшего повышения эффективности промышленного производства противоящурных вакцин необходимо внести изменения в технологию с учетом использования ранее накопленного опыта и аналитического научно-исследовательского материала (В.В. Соболев, 1981, А.Я. Самуйленко, 1982, В.И. Еремец, 1989, Н.Д. Скичко, 1990 и др.).
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы исследовать показатели вирулентности, антигенности, иммуногенности вируса ящура, репродуцированного в культурах клеток и в организме животных при промышленном производстве вакцин.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
-
Изучить вирулентность вируса ящура при пассировании в культуре клеток почек свиньи;
-
Изучить вирулентность вируса ящура на морских свинках;
-
Изучить антигенность вируса ящура, репродуцированного в эксплантантах эпителия языка крупного рогатого скота и перевиваемой культуре клеток ВНК-21/13-02;
-
Изучить иммуногенность противоящурной вакцины, полученной из вируса, репродуцированного в эксплантантах эпителия языка крупного рогатого скота и перевиваемой культуре клеток ВНК-21/13-02;
-
Оценить показатель иммуногенности вакцины в зависимости от вирулентности вируса ящура.
-
Разработать промышленную технологическую документацию производства.
Научная новизна. Впервые изучена в сравнительном аспекте антигенность, вирулентность и иммуногенность вируса ящура тип А и тип О, полученного при промышленном культивировании в эксплантантах эпителия языка крупного рогатого скота и в перевиваемой культуре клеток ВНК-21/13-02.
Впервые в условиях производства проведены исследования биологических показателей вируса ящура тип О1 (1734/Приморский/2000).
Впервые получены данные по изменению вирулентности и иммуногенности вируса при непрерывном пассировании в организме животных (ЦПД клеток с 48-66 часов до 4-х часов к 100-му пассажу и накопление в сыворотке крови с 102 ТЦД 50/мл до 108 и существенному при этом снижению показателя иммуногенности вакцины с 60 до 0 ИмД50), которые могут быть использованы при прогнозировании эпизоотической ситуации и эффективности вакцин в XXI веке.
Практическая значимость. Результаты проведенных исследований позволяют эффективно использовать накопленный опыт и разработать технологическую документацию промышленного изготовления вакцин против ящура с учетом требований GMP, позволяющую выпускать безопасную продукцию со стабильными показателями качества.
Апробация полученных результатов. Основные положения диссертации доложены: на международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности 9-10 декабря 2009 года.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения и список литературы. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 4рисунками. Список литературы содержит 291 источник, в том числе 150 иностранных.
Апробация полученных результатов
В комплексе противоящурных мероприятий основное место отводится вакцинации, обеспечивающей стадный иммунитет в популяции восприимчивых животных [22, 27, 141]. Вакцины против ящура можно разделить на 4 группы: вакцины, содержащие активный вирус; вакцины из ослабленного вируса; вакцины из инактивированного вируса; адсорбат-вакцины.
Леффлер и Фрош (Loffler, Frosch) [213] произвели фильтрацию лимфы ящурных афт через пастеровские свечи, не пропускающие бактерий (1897/1898). Они пришли к убеждению, что данный инфекционный возбудитель должен быть значительно меньше бактерий. Вскоре были начаты опыты экспериментального заражения.
Оба указанные автора рекомендовали в 1895 году для прививок против ящура препарат Серафтин (Seraphtin). Производилась симультантная инокуляция вирусной лимфы и иммунной сыворотки от крупного рогатого скота, а затем еще раз одна вирусная лимфа.
Однако такой метод прививок оказался опасным. Все методы, разработанные на такой основе, с использованием вирусной крови или лимфы при любом виде применения - внутрикожно, подкожно, в вымя, в трахею, интраперитонеально и пр. дали отрицательный результат. Нередко имели место случаи поствакцинального заражения; часто иммунитета не развивалось.
В годы с 1930 по 1932 появилось несколько работ Галеа (Galea). Этот исследователь посредством прибавления сапонина к вирусной суспензии создавал образование местного воспалительного очага в месте инъекции. Он считал, что таким образом предупреждается попадание вируса в кровоток. Подобный принцип в течение нескольких лет применялся с успехом при прививках против сибирской язвы. Но иммунитета против ящура не получалось. Тогда Галеа приготовил суспензию из вируса с парафиновым маслом и ввел ее подкожно. Имело место поствакцинальное заражение, хотя и после удлиненного инкубационного периода [196].
После того, как в 1935 году Френкелю и Ван Ваверену (Frenkel, van Waveren) удалось достичь культивирования ящурного вируса в присутствии кожи плода (эмбриона теленка), они стали надеяться, что такого рода культуральные пассажи приведут вирус ящура к такому состоянию, что он будет создавать иммунитет, не вызывая болезненных явлений. В 1938 году эти авторы сообщили о проведении большого числа опытов с культуральным вирусом на крупном рогатом скоте, использования его в отдельности или в комбинации с сывороткой реконвалесцентов. Результат неизменно выражался в образовании первичной афты и в последующей генерализации (инфекции) со сравнительно безвредным течением. В дальнейшем развивался прочный иммунитет. Однако вирус все же не приобретал в результате многочисленных культуральных пассажей желательных изменений[193].
Вторая группа включает вакцины, приготовленные из вируса, подвергнутого изменению посредством физического, химического или биологического воздействия, и утратившего инфекционную активность. Пытались достичь такой цели посредством нагревания крови или лимфы, содержащей вирус, в течение определенного периода до той или иной температуры. Ру, Валлэ и Каррэ (Roux, Valle, Carre) приготовили вакцину из вирусной крови, подвергнутой действию температур порядка 22С. Доза в 100-300 см3 желательного действия не оказывала. И здесь, как и при других экспериментах, оказалось, что решающее значение с точки зрения развития иммунитета имеет количество исходного материала.
Из химических средств для обработки вируса применяли раствор Люголя, карболовую кислоту, раствор квасцов. Линьер, исходя из принципов Леффелера и Фроша, в 1910 году предложил прививку ослабленным вирусом в сочетании с сывороткой реконвалесцентов внутривенно [213].
Оказание биологического воздействия производилось в форме многочисленных пассажей на свиньях, морских свинках и телятах. Однако вирус после 1800 пассажей на морских свинках все еще был способен вызывать у крупного рогатого скота заболевание ящуром, но без создания иммунитета [251].
Третья группа вакцин содержит полностью инактивированный вирус. Многие авторы пришли к мысли относительно использования формалина для инактивации вируса. Галеа пытался достичь инактивации вируса прибавлением 1 % хлороформа и последующего оставления материала при определенной температуре. Такая вакцина предназначалась для внутрикожного применения. Она действительно обеспечивала морским свинкам известный иммунитет, но у крупного рогатого скота результаты оказались недостаточными и иммунитет быстро проходящим.
В Римсовском (Riems) институте, согласно сообщению Вальдмана на Международном ветеринарном конгрессе в 1930 году, было также проведено много опытов с инактивированным вирусом [290].
Все перечисленные выше физические, химические и биологические методы воздействия, направленные на инактивацию вируса, исходят из той предпосылки, что вирус следует убить при возможном сохранении его антигенных свойств [198, 199, 202].
В 1936 году Вальдманом и Кобе (Kobe) была изготовлена первая формоладсорбат-ващина с гелем гидроокиси алюминия (ГОА) по подобию вакцины против чумы птиц и дифтерийной вакцины. Результаты оказались положительными на крупном рогатом скоте, но иногда вирусный адсорбат был инфекционным. Виллэ, Вальдман и Кобе были усилены работы по изысканию параметров процесса инактивации вируса (концентрация формальдегида, температура, рН, время инактивации и др.) с применением в качестве адъюванта сапонина формоладсорбатсапониновые вакцины применяются и по настоящее время [290].
Для профилактики ящура практическое применение нашли инактивированные вакцины. В 30-е годы были разработаны противоящурные ГОА-формолвакцины из афтозного вируса [289], в 40-е годы - вакцины из вируса, выращенного в эксплантатах эпителия языка крупного рогатого скота [189], а в 60-е годы - из вируса, выращенного в суспензии перевиваемой линии клеток ВНК-21 [233].
В настоящее время производятся противоящурные сорбированные (гель ГОА и сапонин) и эмульсионные (масляный адъювант) моно- и поливалентные вакцины из вируса, выращенного в суспензии перевиваемой линии клеток ВНК-21 и инактивированного азиридинами (этиленимин, аминоэтилэтиленимин и др.) [22, 65].
Разработка технологической документации на предприятиях биологической промышленности
Афтозную ткань измельчали в фосфатном буфере рН=7,6. На 1г афтозной ткани добавляли 9 мл фосфатного буфера и гомогенизировали с помощью гомогенизатора «Тюракс». Гомогенизированную ткань центрифугировали при +4С в течение 10 минут при 2500 об/мин, надосадочную жидкость сливали и ее обрабатывали хлороформом (5% от количества суспензии). В результате повторного центрифугирования получали прозрачную вируссодержащую надосадочную жидкость, которую использовали для инокуляции культуры клеток, а также для заражения крупного рогатого скота и адаптации к организму морских свинок. Указанную вируссодержащую жидкость использовали для получения первого пассажа. По 1 мл заливали в пробирки с клеточной культурой почек свиней в монослое, откуда предварительно декантировали культуральную жидкость. Барабан с пробирками ставили в термостат «Бекато» при +37С для вируса ящура типа О на 18-20 часов, для типа А - 17-25 часов и через это время отбирали пробирки с 70-90% ЦПД50, которые ставили в холодильник и хранили несколько часов при температуре - 30С. Затем оттаивали, сливали и центрифугировали при +4С в течение 15 минут при 2500 об/мин.
Второй пассаж на культуре клеток почек свиней в монослое проводили следующим образом: разводили 1/100 или 1/1000 надосадочную жидкость после центрифугирования средой Эрла с лактальбумином и 1% телячьей сыворотки и культивировали в термостате при температуре +37С (типа О на 18-20 часов, для типа А - 17-25 часов) и через определенное время матрацы просматривали на ЦПД5о. В работе использовали вирус из матрацев с 75-100% ЦПД50.
После замораживания при температуре -30С и оттаивания вирус центрифугировали при +4С в течение 30 минут при 2500 об/мин. Надосадочную жидкость смешивали в соотношении 2:1 с буфером Ван-Бекума, фильтровали через миллипоровские фильтры 0,22 мкм. После фильтрации вирус расфасовали и лиофилизировали. 3.1.7.2 Вирус ящура, выращенный по методу Френкеля в промышленных реакторах.
Эпителий языка крупного рогатого скота получали непосредственно на мясокомбинатах согласно технологической инструкции.
В стерильный реактор через люк загружали эпителий вместе с транспортной средой. Включали мешалку, перемешивали эпителий в течение 10 минут, затем среду для транспортировки сливали через отстойник в канализацию. Затем эпителий промывали свежей средой 144 из расчета 5л среды на 1кг эпителия. Как только эпителий начинал всплывать в жидкости, включали перемешивание и продолжали заполнять реактор средой 144. Перемешивали 10 минут, после чего среду 144 сливают в канализацию. Реактор заполняли средой 141 из расчета 7-8л среды на 1кг эпителия и вносили через люк суспензию матриксного вируса в количестве 25 % от массы эпителия.
Закрывали люк реактора, включали системы перемешивания и нагрева и подачу кислорода. Расход кислорода зависит от количества загруженного эпителия и составляет 10-35 л/мин при давлении перед входом в реактор 0,3-0,5 атм.
Продолжительность культивирования 16-20 часов при температуре 37±0,5 С. По истечении срока культивирования отключали системы подогрева и перемешивания, закрывали подачу кислорода и брали пробу около 300 мл. Из взятой пробы отбирали пипеткой не менее 5 мл на бакконтроль, 50-60 мл на определение рН, остальную жидкость центрифугировали при 1800 об/мин, в течение 15 мин. Затем стерильно разливали по флаконам и передавали для контролей инфекционного титра на культуре клеток СП, на титрование в РСК.
После взятия пробы доводили давление воздуха в реакторе до 0,2 атм и перекачивали культуральную жидкость через теплообменник, в котором она охлаждалась до 12-15С. Охлажденную культуральную жидкость центрифугировали при 3000 об/мин и по трубопроводу передавали в смеситель, в который предварительно добавляли 20% раствор антивспенивателя из расчета 0,25 мл на 1л вирусной суспензии. После перекачивания культуральной жидкости туда же добавляли хлороформ из расчета 8 мл на 1л и перемешивают в течение 1-2 часов. По окончании перемешивания суспензия отстаивалась в течение 1,5-2 часов, после чего сепарировалась.
На всех стадиях брали пробы около 300 мл для контроля стерильности, рН, для серологических исследований, определения инфекционного титра и содержания белка.
Вирус ящура, адаптированный к организму морских свинок Для адаптации штамма брали афтозную вируссодержащую ткань крупного рогатого скота, готовили из нее суспензию 1:10 и вводили интраплантарно в обе задние лапки по 0,4-0,5 мл. Через 1-2 суток собирали афты, готовили из нее вирусную суспензию и проводили последующие пассажи. Вирус считали адаптированным, если генерация заболевания наблюдалась у всех животных по истечении 48 часов после заражения. Адаптированные штаммы вируса ящура типа А получали на 7 пассаже, О -на 7-8 пассаже. Афтозную вируссодержащую ткань измельчали (на 1г ткани добавляли 4 мл среды Ван-Бекума), гомогенизировали, центрифугировали в при +4С в течение 10 минут при 2900 об/мин. Надосадочную жидкость собирали, расфасовывали по 1 мл и хранили при температуре -70С.
Вирус ящура, выращенный суспензионным способом на перевиваемой культуре клеток ВНК-21/13-02. Культивирование осуществляли в реакторе конструкции типа КМ-500 в объеме 350-500л. В реактор с питательной средой, прогретой до температуры 36,5±0,5С, перекачивают суспензию клеток из КМ-250, вносят пеногаситель. По истечении 2 ч после посева клеток в реактор отбирают пробу для измерения рН, концентрации клеток, контроля стерильности и подают через барбатер для аэрации культуры.
Изменение показателя инфекционной активности вируса ящура при адаптации к культуре клеток почки свиньи
Эпизоотическая ситуация по ящуру в мире остается довольно напряженной, в том числе и в сопредельных с Россией, и в приграничных государствах. В современных условиях она диктует каждой из стран необходимость разработки, совершенствования и осуществления эффективных мер по профилактике и борьбе с этим опасным заболеванием [6, 42].
В СССР до 1960-х годов для профилактики ящура на биофабриках готовили ограниченное количество вакцины ВИЭВ из афтозного вируса. Для получения вируса крупный рогатый скот заражали непосредственно на мясокомбинатах, которые становились крупными очагами инфекции, при этом обесценивались продукты убоя, получаемые от продуцентов вируса ящура. Поскольку этот метод имел тяжелые экономические последствия, было принято решение о его запрещении [4, 59, 86, 87].
В дальнейшем на предприятиях биологической промышленности изготавливалась ГОА формолвакцина из лапинизированного вируса с добавлением сапонина в качестве адъюванта [7, 112, 244]. Для выращивания вируса ящура были испытаны эксплантанты различных тканей коров, овец и свиней [52, 54, 253].
В 1947 году H.S. Frenkel [187], основываясь на результатах собственных исследований, открыл элективную для вируса ящура тканевую систему, которой оказалась эпителиальная ткань языка крупного рогатого скота. Эта находка предопределила будущее предложенного им метода культивирования вируса ящура, который получил широкое применение и всеобщее признание. При культивировании вируса ящура по методу Френкеля используют эпителиальную ткань языка, полученную на мясокомбинате. Ткань в охлажденном солевом растворе доставляют в специализированные учреждения, производящие вакцину.
В дальнейшем [188, 189] была разработана промышленная технология выращивания вируса ящура в реакторах большой емкости (200 84 600л). В культуральные сосуды одновременно помещали питательную среду, вирусную суспензию и эпителиальную ткань (в соотношении 10:1:1). Выращивание вируса производили при непрерывном перемешивании и аэрации культуры. Полученные данным способом противоящурные вакцины отличались высокой иммуногенностыо.
Однако, в связи с трудностями получения эпителия языка крупного рогатого скота непосредственно с мясокомбинатов, возникла необходимость изменения технологии промышленного способа изготовления противоящурной вакцины.
Внимание многих исследователей было обращено на разработку методов массового выращивания клеток ВНК-21 ввиду их высокой чувствительности ко многим вирусам и высокой потенции роста [7, 126, 231]. Возможность автоматического регулирования рН, аэрации, температуры, а также усовершенствования питательных сред создавали предпосылки для глубинного культивирования клеток ВНК в реакторах большой емкости. Суспензионные культуры являются наиболее перспективными в решении практических проблем, связанных с получением вирусных материалов [26, 38, 57]. При благоприятных условиях клетки в суспензии дают более высокий урожай, чем в стационарных условиях. Однако для эффективного размножения вирусов в клеточных суспензиях необходимо использовать клеточные линии, предварительно адаптированные к росту во взвеси. В клетках, переведенных с монослоя, выход вируса может значительно снижаться [7]. По данным многих исследователей, не все штаммы вируса ящура легко адаптируются к клеткам ВНК-21. Перед тем, как приступить к изготовлению противоящурных вакцин, прежде всего необходимо определиться с выбором вакцинных штаммов, учитывая их доминантность и эпизоотическую ящурную обстановку в районах страны; своевременно менять вакцинный штамм на более перспективный.
Основными критериями для оценки качества вируса, используемого для изготовления вакцин, служат показатели его инфекционной активности, антигенности в РСК и иммуногенности по содержанию 146S антигена [5, 119, 129]. Известно, что эти показатели зависят от биологической системы культивирования вируса [120, 125, 128]. По антигенной активности вирус, полученный на культуре клеток ВНК-21/13-02 по данным Н.С. Масловой, А.И. Собко, А.А. Сюсюкина, 1967, А.А. Сюсюкина и сотр., 1967, 1968, Ю.Ф. Швецова и сотр., 1968 превосходит вирус, размноженный в культуре клеток СП [64, 114, 121, 122, 123, 140]. Гендерсон (1949), Убертини (1956), Ю.В. Поляков (1974) отмечали, что антигенность вируса репродуцированного по методу Френкеля была ниже [83, 205, 280].
В результате проведенной нами сравнительной оценке антигенной и иммуногенной активности вируса ящура, тип А и О, репродуцированных на эксплантантах эпителия языка крупного рогатого скота и первично-перевиваемой культуре клеток ВНК-21/13-02, существенных отличий не установлено, что свидетельствует о том, что при внесении изменений в промышленный способ получения вирусного сырья при изготовлении противоящурных вакцин, основные показатели качества препаратов будут соответствовать требованиям существующей нормативной документации.
С учетом требований Правил GMP [13] производственные процессы должны осуществляться согласно ясно определенным способам для того, чтобы обеспечить получение продуктов, обладающих требуемым качеством и соответствующих характеристикам, заложенным в разрешении на изготовление и в соответствующую регистрационную документацию. Любая работа с материалами и продуктами должна осуществляться в соответствии с зафиксированными в письменной форме способами. Каждое предприятие должно разработать комплект документов, регламентирующих производственную деятельность в соответствии с его профилем, основываясь на своем опыте, требованиях, потребностях и специфике деятельности [14].
Документирование технологических процессов и вызванное им продумывание организации производства и сути производственных процессов дает возможность вскрыть и реализовать потенциалы улучшений, которые без давления, вызванного необходимостью введения новой системы документирования, в повседневной жизни не осуществились бы [105]. Полученное осознание потенциала улучшений позволяет разработать программу совершенствования и оптимизации технологических процессов с целью обеспечения стабильности производства и повышения качества выпускаемой продукции при сокращении экономических, ресурсных и трудовых затрат.
Полученные результаты исследований позволяют с высокой достоверностью использовать ранее накопленный опыт для повышения эффективности промышленного производства противоящурных вакцин с использованием культуры клеток ВНК-21/13-02 и сделать прогноз эпизоотической ситуации и эффективности вакцин в XXI веке.
Нами получены достоверные данные, свидетельствующие о том, что при непрерывном пассировании вируса повышается существенно его вирулентность как в культуре клеток, так и в организме животных. При этом приведены доказательства уменьшения эффективности вакцин при заражении вакцинированных животных более вирулентным вирусом.
Динамика увеличения численности Земли, научно-технический прогресс увеличивает возможность непрерывного пассирования вирусов, что делает возможность прогнозировать эпизоотическую ситуацию и эффективность вакцин в XXI веке. Наши данные показывают не только на необходимость повышения эффективности вакцинопрофилактики в XXI веке (Б.Ф. Семенов, В.В. Зверев, P.M. Хаитов, 2009), но и воздействовать на все звенья эпизоотической цепи [98].
Изменение показателя иммуногенной активности вакцины в зависимости от вирулентности контрольного вируса ящура
В РН иммуногенная активность вируса ящура, репродуцированного в эксплантантах эпителия языка крупного рогатого скота, тип А, выявлялась в титре 1,75±0,12 (п=4), тип О -1,72±0,15 (п=8). Иммуногенная активность вируса ящура, репродуцированного перевиваемой культуре клеток ВНК-21/13-02 тип А- 1,73±0,16 (п=10), тип О- 1,71±0,13 (п=4). Таблица 8
Сравнительная оценка общей активности вакцинированного крупного рогатого скота биопрепаратом из вируса ящура тип А и О, репродуцированного в эксплантантах эпителия языка крупного рогатого скота и в перевиваемой культуре клеток ВНК-21/13- Тип вируса ящура Культуры клеток КоличествоИмД5о/ см3 п
Количество імДбо вируса ящура , репродуцирование го в эксплантантах эпителия языка крупного рогатого скота, тип А, было равно 21 ± 1 в см3 (п=4); тип О - 24±1 в см3 (п=8). Количество ИмД5о вируса ящура, репродуцированного перевиваемой культуре клеток ВНК-21/13-02 тип А -22±2 в см3 (п=10); тип О - 23±1 в см3 (п=4).
Все испытуемые препараты были безвредны и авирулентны.
Как показали результаты исследований иммуногенной активности вируса ящура показатели тип А и О, репродуцированного в эксплантантах эпителия языка крупного рогатого скота и в перевиваемой культуре клеток ВНК-21/13-02, выявленная в РН, практически не отличались.
Аналогичные результаты получены при определении ИмД5о 70 3.2.4 Изменение показателя ііммуногенной активности вакцины в зависимости от вирулентности контрольного вируса ящура
Иммуногенная активность биологических препаратов — это способность антигенов вызывать иммунный ответ и создавать иммунитет, обеспечивающий защиту организма от проникновения вызвавших иммунный ответ антигенов (Е.С. Воронин, A.M. Петров, М.М.Серых, Д.А. Девришов, 2002). [43]
Иммуногенная активность является одним из показателей качества вакцины, которая во многом зависит от вирулентности вируса. При контроле иммуногенности вакцины против ящура на животных используется стандартная инфекционная активность вируса - 104 ИД5о в объеме 0,1 мл [95]. На примере вируса ящура изучено влияние непрерывных пассажей вируса на его вирулентность и устойчивость вакцинированных животных к возбудителю разной степени вирулентности.
При контроле иммуногенности вакцины против ящура на животных используется стандартная инфекционная активность вируса - 10 ИД5о в объеме 0,1 мл.
В работе использовали питательную среду Эрла с гидролизатом лактальбумина без сыворотки с рН 7,1 -7,3; пробирки со сплошным монослоем клеток почек свиней (ПС); вакцину против ящура серийного производства; вирус ящура, тип Опз-ь беспородных 4-5-месячных морских свинок массой тела 450-500г (клинически здоровые самцы и небеременные самки).
Вакцину разводили буферным раствором с рН 8,5 непосредственно перед введением. Для определения иммуногенности моновалентной вакцины использовали 40 животных, из которых 8 являлись контрольными. Вакцину вводили в объеме 2 см3 в область правого и левого бедра по 1 см3. Не вакцинированные группы морских свинок использовали для контрольного заражения соответствующим типом вируса ящура.
За животными наблюдали 10 дней. Спустя 10 дней всех привитых и не привитых морских свинок заражали адаптированным к ним вирусом ящура, аналогичным производственному. Предварительно вирус адаптировали до 100-го пассажа к данным животным. Суспензию вируса вводили морским свинкам внутрикожно в плантарную поверхность правой задней лапки в 4-5 точек 104 ИД50 в объеме 0,1 мл.
Через 24 ч после инфицирования у морских свинок брали кровь для определения титра вируса. На каждое его разведение использовали по 6 пробирок с культурой клеток, в которые вносили по 1 мл разведенного вируса. Окончательный учет результатов производили через 72 часа после заражения культуры.
Результаты первый раз проверяли через 5 дней, второй - спустя 7 дней. Учет результатов заражения проводили через 3, 5 и 7 суток и оценивали по генерализации ящурного процесса на передних и одной задней лапках. Генерализацией считали образование вторичных афт хотя бы на одной лапке, в которую не вводили вирус. Иммуногеннуго активность ИмДзо МС и ИД5о вычисляли по методу Кербера. Инфекционная активность ИД50/ОД мл афтозного вируса морских свинок, определенная на морских свинках составляла на 8-м пассаже 105
