Введение к работе
1.
1.1. Актуальность темы. Птицеводство в Российской Федерации (РФ) является наиболее развитой и наукоемкой отраслью сельскохозяйственного производства, в состав которой входят промышленные, фермерские и лично-подсобные хозяйства (Фисинин В.И., 2008, 2009).
В птицеводстве существует реальная угроза заболевания птиц ньюкаслской болезнью (НБ), что заставляет промышленные предприятия вакцинировать все поголовье куриных против этой инфекции (Бакулов И.А., 2008; Джавадов Э. Д., 2008). Частные хозяйства в непосредственной близости от промышленных предприятий усугубляют ситуацию, так как синантропные птицы могут способствовать переносу возбудителя НБ. Для этих хозяйств необходимо разрабатывать вакцины против НБ в мелкой дозировке, удобные в применении (Венгеренко Л.А., 2006).
Отечественные производители выпускают живые вакцины против НБ из штаммов «В1», «Ла-Сота», «Бор-74 ВГНКИ», «Н», «ГАМ-61» (Сюрин В.Н.,1958, 1963; Лагуткин Н.А.,1975; Сафонов Г.А.,1984; Креймер Ю.Х.,1986; Смоленский В.И., Руденко Т.В., 1999; Сергеев В.А. с соавт., 2007), доля которых составляет около 23 % в общем объеме производства вакцин для профилактики инфекционных болезней птиц в РФ.
Традиционная технология приготовления живых аттенуированных вакцин против НБ имеет резервы для совершенствования (Lancaster D., 1988; Cameron J.,1990; Смоленский В.И., 2001, 2007; Тихонов И.В. с соавт., 2008). Требуют совершенствования способы концентрирования и очистки вируса от балластных белков; повышения стабильности вакцины и ее оценки; технологического контроля производства вакцины; гармонизации методов контроля с международными требованиями (Сергеев В.А., Непоклонов Е.А., Алипер Т.И., 2007).
Концентрирование и очистка вируса НБ является важнейшим технологическим элементом получения более эффективных и безопасных препаратов, поскольку для конструирования ассоциированных и инактивированных вакцин важно иметь вируссодержащий материал (ВСМ) с высокой антигенной и иммуногенной активностью в минимальных объемах.
Перспективным компонентом для создания ассоциированных вакцин, с эпизоотологической точки зрения, является вирус инфекционного ларинготрахеита (ИЛТ). В ряде регионов РФ ИЛТ встречается в ассоциации с НБ, нанося значительный экономический ущерб при выращивании цыплят-бройлеров (Кулаков В.Ю. с соавт., 2007).
Проблема повышения стабильности препаратов актуальна для птицеводства, поскольку доля препаратов для птиц составляет 95 % мирового рынка препаратов для животных. Требования к углубленному изучению стабильности лекарственных средств (ЛС) содержатся в Правилах GMP. Наиболее перспективным для оценки стабильности биологических препаратов различной природы считается метод «ускоренного старения» (Мешковский А.П., 2000; 2008).
Эффективность вакцинации во многом определяется дозой антигенного материала. Существует зависимость между силой антигенного раздражения и интенсивностью иммунного ответа при введении вакцины в организм. Большие дозы вакцины угнетают иммуногенез до развития иммунологической толерантности; малые же дозы не вызывают иммунологической перестройки в организме и синтеза защитного уровня антител (Лагуткин Н.А. с соавт., 1997; Alexander D.E., 1997).
Интенсивное развитие мясного птицеводства требует совершенствования технологии вакцинации цыплят против НБ с использованием специального оборудования, обеспечивающего экологическую безопасность для персонала и окружающей среды. Особенно важной является защита человека от контактов с вирусом НБ, поскольку он относится к зоонозам (ВОЗ, СТД № 682.,1985).
Выполнение требований стандартов менеджмента качества (ГОСТ Р ИСО 9001-2008) и Правил GMР (ГОСТ Р 52249-2009) способствует повышению качества вакцин. Технологический контроль становится главным инструментом, обеспечивающим основные составляющие качества биопрепаратов: безопасность, эффективность и стабильность. Постоянный мониторинг показателей качества в критических контрольных точках предупреждает возможность появления дефектов продукции. Рекомендуемый стандартами процессный подход связан не только с документированием, но и с детальным анализом и вмешательством в технологические процессы, которые рассматриваются в том числе, с точки зрения бизнес-процессов.
1.2. Цель и задачи исследований. Цель работы состояла в совершенствовании технологии производства вакцины против ньюкаслской болезни из штамма «Ла-Сота», разработке новых вакцин на основе концентрированного вируса и экологически безопасных технологий вакцинации цыплят-бройлеров в условиях промышленного птицеводства.
Для реализации поставленной цели нами были определены следующие задачи:
- изучить кинетику термоинактивации биологической активности вируса НБ, разработать методы оценки стабильности вакцины против НБ на всех этапах ее жизненного цикла и определить возможность прогнозирования сроков годности вакцины;
- научно обосновать и количественно определить оптимальную иммунизирующую дозу вакцины против НБ из штамма «Ла-Сота»;
- разработать технологический процесс получения концентрированного вируссодержащего материала для изготовления вакцин;
- разработать технологию изготовления моновакцины из концентрированного вируса;
- разработать технологию изготовления ассоциированной вакцины против НБ и ИЛТ птиц;
- разработать экологически безопасные технологии крупнокапельной и камерной аэрозольной вакцинации цыплят-бройлеров против НБ;
- оценить технологический процесс производства вакцины против НБ и возможность его совершенствования с учетом требований международных стандартов ИСО серии 9000:2008 и Правил GMP (ГОСТ Р 52249-2009).
1.3. Научная новизна. Применение линейной модели для изучения изотермической кинетики инактивации вакцины против НБ (сложного многокомпонентного по составу иммунобиологического препарата) позволяет обоснованно перейти к количественной оценке стабильности биологической активности препаратов и прогнозированию их сроков годности. В качестве критерия оценки эффективности мероприятий по совершенствованию технологических процессов производства вакцины из штаммов «Ла-Сота», «В1», «Бор-74 ВГНКИ», «Н» и «ГАМ-61» применен тест «ускоренного старения».
Количественный метод оценки стабильности вакцины против НБ применен в процессе разработки новой защитной среды (патент РФ «Защитная среда для приготовления сухой вирусной вакцины» № 1212045 с приор. от 24.01.84 г., А.С. «Способ подбора стабилизатора для сухой вирусной вакцины» № 1314679 с приор. от 15.08.84 г. в соавторстве),
Впервые в отечественной ветеринарной практике научно обоснована и количественно определена оптимальная иммунизирующая доза вакцины против НБ из штамма «Ла-Сота».
Разработана технология получения вакцины против НБ на основе концентрированного методом ультрафильтрации на полых волокнах вирусного материала (ВСМ) штамм «Ла-Сота» с гемагглютинирующей активностью которого не ниже 2048 ГАЕ/см3, что позволяет получать стабильный при хранении препарат с содержанием доз во флаконе от 20 и выше. В качестве стабилизатора применена защитная среда на основе белкового гидролизата определенного пептидного состава (патент РФ «Вакцина против болезни Ньюкасла птиц и способ ее применения» № 2035917 с приор. от 28.12.92 г., А.С. «Способ изготовления ферментативного гидролизата тканей куриного эмбриона для приготовления защитных сред при производстве сухих вирусных вакцин» № 1277457 с приор. от 12.09.85 г. в соавторстве).
Разработана технология изготовления живой комбинированной вакцины (против НБ и ИЛТ) на основе концентрированного ВСМ штамм «Ла-Сота», использование которого позволяет избежать разбавления второго компонента вакцины ВСМ ИЛТ, не подлежащего концентрированию, и уменьшить объем вакцинальной дозы (патент РФ «Способ получения комбинированной вакцины против ньюкаслской болезни и инфекционного ларинготрахеита птиц» № 2106152 с приор. от 16.06.93 г. в соавторстве).
Разработана схема камерной экологически безопасной аэрозольной вакцинации цыплят-бройлеров однодневного возраста против НБ, которая исключает выброс вируса в окружающую среду. Определена доза вакцины против НБ из штамма Ла-Сота, которая не обладает реактогенностью при аэрозольной вакцинации цыплят-бройлеров с различным уровнем материнских антител и обеспечивает необходимую защиту при контрольном заражении (Патент РФ «Способ профилактики болезни Ньюкасла» № 2035915 приор. от 28.12.92 г. в соавторстве).
1.4. Практическая ценность работы. Результаты исследований использованы при усовершенствовании действующих и разработке новых технологий биопрепаратов против НБ и среды защитной для вирусных вакцин.
При непосредственном участии автора на ФГУП «Курская биофабрика» в 1993г. внедрена вакцина сухая против НБ из штамма «Ла-Сота». Производство осуществляется в соответствии с НД на вакцину (Инструкция, утв. ГУВ 29.08.1990 г., ТУ 10-19-212-86 и ТУ-10-19.45-88 «Среда защитная (СПЛФ-жидкая) для вирусных препаратов»). Предприятием выпущено 4,8 млрд. доз вакцины против НБ штамм «Ла-Сота» неизменно высокого качества.
В 1994 г. организовано опытное производство ВНИТИБП. Выпущено и реализовано вакцины против НБ из штаммов «Ла-Сота», «В1», «Бор-74 ВГНКИ», «Н» и «ГАМ-61» 272,36 млн. доз.
Разработан в соавторстве и внедрен ОСТ 100083-95 «Продукция агробиологической промышленности. Технологические регламенты производства. Содержание, порядок разработки, построения, согласования и утверждения.». В 2009 г. основные положения ОСТа пересмотрены с учетом требований ГОСТ Р 52249-2009 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств» и включены в проект ГОСТ Р «Средства лекарственные для животных. Технологические регламенты производства. Содержание, порядок разработки, согласования и утверждения».
Разработан комплект методических рекомендаций по вопросам внедрения системы менеджмента качества на предприятиях агропромышленного комплекса. Материалы документов используются с 2004 г.при проведении планового обучения специалистов предприятий РОАО «Росагробиопром» (ФГУП «Щелковский биокомбинат», «Орловская биофабрика», ОАО «Покровский завод биопрепаратов») и входят в системы документации этих предприятий.
1.5. Основные положения диссертационной работы, которые выносятся на защиту:
- результаты исследования кинетики термоинактивации вируса НБ; методики определения стабильности вирусных вакцин по тесту «ускоренного старения» и количественной оценки стабильности живых вирусных вакцин и применение их на этапах жизненного цикла вакцины;
- результаты экспериментальных исследований по определению оптимальной дозы вакцины против НБ штамм «Ла-Сота»;
- результаты исследований по разработке технологического процесса концентрирования вируссодержащего материала;
- технология производства, методы биологического контроля моновакцины из концентрированного вируса, результаты комиссионных испытаний опытно-промышленных серий препарата;
- технология изготовления ассоцииированной вакцины против НБ и ИЛТ птиц;
- результаты исследований по разработке экологически безопасных технологий крупнокапельной и камерной аэрозольной вакцинации цыплят-бройлеров против НБ;
- результаты анализа технологического процесса производства вакцины против НБ (в соответствии с требованиями стандартов ИСО с.9000 и Правил GMP) в условиях опытного производства ВНИТИБП.
1.6. Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены:
на заседаниях ученого совета и методической комиссии ВНИТИБП (1975 - 2009 гг.) в виде ежегодных отчетов по темам госзаданий; ветеринарной секции НТС Минсельхоза СССР (17.10. 1984 г.); секции «Ветеринарная биотехнология»» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2002, 2004-2009 гг.); на 5-ти Международных конгрессах и симпозиумах: ХХI Всемирный ветеринарный конгресс (Москва, 1979 г.); І Болгаро-Советский симпозиум «Свободные радикалы и биостабилизаторы» (София, 1987 г.); Российско-американский конгресс «Экологическая инициатива» (Воронеж, 1996 г.); XI International congress оf the World Veterinary poultry association(Будапешт,1997 г.); І Международный ветеринарный конгресс по птицеводству (Москва, 2005 г.); на 37 Всесоюзных, Республиканских, Международных и Всероссийских конференциях, посвященных научным и практическим проблемам технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов, проводившихся: в Москве, Минске, Риге, Киеве, Харькове, Алуште, Воронеже, Ст. Петербурге, Саранске, Владимире, Новосибирске, Екатеринбурге, Ставрополе, Краснодаре, Курске, Щелково (1977 – 2009 гг.).
Разработки по материалам диссертационной работы удостоены: серебряной медали ВДНХ СССР, 2-х медалей «Лауреат ВВЦ» и нагрудного знака «Участник ВВЦ» (пост. № 678-Н от 13/ІХ-88 г.; № 2682 от 11.ХІІ.2002 г.; № 685 от 12.10.09 г.; № 157 от 24.10.06 г.).
1.7. Публикации. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 86 научных работах, в том числе в 7 статьях в изданиях по перечню, рекомендованному ВАК Минобрнауки России для публикации материалов докторских диссертаций. По результатам исследований получено 6 патентов и авторских свидетельств, разработаны и утверждены 1 отраслевой стандарт и 7 методических рекомендаций. На разработанные и внедренные препараты утверждены нормативные документы в установленном порядке.
1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 398 стр. машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, материалы и методы, обсуждение, выводы и практические предложения, содержит 35 таблиц и 15 рисунков. Список литературы включает 580 источников. В приложении представлены сводные таблицы исходных данных и копии документов, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
1.9. Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы, постановке целей и задач исследований, теоретическом и методологическом обосновании путей решения поставленных задач, непосредственном планировании эксперимента и выполнении исследований, обобщении и интерпретации результатов. Автор лично принимала участие в апробации и промышленном производстве разработанных препаратов, подготавливала публикации.
1.10. Благодарности. Автор выражает благодарность научному консультанту, директору ВНИТИБП, академику РАСХН А.Я. Самуйленко. В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие и оказывали практическую и консультативную помощь сотрудники института Э.Ф. Токарик, Н.С.Шевырев, Л.А. Неминущая, А.А. Нежута, Б.Е. Блехерман, Б.И. Токарик, С.М. Панферова, В.В. Панферов, Л.А. Елисеева, Ю.Д. Фролов, В.И. Еремец, С.В. Кузнецова, Е.И. Ярыгина, а также сотрудники ВГНКИ: В.И. Смоленский Т.В., Руденко; ВНИВИП М.И. Слободенюк, Р.Г. Айрапетов; ВНИТИП В.И. Филоненко, В.Г., Шоль, И.П. Салеева, Д.В. Шешенин за что приносим им сердечную благодарность.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена в 1975-2009 гг. во ВНИТИБП и в его опытном производстве. Часть исследований проводилась совместно с сотрудниками ВГНКИ, ВНИВИП и ВНИТИП. Эксперименты, касающиеся практической реализации научно-исследовательских разработок, осуществляли на базе ряда предприятий отрасли, экспериментального бройлерного хозяйства ВНИТИП.
В качестве материалов для исследований использованы: вакцинные и контрольные штаммы вирусов НБ и ИЛТ; вируссодержащий материал (ВСМ), полученный в лабораторных и производственных условиях; образцы опытных и производственных серий вакцины из штамма «Ла-Сота», «В1», «Бор-74 ВГНКИ», «Н», ГАМ-61»; опытные серии сухой комбинированной вакцины против НБ и ИЛТ, вакцины «Моновак-НБ-форте», вакцины «Оровак НБ». Для получения ВСМ использовали инкубационное яйцо от невакцинированных против НБ кур (из хозяйств, благополучных по болезням птиц), с 1997г. SPF куриное яйцо (ФРГ, «Lomann Tierzucht») и SPF- эмбрионы кур 9-10-сут возраста производства ФГУП «Щелковский биокомбинат». Вакцинные штаммы ВНБ характеризовали по показателям: среднее время гибели КЭ (МТD); индекс интрацеребральной патогенности для однодневных цыплят (ICPI); индекс интравенозной патогенности для 6-ти недельных цыплят (IVPI); стабильность вирусных гемагглютининов при +560С; стабильность инфекционности вируса при рН 2,8-3,0; агглютинабельность вируса по отношению к эритроцитам петуха,лошади и крупного рогатого скота. Морфологию вируса исследовали методом электронной микроскопии. Инфекционную активность вируса НБ и образцов вакцин определяли титрованием на 9-10 суточных КЭ и рассчитывали по методу Кербера, титр гемагглютининов - в реакции гемагглютинации. Инфекционную активность вируса ИЛТ штамм «ВНИИБП» определяли в реакции нейтрализации. Применяли растворители: 10%-ный раствор глицерина в дистиллированной воде; растворитель для сухой вирусвакцины против болезни Марека (2%-ный раствор пептона в 2-х молярном глициновом буферном растворе) - ТУ 46-21-58-74; АР 1 - Авистим (ТУ 10.07-025-93) – растворитель для живых сухих вакцин против НБ.
В качестве компонентов защитной среды для высушивания вакцины против НБ применяли пептон производства Семипалатинского завода и ГКЭ – гидролизат куриных эмбрионов.
Использовали цыплят и кур различных возрастов мясных и яичных пород и кроссов: цыплята- бройлеры «Гибро - 6»; кросс «Конкурент»; «Бройлер-6»; «Беларусь-9»; породы белый леггорн и кросс «Хайсекс белый. Вакцинацию проводили интраназально, окулярно, перорально (выпаиванием ), крупнокапельным распылением и аэрозольно в камере специальной конструкции. Безвредность и реактогенность вакцин определяли общепринятыми методами. Материнские и специфические сывороточные антитела определяли в РЗГА по общепринятой методике. Эффективность вакцинации оценивали по напряженности иммунитета и по уровню защиты птицы при контрольном заражении. Рассчитывали ЭД50 и ЭД95 (50% и 95% защитные дозы).
Для исследования термостабильности использовали термостаты и ультратермостаты (± 0,50).Исследовали воздействие градиента температур, начиная с +400С (интервал 50), и постоянной температуры (от +40 до +700С) на биологическую активность вируса НБ в течение времени, выбранного так, чтобы снижение активности вируса было достоверным. Образцы сухой вакцины после прогревания хранили при температуре - 400С не более 10 дней.
Методом гельфильтрации исследовали процесс разделения ВСМ на полых волокнах и пептидный состав гидролизатов белка – основы защитных сред (гель «Toуpearl» HW – 50 F1 Япония) на колонке 2,640 см; элюирование проводили фосфатным буферным раствором (0,15 М, рН 7,2). Белок определяли методом Къельдаля, содержание растворимого белка - по методу Лоури, аминный и общий азот - известными методами.
Статистические методы. Опыты проводили с числом повторов 3, достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по методу Стьюдента-Фишера при уровне значимости р = 0,05. Результаты исследований по термоинактивации обрабатывали методом регрессионного анализа и с применением коэффициента корреляции. Для построения линий прогноза использовали Аррениусовскую температурную зависимость ln KT от 1/T, прогнозирование сроков годности вакцин осуществляли методом экстраполяции. Для оценки точности и стабильности технологического процесса производства вакцины применяли метод гистограмм. Ретроспективную оценку стабильности технологического процесса проводили с помощью контрольной карты Шухарта для средних значений и размаха (, R).
Похожие диссертации на Совершенствование технологии производства и способов применения вакцин против ньюкаслской болезни
