Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12-46
2.1.Современные представления о взаимоотношениях 12-24 макроорганизм - микробиота
2.2. Создание искусственных иммуногенов 24-39
2.3. Диагностические системы в иммунологии 39-46
ГЛАВА III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 47-56
3.1 Объекты исследований 47-48
3.2. Методы исследований 48-56
ГЛАВА IV, РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 57-100
4.1. Изучение влияния эндогенных-и экзогенных факторов на адгезию бифидобактерий in vitro 57-64
4.2.Получение функционально активных (иммуногенныхклеточных фракций бифидобактерий и изучение их белкового и аминокислотного состава ) 65-74
4.3. Получение комплексов биомолекул клеточных фракций бифидобактерий с сополимером АК - ВИ и изучение их имму ногенно сти 74-84
4.4. Конструирование и оценка активности эритроцитарных иммунодиагностикумов для РПГА на основе клеточных фракций бифидобактерий с применением синтетических полимеров 84-100
ГЛАВА V. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 101-112
ГЛАВА VI. ВЫВОДЫ 113-114
ГЛАВА VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115-142
- Создание искусственных иммуногенов
- Методы исследований
- Изучение влияния эндогенных-и экзогенных факторов на адгезию бифидобактерий in vitro
Введение к работе
Последние десятилетия характеризуются возрастающим вниманием исследователей к микроорганизмам, обитающим в организме человека и животных, и их роли в поддержании здоровья и возникновении болезней. Важное значение симбиотической микрофлоры для организма человека к настоящему времени является общепризнанным и базируется на результатах многочисленных исследований [Перетц Л.Г., 1955; Гончарова Г.И., 1986; Дубинин А.В., Бабин В.Н., Раевский П.М., 1991; Шендеров Б.А., 1998].
Вместе с тем, молекулярные механизмы кооперативного взаимодействия макроорганизма и населяющих его микроорганизмов, обеспечивающие стабильность кишечной экосистемы, приживление аутохтонной и элиминацию аллохтонной микрофлоры, до настоящего времени окончательно не выяснены.
Постоянство микрофлоры, микробиологический фенотип, присущий каждому человеку, является показателем иммунологической реактивности организма и одним из факторов естественного иммунитета [Пинегин Б.В. с соавт., 1984; Гребнева А.Л., Мягкова А.Н., 1994; Лыкова ЕА. с соавт., 1996; Захарченко М.П., 2003]
Иммунореактивность к представителям нормальной микрофлоры формируется под влиянием изобилия антигенов, микробных метаболитов, митогенов, супрессоров, адъювантно-активных и прочих веществ и составляет важный компонент иммунологического гомеостаза. Нарушения иммунологических взаимоотношений в системе «макроорганизм-микрофлора» нередко приводят к развитию патологических состояний, характеризующихся изменением реактивности к представителям нормальной микрофлоры хозяина, как условно- патогенной, так и непатогенной. Показатели специфической реактивности к условно-патогенным и непатогенным бактериям служат важным критерием оценки состояния биоценоза кишечника.
Для определения иммунологической реактивности организма к индигенным микроорганизмам необходимо иметь диагностические тест-системы, при выборе которых существенное значение имеет их чувствительность и специфичность, а также и экономический фактор, В ряде случаев применение простых и недорогих методов может быть более эффективным, чем использование дорогостоящей тест- системы с высоким уровнем чувствительности и специфичности. Поэтому разработка технологических подходов к выделению функционально активных антигенов, создание на их основе искусственных антигенов и применение новых конъюгарующих компонентов на основе синтетических полимеров является актуальной при создании и стандартизации недорогих тест- систем, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью.
Создание искусственных иммуногенов
К настоящему времени получены обширные экспериментальные данные, доказывающие иммуностимулирующее влияние синтетических неприродных полиэлектролитов (поливинипиридина (ПВП), поли-N- винилимидазола (ПВИ), полиакриловой кислоты (ПАК), поли-2-метил-5-винилпиридина (ПМВП) и других) на организм лабораторных животных (мышей, крыс, кроликов, собак) к разнообразным растворимым и корпускулярным антигенам [Нажмитдинов А.М и соавт., 1979; Петров Р.В. и соавт., 1998; Петров Р.В. и соавт., 1986; Гущин И,С. и соавт., 1986; Петров Р.В. и соавт., 1982; Манько В.М. и соавт., 1990; Свиридов Б.Д.и соавт. 1976].
Механизм такого действия связан как с воздействием на отдельные этапы иммуногенеза (миграцию стволовых кроветворных клеток, Т- и В- лимфоцитов, кооперацию Т- и В- лимфоцитов) в иммунном ответе, так и с непосредственным воздействием на популяцию В- лимфоцитов, приводящим к поликлональной активации синтеза иммуноглобулинов, угнетением функции Т-клеток- супресоров, а также стимуляцией дифференцировки Т- клеток-хелперов из их предшественников [Норимов А.Ш. и соавт., 1983; Атауллаханов Р.И. и соавт., 1985.; Петров Р.В.и соавт., 1981].
Иммуностимулирующая активность синтетических полимеров реализуется в первую очередь благодаря макромолекулярности - свойству, необходимому для обеспечения кооперативного взаимодействия с поверхностью имму некомпетентных клеток [Зезин А.Б.,1973; Скворцов Н.Ю. и соавт., 1989].
Размеры клеток иммунной системы (10 мкм) лежат в области размеров частиц типичных органических и неорганических золей, с которыми взаимодействуют полимеры. Внешние мембраны клеток, состоящие из слоя липидов и встроенных в него белковых глобул, представляют собой универсальный многоточечный гетерофункциональный сорбент для полиэлектролитов и некоторых других гидрофильных полимеров [Кабанов В.А. и соавт., 1996]. Участки полимерных цепей могут сорбироваться как на заряженных (анионогенных и катионогенных) группировках полярных «головок» липидов, так и на выступающих наружу мембранных белках и полисахаридных фрагментах гликолипидов и гликопротеинов. Адсорбированные на клеточной мембране полиэлектролиты существенно изменяют ее свойства, а именно, проницаемость для ионов и других низко молекулярных веществ, текучесть липидного матрикса и фазовый переход в липидном слое [Resch К., 1976]. Любое из трех изменений может служить источником митогенного сигнала. В опытах in vitro прямым потенциометрическим измерением концентрации ионов калия в растворе, содержащем взвесь лимфоцитов, было показано, что введение полиионов сразу же вызывает поток ионов калия из клеток во внешнюю среду [Петров Р.В. и соавт.,1996; Февралева И.С. и соавт., 1996]. Одновременно увеличивался поток катионов кальция и натрия по градиенту концентрации и интенсивность включения в ДНК клеток Н-тимидина [Хаитов P.M. и соавт., 1987;Атауллаханов Р.И. и соавт., 1985; Атауллаханов Р.И. и соавт., 1985]. Увеличение ионной проницаемости сопровождалось активацией (Na+, К+)-и Са+2-АТФаз [Петров Р.В. и соавт., 1983; Петров Р.В. и соавт., 1998].
В 1974, 1976 гг. было обнаружено, что в условиях in vitro можно индуцировать пролиферацию лимфоцитов с помощью кальциевого ионофора А-23187. Это действие ионофора проявлялось только при добавлении в среду ионов кальция [Mainvo V. et al., 1974;Hovi Т. et al.,1976].
Позднее, в 1986 г. было показано, что искусственное повышение проницаемости мембран с помощью мембраноактивных веществ- нистатина, леворина, S- 1944 или ионофоров- грамицидина S и диаза-18-краун-6 приводит к значительной активации деления и антигензависимой дифференцировке лимфоцитов. Более того, незначительная (менее 2,1%) ковалентная модификация сополимеров винилпирролидона грамицидином S и краун эфиром приводила к существенному увеличению их иммуномодулирующей активности [Китаєва М.Н.и соавт.,1986].
Методы исследований
Бифидобактерии культивировали на жидкой питательной среде, чтобы изменение физиологических свойств не повлияло на их адгезивные свойства, т.к. на твердой среде они плохо росли и имели кокковидную форму.
Сухой коммерческий штамм бифидобактерии Bifidobacterium bifidum I перед постановкой адгезии разводили дистиллированной водой из расчета І доза-1 мл. Посев бифидобактерии производили в полужидкую среду Блаурокка и тиогликолевую среды глубинно, по 1 мл бактериальной взвеси в пробирку. Культуру подращивали 48 - 72 час при 37 С в анаэробных условиях. Затем микробную массу осаждали мягким центрифугированием (по 10 мин трижды, 3000 об/мин), из осадка делали взвесь по стандарту мутности до 109 кл./мл.
Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов. В работе за основу был взят метод Брилис В.И. [Брилис В.И. и соавт., 1986]. В качестве модели кишечного эпителия использовали формалинизированные эритроциты человека О (I) гр., Rh (+) в концентрации 0,5%, поскольку в ряде исследований было показано, что эритроциты человека данной группы крови имеют общие рецепторные характеристики с клетками слизистой кишечника для адгезии бактерий.
Готовили 1-2 суточную культуру бифидобактерий, отмытую от среды путем центрифугирования в буферном растворе и доведенную до концентрации 109 кл/мл по стандарту мутности.
Для постановки опыта в пробирку вносили по 0,5 мл взвеси микроорганизмов и эритроцитов. Смесь инкубировали при 37 С в термостате на встряхивателе в двух временных режимах: в течение 30 и 60 мин.
Для учета результатов готовили по 3 препарата из каждой пробирки, фиксировали их на пламени спиртовки и окрашивали по Граму.
Адгезивные свойства оценивали под световым микроскопом с увеличением 10x90 с вычислением среднего показателя адгезии (СПА)- среднего количества микробов, прикрепившихся к 1 эритроциту, при подсчете не менее 25 эритроцитов, учитывая не более 5 эритроцитов в одном поле зрения.
Адгезивность считали нулевой при СПА от 0 до 1,0; низкой - при СПА от 1,01 до 2,0; средней - от 2,01 до 4,0; высокой - свыше 4 [Брилис В.И. и соавт, 1986]. Вариации результатов при данном методе - ±15% [Лабинская А.С., 1972].
Изучение влияния антител на адгезию бифидобактерий
В ходе экспериментов по изучению влияния антител на адгезии бифидобактерий, использовали кроличью антисыворотку против общих антигенов бифидобактерий со средним титром 1: 320 в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА); 2 пула сывороток взрослых лиц и детей 7-14 лет с титром естественных антител в крови против бифидобактерий 1:16, определенных в РПГА (по 8 проб в пуле); 2 пула сывороток крови взрослых лиц и детей с титром естественных антител в крови против лактобактерий 1:16 (по 8 проб); водные отвары растительных препаратов курильского чая и кашкары.
Влияние антител кроличьих иммунных сывороток на адгезию бифидобактерий. Опыты проводили в двух вариантах.
В первом варианте гипериммунной кроличьей сывороткой обрабатывали бифидобактерии. Для этого к 0,5 мл взвеси бифидобактерий (109 кл/мл) добавляли 0,5 мл антисыворотки и полученную смесь инкубировали в термостате при 37С в течение 30 мин, периодически встряхивая. По истечению времени смесь центрифугировали (3 мин при 3000 об/мин), отсасывали супернатант, а осадок доводили до 1 мл фосфатным буфером. К этой смеси, т.е. бифидобактериям, обработанным антисывороткой, добавляли 0,5 мл взвеси формалинизированных эритроцитов человека. Полученную смесь помещали в термостат при 37С на 30 и 60 мин., периодически встряхивая. Далее готовили мазки и учитывали результаты.
Второй вариант опыта проводили в той же последовательности и при тех же режимах. Отличие заключалось в том, что антисывороткой обрабатывались эритроциты, а не микроорганизмы.
Контролями служили материалы исследований, где вместо антисыворотки применяли физиологический раствор в аналогичных объемах и режимах.
Изучение влияния эндогенных-и экзогенных факторов на адгезию бифидобактерий in vitro
Явление адгезии бактериальных клеток к поверхностным рецепторам играет важную роль для понимания принципов взаимодействия микроорганизма с макроорганизмом. Поэтому выявление факторов, влияющих на адгезию бифидобактерий, представляет особый интерес, поскольку дает возможность по-новому подойти к изучению их физиологии, в том числе к развитию кишечного дисбактериоза. В связи с этим задачей данного раздела работы было - установить характер влияния некоторых экзогенных и эндогенных факторов на адгезивность основного представителя индигенной микрофлоры- бифидобактерий в системе in vitro.
Влияние антител против общих антигенов бифидобактерий на цитоадгсзию микроорганизмов. В качестве модели кишечного эпителия использовали формалинизированные эритроциты человека 1(0) гр., Rh (+).
Для получения гипериммунных сывороток иммунизировали кроликов породы «Шиншила» весом 3- 3,5 кг еженедельно подкожно антигеном (сухой коммерческий препарат «Бифидумбактерин», из расчета 109 клеток/мл), в качестве адъюванта использовали синтетический полиэлектролит - сополимер 5- изопропенилтетразола с 1- винилпирролидоном. Компоненты вводились в равных объемах, общим объемом 1мл. Через 3 мес. осуществляли двукратную ревакцинацию и еще через месяц собирали сыворотку с определением титра антител против бифидобактерий в РПГА.
Эритроцитарный иммунодиагностикум по определению антител к бифидобаткриям готовили с использованием в качестве конъюгирующего компонента полиметакриловой кислоты (1000 кДа- 0,8 мг/мл). Сенсибилизацию осуществляли общими антигенами коммерческого препарата
«Бифидумбактерин». В ряде случаев при нарушении эубиоза кишечника наблюдается значительное количественное снижение индигеннои микрофлоры, которое не восстанавливается даже после нескольких курсов лечения пробиотическими препаратами. Это можно объяснить по крайней мере двумя причинами: во-первых, врожденной низкой адгезивной активностью аутоштаммов симбиотической микрофлоры кишечника, и, во- вторых, приобретенной - под влиянием эндогенных и экзогенных факторов. Одним из таких факторов, способных оказывать угнетающий эффект на жизнедеятельность бифидобактерий в кишечнике, может быть наличие специфических антител, направленных в том числе против адгезивных структур бактериальных клеток. В пользу этого говорят исследования Чхаидзе И.Г. об ингибирующем действии иммунных сывороток на развитие эшерихий в тонкой и толстой кишке животных [Чхаидзе И.Г и соавт.1998]. Из этого следует, что угнетение адгезивной активности симботической микрофлоры хозяина может повлечь за собой снижение общей колонизационной резистентности макроорганизма.
В предварительных экспериментах было установлено, что оптимальным температурным режимом для адгезии бифидобактерий in vitro является 37 С. При температуре 56 С в течение 30 минутной экспозиции с эритроцитами адгезии бифидобактерий на них не наблюдалось. Продолжительность экспозиции микроорганизмов с эритроцитами от 30 до 60 мин при 37 С практически не влияла на показатели адгезии.
Адгезивность коммерческого штамма в эксперименте была достоверно выше, чем аутоштамма (СПА = 1,64 ± 0,08, К= 1,6 ± 0,9 % для коммерческого штамма; 1Д2 ±0,06 и 10 ± 0,12 соответственно для аутоштамма). Таким образом, в дальнейшем для изучения влияния сывороточных антител на адгезию бифидобактерий был выбран коммерческий штамм бифидобактерий (Bifidobacterium bifidum 1., полученный из сухого коммерческого препарата "Бифидумбактерин", сер. 0518, выпуска 1998 г.). Все последующие эксперименты проводили в условиях температурного режима в 37 С и 60-минутной экспозиции бифидобактерий с эритроцитами.
Изучение влияния антител на адгезию бифидобактерий проводили в два этапа. На первом этапе исследовали влияние гетерологичных антител на адгезию бифидобактерий с помощью гипериммунной кроличьей антисыворотки с антителами против общих антигенов бифидобактерий. Средний титр кроличьей антисыворотки в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) составлял 1:32. На втором этапе изучали характер влияния естественных (нормальных) антител на адгезивный процесс бифидобактерий. С этой целью использовали сыворотки крови детей (от 5 до 14 лет) и взрослых лиц (от 15 до 50 лет) с наличием естественных антител против бифидобактерий. Средний титр естественных антител против бифидобактерий в РПГА составил - 1:16. В качестве контроля в эксперименте были использованы образцы крови детей и взрослых, в сыворотке которых отсутствовали естественные антитела. В каждом пуле имелось по 8 сывороток. Данные эксперимента представлены в таблицах 1 и 2.
Похожие диссертации на Совершенствование технологии приготовления эритроцитарных иммунодиагностикумов для РПГА на основе клеточных фракций бифидобактерий с использованием синтетических полимеров
