Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 10
1.1 Питательные потребности B.subtilis 3, B.licheniformis как основа для разработки питательных основ и сред 10
1.2 Современные методы высушивания термолабильных нутриентов 24
2. Собственные исследования 39
2.1 Выбор направления исследований 39
2.2 Материалы и методы исследований 43
2.2.1 Микроорганизмы 43
2.2.2 Питательные среды, растворы и реактивы 43
2.2.3 Методы исследований 44
2.3 Результаты исследований 51
2.3.1 Разработка технологии получения сухих гидролизатов казеина, соевой муки и мяса методом распылительной сушки 51
2.3.1.1 Экспериментальное обоснование способа подготовки гидролизатов к сушке 51
2.3.1.2 Отработка режимов обезвоживания питательных основ на распылительной установке 56
2.3.2 Комплексная оценка показателей качества сухих питательных основ 61
2.3.2.1 Изучение физико-химических свойств экспериментальных образцов сухих питательных основ 61
2.3.2.2 Сравнительное изучение физико-химических показателей качества экспериментальных сухих питательных основ с существующими аналогами 69
2.3.2.3 Изучение ростовых свойств сухих гидролизатов при глубинном вы ращивани культур B.subtilis 3 и B.licheniformis 31 72
2.3.3 Оценка воспроизводимости технологии получения сухих питательных основ 90
2.3.4 Применение полученных сухих питательных основ в производстве биоспорина 94
2.3.5 Расчет экономической целесообразности получения сухих питательных основ 101
2.3.6 Определение длительности хранения питательных основ 118
3 Обсуждение результатов 128
Выводы 134
Практическое использование полученных 136
Результатов исследований список использованных источников 137
- Питательные потребности B.subtilis 3, B.licheniformis как основа для разработки питательных основ и сред
- Экспериментальное обоснование способа подготовки гидролизатов к сушке
- Применение полученных сухих питательных основ в производстве биоспорина
- Обсуждение результатов
Введение к работе
Актуальность темы. Одним из эффективных пробиотиков для лечения ОКИ и дисбакгериозов является биоспорин, выпускаемый Центром военно-технических проблем биологической защиты. За счет удачного сочетания в его составе свойств взаимодополняющих штаммов B.subtilis ВКПМ №2335 (3) и B.licheniformis ВКПМ № 2336 (31) биоспорин обладает несомненными преимуществами перед другими пробиотиками, используемыми для профилактики и лечения ряда болезней человека и животных.
Экспериментально доказано, что стабильность культивирования споровых культур B.subtilis и B.licheniformis и свойств готового препарата в значительной степени зависят от стандартности питательных сред по биологическим и физико-химическим характеристикам. Возможность получения таких питательных сред определяется, прежде всего, стандартностью как используемого исходного сырья, так и технологией процесса их производства.
Одним из направлений решения данного вопроса является увеличение объема каждой серии выпускаемых жидких питательных основ с последующей их сушкой. Полученные таким образом питательные основы, кроме высокой стандартности, обладают продолжительным сроком годности и практически не меняют свои свойства в период гарантированного хранения.
Основные недостатки жидких питательных основ связаны с качеством исходного сырья и обусловлены изменением компонентного состава при длительном хранении в течение 3-6 месяцев Указанные питательные основы имеют ограниченные сроки хранения и требуют создания специальных условий (температурный режим (4+2) С, использование большого количества тары, наличие холодильных камер и расход консерванта), а также значительные трудности при фильтрации и большой расход фильтрующего материала.
Данные обстоятельства потребовали усовершенствования технологии получения гидролизатов. Одним из методов, позволяющим на длительный период стабилизтровать свойства белковых питательных основ, является получение их в сухом виде.
В настоящее время наиболее эффективным способом высушивания различных растворов, суспензий, эмульсий и паст является сушка распылением. Использование данного метода обусловлено доступностью и относительной дешевизной аппаратурного оформления процесса сушки, высокой производительностью, экономичностью и незначительными физическими воздействиями на продукт при обезвоживании. Как правило, препараты, полученные с использованием данного метода сушки, обладают длительным сроком год-
POC НАЦИОНАЛЬНА*I БИБЛИОТЕКА J
ности, не требуют особых условий хранения, удобны в применении и имеют низкую себестоимость.
Таким образом, актуальность работы обусловлена необходимостью получения гидролизатов, имеющих длительные сроки хранения и обладающие необходимым для производства питательных сред стабильными ростовыми характеристиками.
Цель и задачи исследований. Целью научных исследований является разработка технологии получения и экспериментальное обоснование применения сухих питательных основ, используемых для приготовления питательных сред в производстве биоспорина.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
Разработать технологию приготовления сухих гидролизатов казеина, соевой муки и мяса.
Провести комплексную оценку по физико-химическим и биологическим показателям сухих ПО.
Оценить воспроизводимость технологии получения сухих питательных основ, определить сроки их хранения.
Оценить возможность использования сухих питательных основ в производстве биоспорина.
Обосновать экономическую целесообразность внедрения разработанной технологии.
Разработать и утвердить нормативно-техническую документацию на производство и контроль питательных основ.
Научная новизна. Впервые в отечественной практике разработана технология получения сухого солянокислотного гидролизата соевой муки.
Сухие гидролизаты казеина, соевой муки и мяса крупного рогатого скота используются для производства биоспорина.
Затраты на производство и хранение сухих гидролизатов в 2 раза ниже по сравнению с жидкими гидролизатами.
Научная новизна подтверждена решением Государственного патентного ведомства о выдаче патента на „Питательная среда для глубинного выращивания спор B.anthracis вакцинного штамма СТИ-1, B.licheniformis31, B.subtilis 3 и способ приготовления 3 %-го солянокислотного гидролизата соевой муки"
Практическая значимость. Использование метода распылительного высушивания в кипящем слое гранул инертного материала обеспечивает получение сухих питательных основ с необходимой дисперсностью и влажностью, что позволяет исключить стадию измельчения конечного продукта и гарантированно хранить данные сухие препараты в течение 3 лет.
Применение сухих питательных основ в технологии производства биоспорина позволяет получать готовые формы данного препарата с показателями качества, удовлетворяющими требования ФС.
Апробация работы. Материалы работы доложены на научно-практической конференции Центра ВТП БЗ НИИ МО РФ.
Основные положения, выносимые на защиту: " 1. Использование метода распылительного высушивания обеспечивает получение сухих питательных основ с необходимой дисперсностью и влажностью, что позволяет исключить стадию измельчения конечного продукта и гарантированно хранить данные сухие препараты в течение 3 лет;
B.subtilis 3 и В. lichen iform is 31, входящие в состав готовой лекарственной формы препарата биоспорин обладают высокой антагонистической активностью по отношению к возбудителям острых кишечных инфекций.
Применение сухих питательных основ в технологии производства биоспорина позволяет получать готовые формы данного препарата с показателями качества, удовлетворяющими требования ФС.
Объем и структура диссертации. Работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практическое использование полученных результатов исследований, список использованных источников.
Питательные потребности B.subtilis 3, B.licheniformis как основа для разработки питательных основ и сред
Клетка микроорганизма является сложной биологической системой, развивающейся в определенных условиях. Она состоит из комплекса органических и минеральных веществ, причем их содержание в клетках различных микроорганизмов может колебаться в зависимости от ее вида, состава питательной среды, способов и условий культивирования, возраста культуры и т.д. Потребности микроорганизмов в тех веществах, которые используются для синтеза клеточных компонентов, а также их взаимосвязь между собой широко рассмотрены в работах ряда авторов /40,47, 54, 84/. К основным компонентам, формирующим клеточное вещество, относят: углерод, азот, кислород и водород.
При искусственном культивировании микроорганизмов поступление в клетку источников углерода, азота, кислорода и минеральных, ростстимули-рующих веществ осуществляется из питательной среды.
Для роста и развития микроорганизмов в искусственных средах необходимо наличие в оптимальном количестве и в легко усвояемой форме питательных веществ.
Наличие большого количества работ, посвященных вопросу питания B.subtilis 3 и B.licheniformis 31, не всегда с достоверной точностью определяет количественные и качественные характеристики необходимых для развития и метаболизма клеток питательных веществ. Кроме того, многообразие веществ, необходимых для нормальной жизнедеятельности данных микроорганизмов, значительно осложняет выбор питательных субстратов и исходного сырья для их приготовления /67, 69/.
Интенсивность роста и развития культур зависит от источников минерального и органического питания. Существует прямое соотношение между конечным выходом бактериальной массы и исходной концентрацией глюкозы, NH/, S022 , Р04+5, К+ или Mn2+, Mg2+ /68/. Для нормального роста и развития бациллам необходимы микроэлементы, которые играют важную роль в ферментативных реакциях, происходящих в клетке, и в процессах спорообразования.
Установлено, что наличие в среде ионов металлов ускоряет накопление биомассы и повышает гидролитическую активность клеток. Ионы Mg + стиму-лируют биосинтез протеаз B.subtilis. Ионы Са оказывают стимулирующее влияние на амилолитическую активность B.subtilis, причем определенную роль играет соотношение ионов Mg2+ и Са2+ /68/. В то же время кальций способствует образованию разнообразных низкомолекулярных веществ в спорах, обеспечивающих их устойчивость к температурным воздействиям. Установлена роль ионов Мп в процессе спорообразования у B.subtilis. Они необходимы в качестве кофактора фосфатглицеромутазы для процесса споруляции в нормальной питательной среде. Потребности в фосфоре у бацилл настолько велики, что многие из них способны переводить нерастворимые соединения фосфора в растворимые /48/.
Таким образом, ионы микроэлементов, необходимые для нормального функционирования ряда ферментов, могут выступать в роли стабилизаторов или кофакторов ферментов, а также регуляторов спорообразования.
Содержание в питательных основах так называемого общего и аминного азота, их соотношение для спорогенеза весьма значимы. Общим условием для спорообразующих бактерий является не слишком высокое содержание азотистых веществ в среде, которое достигает 30 мг% по аминному азоту. Они спо-рулируют при исчерпании азота в среде /53/.
Различные виды споровых бактерий неодинаково относятся к источникам азота: одни лучше усваивают аммонийный азот, другие потребляют азот нитратов, некоторые нуждаются в аминокислотах или пептидах. Изучение потребностей спорообразующих бактерий в аминокислотах показывает значительные различия в них для разных видов штаммов, в том числе и для B.subtilis, B.licheniformis /4, 69, 86/. Вопросам использования аминокислот бактериями рода Bacillus посвящен ряд исследований, в результате которых установлено, что для B.licheniformis незаменимыми аминокислотами являются: аланин, аргинин, цистин, глицин, гистидин, лизин (Backer и др., 1953). Ряд авторов /66, 69/ изучали потребности в аминокислотах B.subtilis, используя прием исключения из набора аминокислот одной из них. Установлено, что изучаемые культуры B.subtilis не ауксотрофны в отношении какой-либо из отдельных аминокислот.
Бактерии, восстанавливающим нитраты, хорошо растут на средах с аммонийными солями и нитратами, которые являются единственными источниками азота. К таким бациллам, относят многие штаммы B.licheniformis /23, 24, 67/.
Следует отметить, что использование в составе питательных сред чистых аминокислот затруднено в связи с их высокой стоимостью. Поэтому как в лабораторной практике, так и в микробиологической промышленности используют среды, содержащие питательные основы неопределенного состава (белковые гидролизаты, экстракты, автолизаты и др.). Лучшим же источником азотного питания при этом является именно белковое сырье, в частности рыба, соя, казеин, горох /4,25, 36, 54, 64, 69, 85, 86/.
Самым традиционным источником белкового сырья, используемым для обеспечения питательных потребностей бацилл, является мясо крупного рогатого скота (КРС). Ферментативное переваривание мяса КРС, предложенное Хоттингером /32/, послужило основой создания ПС, содержащих набор необходимых аминокислот и пептидов, удовлетворяющих потребности различных микроорганизмов. Такие среды получили широкое распространение, в том числе для культивирования бацилл и получения пробиотиков /67/.
Как правило, при ограниченном производстве пробиотиков с использованием поверхностного способа выращивания культур уровень разработки новых ПО и ПС остаются без изменения в течение длительного времени /84/. Вместе с тем при производстве препаратов на основе B.subtilis и B.licheniformis в промышленных масштабах с использованием глубинного культивирования вопрос поиска дешевого сырья и разработки на их основе новых ПС является актуальной задачей.
В зависимости от происхождения используемого белкового сырья и основных компонентов питательные среды можно разделить на несколько групп:
- животное сырье;
- растительное сырье;
- продукты микробиологического синтеза;
- комбинированное.
Питательные среды животного происхождения имеют в своем составе экстрактивные вещества мяса, рыбы, кровь, сыворотку, пептоны, казеин и т.д. или гидролизаты из этих продуктов.
Так, например, в регламенте производства биоспорина на Днепропетровском фармзаводе предусмотрено культивирование B.subtilis 3 и B.licheniformis 31 на. плотной среде Гаузе-2, приготовленной с использованием перевара мяса КРС по Хоттингеру и ферментативного пептона /63/.
В.В. Подберезный и соавт. рекомендуют для B.subtilis свою среду из на-тивной подсырной сыворотки, обогащенную солевыми компонентами. Она превосходит по накоплению биомассы МПБ и молочную сыворотку В.И. Ни-китенко.
С целью удешевления питательных сред на основе гидролизатов продуктов животного происхождения уже давно делались попытки заменить эти компоненты на растительные. В качестве белкового субстрата растительного происхождения возможно использование кукурузы, сои, гороха, картофеля и др. /72/. Так, например, С.Дж. Перт выращивал бактерии B.subtilis с использованием среды, содержащей зеленую патоку, кукурузный экстракт и неорганические соли /72/. В отличие от животных продуктов в растительном сырье содержится большое количество углеводов, меньше белков и мало жиров; исключение соетавляют богатые белками бобовые растения. Например, в соевых бобах много белков, углеводов и жиров, витаминов и минеральных веществ. При гидролизе сои образуются аминокислоты, сходные по составу с аминокислотами животных белков.
Экспериментальное обоснование способа подготовки гидролизатов к сушке
В соответствии с требованиями регламента на производство биоспорина ПС, используемые в его производстве, за исключением агаровых, должны быть прозрачными и не содержать нерастворимого осадка. В свою очередь прозрачность ПС находится в непосредственной зависимости от свойств ПО, идущих на их приготовление. В этой связи считалось целесообразным провести исследования по выбору и обоснованию способов осветления жидких гидролизатов, а следовательно, и подготовке их к сушке.
Качество белковых гидролизатов в значительной степени обусловливается выбранным способом проведения гидролиза и степенью последующей очистки получаемого гидролизата /58/.
В зависимости от вида использованных субстратов, ферментов, способа гидролиза и необходимой степени конверсии белка требуется более простая или более сложная очистка продуктов /55/.
Кислотный гидролиз относится к химическому способу переработки белкового сырья /32/. Проводят его, как правило, при нагреве до (120-130 С) и избыточном давлении (0,2-0,3 МПа) 121. Чаще всего для проведения гидролиза данным способом используют серную или соляную кислоты различных концентраций /32/, в некоторых случаях применяют ортофосфорную, уксусную или смеси кислот. При этом продолжительность процесса варьирует от 1 до 6 часов 121.
В случае кислотного гидролиза белковые гидролизаты наряду со свободными аминокислотами и пептидами содержат соли минеральных и органических кислот, амины, окрашенные смолообразные примеси (меланоидные компоненты) и другие остатки клеточных биополимеров и продуктов их деградации /57/.
Сопряженные ненасыщенные системы, сорбируясь на клеточной стенке микроорганизмов, вызывают окислительные процессы, приводящие к сокращению сроков хранения биомассы, особенно в высушенном состоянии.
Как правило, режим кислотного гидролиза выбирается с учетом необходимой степени расщепления белкового сырья и получаемых в его результате продуктов, во многих случаях специфичных для питания отдельных микроорганизмов. Соответственно полного гидролиза субстрата не происходит, а балластные белки, присутствующие в реакционной смеси, в отдельных случаях затрудняющие последующие процессы культивирования микроорганизмов и очистки вакцинных препаратов, подлежат удалению.
При кислотном гидролизе может происходить частичное или полное разрушение триптофана, а также других аминокислот: метионина, цистина, гистидина, лизина. Кроме того, происходит образование значительного количества аммиака и карбонильных соединений /59/.
Известно, что невозможность использования кислотных гидролизатов для выращивания какой-либо культуры микроорганизмов бывает обусловлена, в основном, наличием в них токсических примесей. Так, хроматографическим и электрофоретическим методами установлен химический состав некоторых побочных продуктов кислотного расщепления белков (метилглиоксаль, окси-метилфурфурол, формальдегид и др.), обуславливающих их токсичность для ряда микроорганизмов /10/. Более того, экспериментально доказано, что кислые гидролизаты с рН 4,0 трудно поддаются высушиванию, т.к. вызывают за-липание слоя гранул инертного материала. В этой связи, необходим выбор способа очистки ПО, получаемых гидролизом кислотой. Очистка кислотных гидролизатов белка обычно начинается с подбора условий их нейтрализации подходящим щелочным реагентом /58/.
Кроме нейтрализации, для очистки белковых гидролизатов от ионов кислотных остатков применяют высокоселективные анионообменные смолы (ИА-1Ф, ЭДЭ-1 ОПТ и др.).
Помимо прочего, для осветления гидролизатов и адсорбции окрашенных примесей широко применялись и применяются в настоящее время активированные угли различных марок /16/, которые добавляются до или после подще-лачивания растворов. Смесь выпавших нерастворимых солей отфильтровывают вместе с активированным углем или другим сорбентом, предназначенным для осветления раствора. Одновременно с деминерализацией и осветлением раствора происходит отделение избытка дикарбоновых кислот и тирозина, образовавшихся в процессе гидролиза.
В случае проведения солянокислотного гидролиза оставшуюся соляную кислоту удаляют нейтрализацией NaOH, КОН или Ыа2СОз /94/, а также при помощи ионообменных мембран или анионитов различных марок /102, 111/.
В противоположность химическому гидролизу ферментативный гидролиз белков, как известно, протекает в мягких условиях в нейтральной, слабокислой или слабощелочной среде при температуре 35-50 С в течение 8-120 ч и приводит к получению смеси аминокислот и пептидов /8, 58/. Обычно для гидролиза в препаративных целях применяют неочищенные ферментативные препараты из поджелудочной железы или слизистой тонкого кишечника различных сельскохозяйственных животных, а также ферменты растительного происхождения. При ферментативном гидролизе не происходит разрушение триптофана и наблюдается самая низкая степень рацемизации аминокислот 19/. Ферментативные гидролизаты белков содержат в своем составе значительно меньшее количество солей и в отдельных случаях не требуют специальных процедур очистки / 58,26,114/.
Некоторые гидролизаты, особенно из растительных белков, часто содержат высокомолекулярные примеси, которые необходимо удалять, для чего применяют, например, ультрафильтрацию растворов гидролизатов через полупроницаемые мембраны с различным размером пор, обеспечивающую не только фракционирование, но и очистку, в частности осветление растворов /113, 117/. В случае необходимости можно ограничиться обычной фильтрацией гидролизатов через активированные угли различных марок, бентониты, неорганические соединения кальция /13, 114/, а также через фильтровальное полотно или картон.
Учитывая, что фильтрованный ФГМ имеет рН (7,5+0,3) ед.рН, который отвечает требованиям к жидким полуфабрикатам по рН, подаваемым на установку сушки УСП-2, представлялось целесообразным его высушивать без применения какой-либо дополнительной подготовки. Высушенный ФГМ имел вид мелкодисперсного гомогенного порошка с влажностью не более 5 %. Данный эксперимент подтвердил предположение о том, что данная ПО перед обезвоживанием не требует дополнительной подготовки, так как экспериментальные образцы сухого ФГМ соответствовали предъявляемым требованиям ВД.
Применение полученных сухих питательных основ в производстве биоспорина
Для приготовления контрольных партий биоспорина сухие ПО - КГК, входящий в состав ПС № 4 и № 7; КГСМ, составляющий основу ПС № 5 и № 6 - были испытаны в условиях производства при выращивании культур B.subtilis 3 и B.licheniformis 31 в ферментерах БИОР-0,1 и БИОР-0,25. Условия культивирования задавали согласно требованиям регламента производства биоспорина/107/.
Параллельно осуществляли выращивание в аппаратах на средах № 4, № 7, № 5 и № 6, приготовленных на жидких ПО, которые служили контролем.
Культивирование в аппаратах осуществляли при температуре 37 С в течение 36-39 ч до получения в КЖ 40-50 % свободных зрелых спор по микроскопической картине мазка.
Выходные параметры КЖ В. subtilis 3 и В. licheniformis 31, полученные на экспериментальных и контрольных средах, представлены в таблицах 28, 29.
По окончании культивирования микробную суспензию захолаживали в аппарате до температуры 10-12 С и передавали на концентрирование. Так как критериями оценки качества проведения культивирования в аппаратах служили содержание жизнеспособных клеток в КЖ и полнота спорообразования, выраженная коэффициентом термоустойчивости, то из приведенных в таблице 28 характеристик КЖ, полученных выращиванием на средах № 5 и № 6, видно, что экспериментальные среды № 5 и № 6, содержащие сухую ПО, не отличаются более высокой продуктивностью по выходным параметрам КЖ по сравнению с регламентными.
Вместе с тем, КЖ, полученные при выращивании B.subtilis 3 и B.licheniformis 37 на экспериментальных сухих ПО и контрольных средах, отвечали требованиям регламента производства /107/.
Анализ результатов, представленных в таблице 29, показывает, что показатели качества КЖ B.subtilis 3,полученные как на среде № 4, содержащей сухой КГК, так и на регламентной среде, не имели достоверных отличий. Экспериментальные и контрольные ПС № 4 обладали более низкими ростовыми спорообразующими свойствами, чем среда № 5, приготовленная из КГСМ. Наблюдаемое явление связано либо с несбалансированностью среды по основным компонентам, либо с использованием в ее составе КУКа с просроченным сроком хранения. Однако из-за отсутствия возможности замены просроченной серии КУКа на новую, объяснить причину снижения качества среды не удалось.
Тем не менее, нестандартность состава КУКа не оказала столь отрицательного влияния на качество ПС № 7. КЖ B.Ucheniformis 31, полученная на экспериментальной среде № 7 в аппарате и на качалке, имела сходные с контрольной средой показатели качества, не отличающиеся от среднестатистических, полученных на регламентной среде, в разное время.
Поэтому, принимая во внимание удовлетворительные ростовые свойства экспериментальных ПС, можно сказать, что сухие ПО из КГК отвечают питательным потребностям культур B.subtilis 3 и B.Ucheniformis 31 и пригодны для выращивания данных культур в глубинных условиях.
Приготовленные как на экспериментальных средах, содержащих сухой КГК, так и регламентных ПС, КЖ имели требуемые регламентом показатели качества и были использованы в получении контрольных партий биоспорина.
Жидкую рецептурную массу (ЖРМ) контрольных партий препарата готовили согласно регламента производства биоспорина из концентрированных микробных суспензий B.subtilis 3 и B.Ucheniformis 31, полученных с использованием ПС из сухого КГК (ПС №№ 4Э, 7Э).
В стеклянной емкости смешивали расчетное количество КМС культур B.subtilis 3 и B.Ucheniformis Зів таких соотношениях, чтобы количество живых клеток культуры B.subtilis 3 в одной дозе препарата составило (2 3,5) 109 спор см"3, а биологическая концентрация культуры B.licheniformis 31 была равна (0,6-1,2) 109 спор см"3 в одной дозе препарата. К полученной смеси добавляли защитную среду высушивания, состоящую из сахарозо-желатиновои смеси и обрата молока, в количестве 10-15 % от объема микробной суспензии.
Приготовленную ЖРМ тщательно перемешивали, разливали по 2 см во флаконы вместимостью 10 см и лиофильно высушивали. После высушивания качество препарата контролировали по показателям требований ФС.
Характеристики полученных серий биоспорина представлены в таблице 30, где серии №№ 1, 2, 3 были приготовлены с использованием сухих ПО из КГСМ, а серии №№ 4,5,6 - на ПС из сухого КГК.
Как видно из таблицы 30, все экспериментальные серии биоспорина, приготовленные из жидких микробных суспензий культур B.subtilis 3 и B.licheniformis 31, полученных выращиванием в глубинных условиях с использованием сухих ПО (№№ 4Э, 7Э, 5Э, 6Э), отвечают по всем показателям качества требованиям ФС.
Вместе с тем, внешний вид лиофилизированных препаратов несколько отличается более темным оттенком от цвета биоспорина, полученного по традиционной технологии. Так, при растворении сухого препарата суспензия имела коричневый оттенок.
Данный недостаток можно устранить путем изменения соотношения обрата молока и сахарозо-желатиновои смеси в защитной среде высушивания при приготовлении ЖРМ. По своим же биологическим показателям препарат биоспорин, приготовленный на экспериментальных средах, отвечает требованиям ФС и может быть рекомендован для дальнейших клинических исследований и оценки его эффективности в течение гарантированного срока хранения.
Вышеприведенные исследования позволяют рекомендовать к использованию сухие ПО в технологии получения сухого биоспорина.
Обсуждение результатов
Проблема получения высокопродуктивных сухих ПС для промышленного культивирования микроорганизмов до настоящего времени остается актуальной. Это связано, в первую очередь, с тем, что немногочисленные предприятия, производящие питательные основы и среды, в основном производят диагностические и накопительные среды, предназначенные для санитарии и медицины.
Вместе с тем, очевидные преимущества сухих питательных основ и сред (стандартность, удобство применения и транспортировки, стабильность при длительном хранении) неоднократно доказаны на практике.
Наличие в Центре ВТП БЗ мощностей по выпуску биоспорина обусловливают необходимость создания и периодического обновления планового запаса, в том числе ПО. Очевидно, что материалы, из которых формируется данный запас, должны иметь длительный срок хранения и практически не изменять свои свойства в период срока годности.
Для решения этой задачи были отработаны технологии получения сухих ПО методом распыления и создана АТЛ для их производства. В основу технологии обезвоживания гидролизатов был положен метод распылительной сушки в кипящем слое гранул инертного материала. Использование данного метода обусловлено доступностью и относительной дешевизной аппаратурного оформления процесса сушки, а также высокой производительностью и незначительными габаритными размерами распылительной сушильной установки. Метод так же обеспечивает высокую экономичность, незначительные воздействия на продукт при обезвоживании и высокие удельные мощности сушильного оборудования. Как правило, препараты, полученные с использованием конвективного метода сушки, обладают длительным сроком годности, не требуют особых условий хранения и имеют низкую себестоимость.
Таким образом, актуальность работы обусловлена необходимостью получения высокостандартных основ с длительным сроком хранения для производства питательных сред со стабильными ростовыми характеристиками.
Задача получения сухих основ питательных сред, используемых при выпуске биоспорина, является комплексной, т.к. требует решения следующих вопросов: анализа литературы о методах высушивания питательных основ и обоснования выбора технического оснащения аппаратурно-технологической линии производства сухих питательных основ; создания аппаратурно-технологической линии выпуска сухих питательных основ с учетом выбранного и, при необходимости, модернизированного оборудования; выбора режимов высушивания питательных основ, используемых в технологии производства биоспорина; проведения сравнительного изучения свойств сухих питательных основ, полученных различными методами обезвоживания, по физико-химическим свойствам, аминокислотному, минеральному, пептидному составу; проведения комплексного изучения свойств серий биоспорина, полученных на регламентных и экспериментальных питательных основах; изучения условий и сроков хранения сухих питательных основ; оценки безопасности и целесообразности внедрения усовершенствованной технологии; разработки нормативной документации на производство сухих питательных основ с применением конвективной сушки.
На первом этапе исследований была разработана технология получения сухих питательных основ. В ходе решения этой задачи оборудование и АТЛ производства сухих ПО прошли индивидуальные испытания, а также комплексное опробывание. Показано, что вновь монтируемое сушильное и вспомогательное оборудование имеет довольно широкий спектр регулируемых параметров. Поэтому далее необходимо было адаптировать это оборудование для сушки конкретных белковых основ питательных сред, используемых в производстве биоспорина.
По этой причине определили перечень контролируемых параметров процесса сушки и нашли их оптимальные значения для каждой питательной основы.
Проведенные предварительные эксперименты по обезвоживанию питательных основ позволили значительным образом сузить спектр контролируемых параметров, влияющих на высушивание гидролизатов. Так, существующие специфические особенности процесса распылительной сушки на установке УСП-2, заключающиеся в том, что в течение сушки невозможно варьировать массой инертного наполнителя, регулировать скорость подачи теплоносителя, исключили последние из числа управляемых факторов технологического процесса. Кроме того, такой показатель, как температура отработанного воздуха, является зависимым от количества продукта, подаваемого на сушку, что также ограничило число варьируемых факторов.
На основании вышеизложенного были выбраны два основных значимых варьируемых параметра, которые позволяют в полном объеме управлять технологическим процессом сушки на установке УСП-2. К ним следует отнести температуру сушильного агента и скорость подачи препарата на сушку.
Учитывая то, что на сегодняшний день в технологии производства био-спорина для приготовления плотных и жидких питательных сред используют ферментативный гидролизат говяжьего мяса, кислотный гидролизат соевой муки и кислотный гидролизат казеина, полученные различными способами расщепления белка и отличающимися по конечному составу, рассмотрели процесс обезвоживания данных гидролизатов на установке УСП-2 отдельно.
Проведенные предварительные эксперименты показали, что кислотный гидролизат казеина, полученный по регламентной прописи и имеющий водородный показатель меньше 4,0 ед.рН, трудно поддается высушиванию на данной установке, т.к. вызывает слипание инертного материала, что в свою очередь ведет к невозможности дальнейшего проведения процесса сушки. Кроме того, после сушки кислотного гидролизата казеина с таким значением водородного показателя в дальнейшем требуется проводить корректировку его кислотности в готовой питательной среде, при этом выпадает обильный осадок и среду приходится дополнительно фильтровать.
С целью определения оптимального диапазона значений рН в высушиваемом кислотном гидролизате был поставлен ряд опытов по обезвоживанию ПО с различными значениями показателя рН. Результаты экспериментов показали, что оптимальный рН обезвоживаемого гидролизата казеина, с учетом последующей регидратации и приготовления питательной среды, составил 7,0-7,2 ед.рН. Исследования по определению оптимального значения рН ферментативного гидролизата говяжьего мяса показали, что данная основа хорошо высушивается при рН, получаемой в конце процесса гидролиза, и соответствует 7,0-7,5 ед.рН. Кислотный гидролизат соевой муки подщелачивают до значения рН, равного 7,8-8,0 ед.рН, нагревают до кипения и фильтруют через бельтинг. Распылительная сушка питательной основы, подготовленной вышеуказанным способом, не вызывает затруднений.
Далее провели анализ термостойкости образцов ПО с применением метода дифференциальной термогравиметрии. Определили условия эффективного функционирования технологического процесса сушки исследуемых нами гидролизатов.
Оптимальными условиями проведения процесса сушки жидких гидролизатов на установке УСП-2, при температуре теплоносителя 120-125 С явились: для ферментативного гидролизата говяжьего мяса, скорость подачи гидролизата 8-10 дм3 ч" ; кислотного гидролизата соевой муки и кислотного гидролизата казеина, скорость подачи гидролизата 6-8 дм3-ч"\
По установленным оптимальным режимам обезвоживания получили экспериментальные серии распылительно высушенных ПО.
На последующем этапе провели комплексную оценку показателей качества сухих гидролизатов. Для этого сравнивали экспериментальные образцы сухих питательных основ с их аналогами, полученными по регламентной технологии, по физико-химическим и биологическим свойствам. Установили, что в процессе распылительного обезвоживания питательных основ их физико-химические свойства, аминокислотный, пептидный и минеральный состав незначительно отличаются от жидких питательных основ.
Одним из наиболее ответственных и трудоемких этапов исследований, в ходе которых в реальных условиях проверялись ростовые свойства питательных сред на основе сухих ПО, являлось культивирование B.subtilis 3 и B.licheniformis Зів ферментерах вместимостью 0,25 и 0,1 м .
