Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 10
1.1. Современные особенности промышленного животноводства
1.2 Пробиотики, пребиотики и синбиотики 14
1.3 Биотехнологические аспекты получения синбиотиков 31
1.4 Факторы, влияющие на эффективность синбиотиков 40
1.5 Технология изготовления про- и пребиотиков 41
1.6 Оборудование - современные тенденции 45
1.7 Заключение по обзору литературы 46
2 Собственные исследования 48
2.1 Материалы и методы 48
2.2 Результаты исследований 57
2.2.1 Технология изготовления препаратов 57
Бесклеточный пробиотик на основе L. Plantarum и В. subtilis,
2.2.1 Л концентрированная бактериальная масса пробиотических бактерий
Пребиотик и биологически активная добавка из чебного гриба F. sambucinum MKF-2001-3
2 Аппаратурное оформление технологической линии изготовления препаратов в малоотходном цикле
Характеристика состава и показатели качества препаратов
2.2.2.1 Бесклеточный пробиотик 94
2.2.2.2 Пребиотик 95
2.2.2.3 Биологически активная добавка 98
Рецептуры синбиотиков и их эффективность для молодняка птицы и крупного рогатого скота
1 Рецептуры синбиотиков 99
Эффективность синбиотика № 1 для молодняка птицы и крупного рогатого скота
Эффективность синбиотика №2 для молодняка птицы и крупного рогатого скота
Обсуждение результатов 104
Выводы по практические предложения 112
Список литературы 113
- Пробиотики, пребиотики и синбиотики
- Технология изготовления про- и пребиотиков
- Технология изготовления препаратов
- Эффективность синбиотика № 1 для молодняка птицы и крупного рогатого скота
Введение к работе
1.1. Актуальность темы. В настоящее время интенсивно развивается такое направление экобиотехнологии, как разработка и использование в практике пробиотиков, пребиотиков и синбиотиков (Kailasapathy K., 2000; Oggioni M.R., et al., 2003; Ouwe- hend A.C., 2003; Малик Н.И. с соавт., 2009; Субботин В.В., Данилевская Н.В., 2009; Панин А.Н. с соавт., 2011). Эти лечебно-профилактические и ростостимули- рующие экологически безопасные препараты (Ishibashi N., 2001; Егоров И. А. с соавт., 2011) способствуют снижению техногенной и микробиологической нагрузки на организм животного в условиях интенсивного современного промышленного животноводства и птицеводства (Федоров Ю. Н., 2005; Hong H.A., 2005; Смоленский В.И., 2007; Джавадов Э.Д., 2010; Kaminska M.V., 2010; Фисинин В.И., 2011).
В области пробиотических лечебных препаратов и пищевых продуктов активно разрабатываются бесклеточные пробиотики (метаболитного типа), которые по сравнению с клеточной формой более стабильны при хранении, не снижают свою биологическую активность при применении на фоне лечебного курса антибиотиков, не оказывают побочных действий на организм человека, в отличие от живых микроорганизмов, способных в ряде случаев вызывать и/или усиливать инфекционные и воспалительные процессы (Михайлова Н.А. с соавт., 1998; Сорокина Ю.В., 2012). Культуральная жидкость (основа бесклеточной формы пробиотика) - побочный продукт в традиционной технологии производства бактерийных препаратов или концентратов. Его утилизация, как отхода производства, приводит к значительным экономическим потерям и загрязнению окружающей среды. Поэтому разработка и производство бесклеточных пробиотиков - один из этапов создания безотходного производства бактерийных препаратов. Для агропромышленного комплекса России это направление является инновационным (Волков М.Ю. с соавт., 2007; Красочко П.А. с соавт., 2009).
Синбиотики - научно обоснованный комплекс про- и пребиотиков (Бондаренко В.М., 2003; Earll A.M., 2006; Glebocka К., 2008; Фисинин В. И. с соавт., 2008; Ноздрин Г.А. с соавт., 2009) - при малых расходах (от 0,2 до 5 кг на тонну корма) физиологически активны, безопасны для животных, технологичны в производстве и применении (Грязнева Т. Н., 2005; Шендеров Б.А., 2005; Римарева Л.В. с соавт., 2008; Тихонов И.В., 2010; Воробьева Г.И. с соавт., 2010). Их можно производить по унифицированным малоотходным технологиям на гибких технологических линиях, тиражированных и размещенных в непосредственной близости к потребителю (Кантере В.М., 1991; Бирюков В.В., 2004; Самуйленко А.Я. с соавт., 2009).
Разработка таких технологий является одним из перспективных направлений развития биотехнологии для АПК РФ.
Во ВНИТИБП накоплен значительный опыт разработки состава и технологии производства синбиотических комплексов для птицеводства и коневодства (Неминущая Л.А., 2011; Самуйленко А.Я. с соавт., 2012). Синбиотики необходимо разрабатывать с учетом специфики систем пищеварения, способов кормления и т.д. для каждого вида сельскохозяйственных животных.
В связи с вышеизложенным представляются актуальными исследования, направленные на разработку малоотходной технологии производства новых препаратов пробиотиков и пребиотиков и создание на их основе биологически активных комплексов (синбиотиков) для животноводства и птицеводства.
Цель и задачи исследований. Цель исследований заключалась в разработке технологии производства бесклеточного пробиотика из лакто- и спорообразующих бактерий, пребиотика и биологически активной добавки из высшего лечебного гриба, создании на их основе новых синбиотиков и оценке их эффективности в АПК РФ (животноводстве и птицеводстве).
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
разработать технологию производства бесклеточного пробиотика на основе бактерий Lactobacillus plantarum и Bacillus subtilis и препаратов из концентрированных бактериальных масс пробиотических бактерий L. plantarum и B. subtilis;
разработать технологию производства препаратов из высшего лечебного гриба (ВЛГ) Fusarium sambucinum (пребиотика и БАД);
экспериментально обосновать возможность малоотходной технологии производства препаратов, входящих в состав синбиотиков;
разработать аппаратурное оформление и методику расчета технологической линии изготовления препаратов;
разработать режимы сублимационного высушивания концентрированной бактериальной массы пробиотических бактерий L. plantarum и B. subtilis;
определить эффективные условия проведения распылительного высушивания биомассы гриба;
изготовить опытные партии препаратов (бесклеточный пробиотик, пребио- тик и БАД) и провести их доклинические исследования;
разработать рецептуры синбиотиков и исследовать их эффективность для крупного рогатого скота (КРС) и птицы.
Научная новизна работы. Научно обоснована и разработана технология производства новых препаратов (комплексный бесклеточный пробиотик, препараты из концентрированной бактериальной массы пробиотических бактерий, пребиотик и БАД из высшего лечебного гриба), обеспечивающая возможность осуществления малоотходного цикла.
Исследованы физико-химические и биологические свойства разработанных препаратов, установлены показатели и количественные характеристики их безопасности и активности. Обоснована целесообразность применения бесклеточной формы пробиотиков в зависимости от объекта (особенности строения желудочно-кишечного тракта различных видов животных), способа (выпаивание) и условий (на фоне антибиотикотерапии) их применения.
Определены параметры культивирования бактерий L. plantarum и состав питательной среды. Разработан режим сублимационного высушивания концентрированной бактериальной массы (КБМ) лактобактерий. Впервые для про- и пребио- тиков разработана методика расчета технологической линии их производства.
Разработана рецептура новых синбиотиков (бесклеточный пробиотик + пребиотик и бесклеточный пробиотик + БАД), показана возможность их использования в качестве биологически активных кормовых добавок.
Установлена эффективность применения синбиотиков для молодняка птицы и КРС, обусловленная защитой животных при стрессовых ситуациях (вакцинация, переход на другой вид корма и др.), повышением продуктивности, усвояемости кормов, нормализацией микрофлоры желудочно-кишечного тракта.
Подана заявка № 2013100187 от 10.01.2013 на выдачу патента РФ «Биологически активный комплекс на основе бесклеточного пробиотика, кормовая композиция, его содержащая, и способ кормления молодняка сельскохозяйственных животных и птицы».
Практическая значимость работы. Разработанная малоотходная технология производства новых препаратов апробирована и внедрена на опытном производстве ВНИТИБП. В доклинических исследованиях показана безопасность и эффективность опытных серий препаратов. С учетом требований Правил GMP разработана и утверждена директором ВНИТИБП нормативная документация: на препараты - технологические регламенты и проекты стандартов организации (СТО); на синбиотики - проекты инструкций по применению.
Разработаны и предложены для практического использования в животноводстве и птицеводстве новые синбиотики, применение которых способствует повышению продуктивности животных и птицы, обеспечению гарантии качества, биологической и экологической безопасности как самой продукции, так и процесса ее производства.
Экономический эффект от применения новых синбиотиков составил при выращивании бройлеров 7,862 тыс.руб. (в расчете на 1000 голов), при выращивании телят - 111,83 рубля на 1 теленка.
Результаты исследований положены в основу разработки четырех Методических положений, утвержденных Россельхозакадемией в установленном порядке: по обоснованию режимов сублимационного высушивания пробиотических препаратов; по расчету технологических линий производства пробиотических и симбио- тических препаратов; по применению компьютерной программы Microsoft Office VISIO 2010 для построения технологических схем; по применению пакета Microsoft Office EXCEL 2010 для построения сложных технологических графиков (на примере процесса сублимационного высушивания препаратов-пробиотиков).
Полученные экспериментальные данные использованы для обоснования разработанной во ВНИТИБП и одобренной Президиумом Россельхозакадемии (протокол №4 от 21.04.2011) «Концепции научного обеспечения создания и развития региональных биологических предприятий по производству препаратов для защиты животных, растений и средств, повышающих эффективность функционирования агропромышленного комплекса Российской Федерации», а также в лекционном материале курсов повышения квалификации специалистов птицеводческих предприятий «Новые технологии и пути повышения эффективности производства мяса бройлеров» (ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии, г.Сергиев Посад, 2012г.).
Основные положения работы, выносимые на защиту:
технология производства бесклеточного пробиотика из L. plantarum и B. subtilis, КБМ пробиотических бактерий, препаратов из высшего лечебного гриба (пребиотика и БАД);
аппаратурное оформление технологической линии производства препаратов в малоотходном цикле;
режимы сублимационного высушивания КБМ пробиотических бактерий и распылительного высушивания БАД;
характеристика состава и показатели качества опытных партий препаратов (бесклеточный пробиотик, пребиотик и БАД);
рецептуры синбиотиков на основе этих препаратов;
эффективность синбиотиков для молодняка птицы и КРС.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы работ проводились совместно с научными сотрудниками отдела обеспечения качества лекарственных средств (ЛС) для животных, отдела технологии сушки биопрепаратов, отдела противобактерийных препаратов ВНИТИБП.
Апробация результатов работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены: в виде ежегодных отчетов по темам госзаданий на Ученом совете и методической комиссии ВНИТИБП (2008-2012гг.); на Отделении ветеринарной медицины Россельхозакадемии (2011,2012 гг.); на семи Международных конференциях, проводившихся в Москве, Покрове, Щелково, Казани, Тюмени, Саратове (2008-2013 гг.).
Публикация научных исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 15 научных работ, в том числе 7 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 172 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, предложений для практики, списка литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 21 таблицей и 18 рисунками. Список использованной литературы содержит 182 источника, в том числе - 52 иностранных авторов.
Благодарности. Автор выражает благодарность директору ВНИТИБП, академику РАСХН А.Я. Самуйленко; научному руководителю Л.А. Неминущей и научному консультанту А.А. Нежуте, а также за оказанную практическую и консультативную помощь сотрудникам ВНИТИБП Э.Ф. Токарик, Г.И. Воробьевой, Т.А. Скотниковой, А.И. Албулову, Е.П. Сапегиной, Е.Э. Школьникову, И.В. Павленко, А.А. Раевскому, Ю.Д. Фролову, Т.А. Авдеевой, В.Н. Егоровой, А.В.Захарову, сотрудникам ВНИТИП (г.Сергиев Посад) В.Г. Шолю, И.П. Салеевой, А.В. Иванову и Института экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского» (Беларусь, г. Минск) П.А. Красочко.
Пробиотики, пребиотики и синбиотики
Обеспечение продовольственной и биологической безопасности страны является основной задачей АПК на современном этапе, что делает актуальными научные разработки, направленные на ее решение [77, 87, 138, 140].
В настоящее время организм человека и животных подвергается воздействию целого комплекса неблагоприятных факторов, влияющих на нормальное функционирование основных систем жизнедеятельности, среди которых влияние ухудшающейся экологической обстановки, увеличение количества стрессовых ситуаций, массовое бесконтрольное применение химиоте-рапевтических препаратов, в том числе и антибиотиков [51, 56, 74, 132, 141].
При профилактике болезней сельскохозяйственных животных и птицы необходимо учитывать : - наличие комплекса инфекций в хозяйствах, на фоне которого борьба с отдельно взятой инфекцией становится неэффективной за счет снижения общего иммунного статуса организма животных [47]; - в условиях интенсивного промышленного ведения животноводства повышается роль болезней, обусловленных условно-патогенной микрофлорой и ассоциациями возбудителей [91,92]; - большая концентрация животных создает благоприятные условия для быстрого перезаражения, при этом изменяется значение различных факторов передачи возбудителей от зараженных животных к восприимчивым [53, 73, 103,174,177, 181]; - неблагоприятные экологические факторы, недоброкачественные корма и несбалансированное кормление, плохое содержание животных приводят к резкому ухудшению качества продукции (мяса, молока, яиц) и несоответствию ее требованиям ФАО и ВОЗ [5, 6, 30, 73, 147, 149, 154, 155].
Интенсивный характер современных технологий выращивания сельскохозяйственных животных и птицы оказывает негативное влияние на микроэкологию желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), изменяя эволюционно сложившуюся в условиях свободного выгула структуру кишечного микробиотипа. Это служит одной из причин появления и распространения дисбак-териозов животных и птицы, стратегия и тактика терапии и профилактики ю которых с помощью только антибактериальных средств не всегда эффективна и безопасна.
Одним из современных подходов к решению проблемы является разработка, производство и применение новых экологически безопасных эффективных препаратов, способных обеспечить биологическую защиту животных [5,27,90,103,158,160-163]. Такие препараты должны обеспечивать: - повышение физиологического и иммунного статуса организма животных; - лечение и профилактику заболеваний молодняка и взрослых особей за счет защиты от патогенных и условно-патогенных возбудителей болезней ЖКТ; - компенсацию в рационе кормления дефицита аминокислот, витаминов и микроэлементов, а также повышение степени усвоения кормов; - токсико- и радиопротективного действие, снижающее влияние неблагоприятных экологических факторов (загрязнения окружающей среды нитратами, пестицидами, гербицидами, тяжелыми металлами и радионуклидами); - повышение эффективности вакцинопрофилактики инфекций при ее использовании в комплексе оздоровительных мер; - качество и безопасность продукции.
Это обусловило интенсивное развитие экобиотехнологащ в частности направление, связанное с разработкой и применением пробиотиков, пребиоти-ков и синбиотиков, как в здравоохранении, так и в ветеринарии [30, 46, 101, 107, 116, 123, 151-153, 159]. Такие лечебно-профилактические и ростости-мулирующие экологически чистые препараты физиологичны по своему действию, безвредны для животных, просты в наработке, дешевы, технологичны для группового применения, что особенно актуально для отечественного птицеводства, занимающего передовые позиции в АПК.
Современные особенности промышленного животноводства, В промышленном производстве необходимо создавать такие условия содержания животных и птицы, чтобы обеспечить полную реализацию ее генетических возможностей. Как наиболее важные факторы, влияющие на эф фективность отрасли, в настоящее время выделяют эпизоотическую ситуацию в хозяйстве, наличие и уровень стрессов, режимы кормления и поения.
Среди причин отхода животных и птицы, и в первую очередь молодняка, основное место занимают болезни, связанные с нарушением функций желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). На предприятиях с высокой концентрацией поголовья они являются основной причиной гибели молодняка. Сдвиги в количественном и качественном составе нормальной и условно-патогенной микрофлоры приводят к дисбактериозу, снижению усвояемости питательных веществ корма и, как следствие, к диарее и падежу [11, 42, 84, 116, 167].
Чаще всего этиологических факторов болезни несколько - ассоциация патогенов может быть представлена вирусами, бактериями, патогенными грибами, простейшими и другими паразитами в различных сочетаниях.
В большинстве случаев инфекционные болезни протекают в латентной и субклинической формах [11, 13]. Это явление приобрело массовый, эпизоотический характер и негативно влияет на течение ассоциированных инфекций, вызывает обострение разнообразных сопутствующих патологических процессов. Протекание заболевания в ассоциативной и смешанной формах затушевывает истинные причины болезни и усложняет эпизоотическую ситуацию.
В этом процессе также велика роль условно-патогенных микроорганизмов. К условно-патогенным относятся микроорганизмы, которые секретиру-ют суперантигены, постоянно присутствующие в условиях промышленнго содержания животных, ослабляют их иммунную систему, не вызывая при этом клинических признаков заболевания. Вследствие этого заболевания, вызываемые другими патогенами, протекают на фоне извращенного иммунного ответа и аутоаллергических реакций, что значительно осложняет их течение [78, 81, 84, 164-166]. Условно-патогенные микроорганизмы характеризуются многочисленностью, гетерогенностью популяций, участием в разных микробиоценозах. Гетерогенность выражена в устойчивости к антибиотикам, де-зинфектантам и физическим факторам, создаёт сложности при идентификации выделенных культур. Кроме того, популяции не только гетерогенны, но и изменчивы. В процессе проведения лечебно-профилактических мероприятий устойчивые варианты переходят в множественно устойчивые.
Технология изготовления про- и пребиотиков
Разрабатываемые препараты имеют микробиологическую природу, поэтому процесс их изготовления является типовым для микробиологических производств и подчиняется общей технологической схеме, которая складывается из подготовительных и вспомогательных работ, а также основных технологических процессов. Подготовительные работы (ПР) включали подготовку воздуха, помещений, оборудования, одежды, посуды, инструментов, материалов для укупоривания (пробки, колпачки) и этикетирования (этикетки). Вспомогательные работы (ВР) - получение посевной серии, приготовление ростовых и селективных сред, вспомогательных растворов. Основной технологический процесс (ТП) состоял из этапов приготовления питательной среды, культивирования бактерий в реакторе, фасования, сублимационного высушивания (в случае получения сухой формы), укупоривания и этикетирования препарата. Качество препарата в процессе производства обеспечивали системой технологического контроля, качество готового контролировали по показателям, определенным при изготовлении посевных серий. Для разработки схемы контроля определяли контрольные точки (КТ), контролируемые в этих точках показатели, их допустимые интервалы и методы определения.
Для минимизации риска загрязнения продукта посторонними микроорганизмами, механическими частицами и химическими веществами производственные помещения охарактеризованы по классам чистоты в зависимости от характера технологических процессов (табл. 5).
Определены требования к качеству исходных материалов и полупродуктов, безопасности производства и охране окружающей среды. С целью унификации процесса культивирования штаммов-продуцентов и повышения его эффективности нами исследована возможность культивирования микроорганизмов с использованием питательной среды на основе молочной сыворотки. Таблица 5 Перечень технологических операций, осуществляемых в помещениях разных классов чистоты
Работа со стерильным материалом. Культивирование.Сборка стерилизующих фильтров и съемных узлов оборудования. Отбор проб стерильного продукта Стерилизующая фильтрация растворов. Сублимационное высушивание. Укупоривание.Хранение стерильных материалов первичной упаковки.Выгрузка после стерилизации и хранение стерильной технологической одежды, питательных сред, посуды и инструментов
С 100 Приготовление и префильтрация растворов. Разборка и мойка стерилизующих фильтров. Стерилизующая фильтрация дезинфиц. растворов.Подготовка одежды, инструментов и посуды к стерилизации.
Штаммы пробиотических бактерий L. plantarum, штамм 8РАЗ (ВКПМ № В-11007) и В. subtilis, штамм М-8 (ВКПМ № В-1948), депонированные во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика, в дополнение к паспортным данным характеризовали по величине антагонистической активности (АнтА) в отношении патогенных микроорганизмов ЖКТ (штаммы Е. coli К-88, К-99, А-20Е и сальмонелл S. typhimurium, S. dublin, S. gallinarum). Установлен выраженный антагонизм штаммов бактерий в отношении патогенных микроорганизмов (Биргер О.М., 1982), причем штамм В. subtilis обладает более высокой АнтА, чем лактобак-терии: зона задержки роста эшерихий и сальмонелл - не менее 10 мм для L. plantarum и не менее не менее 15 мм для В. subtilis (рис. 5).
Для штаммов определены: чувствительность бактерий к действию желудочного сока и желчи; антагонистическая активность (АнтА) в отношении патогенных микроорганизмов как основная характеристика пробиотической активности; резистентность к действию часто применяемых в птицехозяйст-вах антибиотиков.
Лактобактерии данного штамма устойчивы к воздействию желчи и несколько меньше - желудочного сока. Снижение концентрации живых бактерий по сравнению с исходным значением составило (0,6 0,2) Ig КОЕ/см3 и (1,7±0,3) lg КОЕ/см3 соответственно (п=5). При определении АнтА в опытах in vitro (п=10) установлен (см. рис.5) выраженный антагонизм штамма в отношении патогенных микроорганизмов. Показано (п=4), что лактобактерии высокочувствительны (диаметр зоны ЗР 25мм) к кламоксилу, левомицети-ну, тетрациклину, цефазолину, ампициллину и рифампицину; чувствительны (15-25 мм) к гентамицину; умеренно чувствительны (11-15мм) к офлоксаци-ну, ципрофлоксацину, энрофлону, линкомицину и флавомицину (см. рис. 6).
Для характеристики безопасности штамма в опытах на белых мышах исследованы: безвредность (при введении per os дозы 10 и 50x109 КОЕ/0,5см3), возможная вирулентность (при введении внутрибрюшинно суспензии живых бактерий в дозе 5 и 10x109 КОЕ/0,5см3), токсичность (при введении внутрибрюшинно суспензии инактивированных бактерий в дозе 1,0 и 2,0x109 КОЕ/0,5см ) и токсигенность (при введении в/б 0,5 и 1,0 см культуральной жидкости). Установлено, что за весь период наблюдения (5 суток) животные (по 20 голов в группе) были клинически здоровы, активны, их поведенческие реакции не изменялись.
Определена концентрация бактерий B.subtilis после контакта с желудоч-ным соком и желчью, которая составила (8,6±0,3) lg КОЕ/см и (7,8±0,2) Ig КОЕ/см3 соответственно при исходном значении (9,1±0,3) lg КОЕ/см , что свидетельствовало об устойчивости к желудочному соку и не сколько большей чувствительности к желчи. При исследовании АнтА in vitro (п=10) установлено (рис.5), что штамм обладает выраженным антагонизмом в отношении патогенных микроорганизмов, превышающим по величине аналогичные значения АнтА для лактобактерий. Бактерии B.subtilis более устойчивы к действию антибиотиков по сравнению с лактобактериями (рис.6).
Антибиогикорезистентность бактерий-пробиотиков. Изготовление препаратов включало следующие этапы: раздельное культивирование бактерий, отделение культуральной жидкости от бактериальной массы, смешивание культуральных жидкостей, смешивание концентрированных бактериальных масс пробиотических бактерий с защитной средой обезжиренное молоко (ОМ) и последующее сублимационное высушивание. Технологическая схема основных стадий изготовления препаратов приведена на рис.7.
Культивирование бактерий,
Для культивирования бактерий L. plantarum, штамм 8РАЗ, согласно данных паспорта ВКПМ, применяется среда MRS, имеющая высокую стоимость. Нами проведены исследования и показана возможность замены среды MRS питательной средой на основе молочной сыворотки (МС), разработанной ранее во ВНИТИБП для культивирования L. acidophilus, шт. 1К: накопление клеток было одинаковым для обеих сред и составляло, в среднем, 5,0х109КОЕ/см3, однако среда МС была в 3-4 раза дешевле (см. табл.6).
Технология изготовления препаратов
Исследования, изложенные в разделе 2.2.2, использованы при разработке проектов стандартов организации на препараты (Приложение П.2). Результаты контроля опытных серий по всем показателям соответствовали установленным для них нормам, что свидетельствует о воспроизводимости разработанной технологии.
Рецептуры синбиотических комплексов. Синбиотик №1 включает бесклеточный пробиотик и пребиотик. При-мененияе этого комплекса предусматривает выпаивание препаратов при их смешивании с питьевой водой и/или другими жидкостями.
Жидкая форма про- и пребиотика обеспечивает возможность их выпаивания с питьевой водой и/или другими жидкостями, которое является более технологичным способом по сравнению со скармливанием, а для новорожденных животных - единственно возможным. Синбиотик №2 включает жидкий бесклеточный пробиотик и сухую биологически активную добавку. Применения этого комплекса предусматривает выпаивание жидкого пробиотического препарата при смешивании его с питьевой водой и/или другими жидкостями и скармливание сухой биологически активной добавки при смешивании ее с кормом.
Бесклеточная форма пробиотика обеспечивает высокую биологическую активность по сравнению с менее стабильной клеточной формой, позволяет применять его на фоне лечебного курса антибиотиков без снижения его про-биотической активности из-за чувствительности пробиотических бактерий к антибиотикам, а при применении животным с многокамерным строением желудка (например, КРС) избежать снижения пробиотической активности за счет процесса дезактивации живых микроорганизмов при их прохождении через верхние отделы желудочно-кишечного тракта.
Жидкая форма про- и пребиотика обеспечивает возможность их выпаивания с питьевой водой и/или другими жидкостями, которое является более технологичным способом по сравнению со скармливанием, а для новорожденных животных - единственно возможным. Добавление сухой биологически активной добавки в корм обеспечивает повышение физиологического статуса животных при стрессовых ситуациях (вакцинация, переход на другой вид корма и др.).
Синбиотики (пробиотик + пребиотик или пробиотик + биологически активная добавка), действие которых базируется на усилении полезных свойств препаратов при их совместном использовании, применяли молодняку сельскохозяйственных животных и птице без предварительного смешивания препаратов, а способом непосредственного внесения каждого препарата в корм или питьевую воду в дозах, зависящих от вида и возраста животных.
Эффективность ышбиотика МІ для молодняка птицы и крупного рогатого скота. Эффективность применения синбитика определяли при выращивании цыплят-бройлеров кросса «Кобб-500». В производственных испытаниях (по 105 голов в группе) определяли эффективность двух схем применения комплекса: однократно в 1-7 дни (1 вариант) и двукратно в 1-7 и 21-28 дни (2 вариант). Дозировка препаратов одинакова для двух вариантов: по ОД см3 каж 100 дого препарата на голову с питьевой водой. Лучший результат получен для варианта 2 (табл. 19): по сравнению с контролем сохранность цыплят выше на 3,8%, затраты корма ниже на 3,8%, европейский индекс продуктивности (ЕИП) выше на 25 единиц.
Из представленных в таблице данных видно, что использование комплекса препаратов позволяет при использовании препаратов дополнительно получить среднесуточный прирост живой массы 160 г, получить дополнительно мясной продукции на 10,6 кг на голову.
Эффективность синбиотика №2 для молодняка птицы и крупного рогатого скота. Влияние синбиотика (бесклеточный пробиотик и биологически активная добавка) на эффективность вакцинации птицы против ныокаслской болезни (НБ) исследовали при выращивании ремонтного молодняка. Определяли влияние комплекса на динамику роста живой массы птицы (2000 голов) после плановой вакцинации против ЕБ (в возрасте 14 дней). Цыплятам-бройлерам препараты задавали, начиная с суточного возраста ежедневно двумя циклами (в 1-7 и 21-28 дни), в следующих дозах - пробиотик по ОД см3 на голову в сутки с питьевой водой, биологически активная добавка - 1,5 % от суточного рациона корма Применение синбиотика улучшало (Р 0,05) динамику увеличения живой массы вакцинированной птицы (табл. 21).
Эффективность применения комплекса пробиотика и биологически активной добавки исследовали на телятах при переводе с молочного питания на растительные корма. По принципу аналогов были сформированы 2 группы телят в возрасте 30 суток по 50 голов в группе. Телятам опытной группы препараты комплекса применяли в первый - третий дни при переводе с молочного питания на растительные корма в дозах : пробиотика - по 5,0 см3 на
Из представленных в таблице данных видно, что использование комплекса позволяет дополнительно получить среднесуточный прирост живой массы от 90 до 134 г, мясной продукции от 5,7 до 8,7 кг на голову, повысить бактерицидную активность сыворотки крови на 9,3 - 12,8%, лизоцим-ную активность на 1,1 - 1,7 мкг/мл.
Таким образом, использование синбиотического комплекса значительно повышает прирост живой массы телят при переходе на другой тип кормления.
Результаты, изложенные в разделе 2.2,3, использованы при разработке проектов инструкций по применению синбиотических комплексов (Приложение П.2).
Главным направлением биотехнологии в сельском хозяйстве является создание технологических процессов, новых штаммов микроорганизмов и лечебно-профилактических препаратов с помощью микробиологических, биохимических и молекулярно-генетических методов [101, 111, 114 161, 162, 171,172].
Разработка и внедрение в практику медицины и ветеринарии новых высокоэффективных отечественных препаратов для лечения и профилактики болезней ЖКТ является актуальной задачей. Анализ современной информации подтвердил, что про- пре- и синбиотики относятся к числу наиболее эффективных лечебно-профилактических средств [52, 69, 98, 134, 135, 145, 157, 179, 182].
Увеличение циркуляции антибиотикорезистентных штаммов различных возбудителей, нежелательные побочные эффекты от проводимой этиотроп-пой терапии делают поиск поиск штаммов пробиотических бактерий с широким спектром АнтА весьма перспективным для конструирования пробиотических продуктов с известным механизмом бактерицидного действия в отношении патогенных микроорганизмов [31, 37, 97, 126]. При выборе производственных штаммов лактобактерий особое внимание следует уделять L. acidophilum, L. plantarum и L. helveticum, так как именно они преобладают в кишечном содержимом телят, поросят, собак и птицы [92, 96]. Показано, что максимальной антагонистической активностью обладал штамм L. plantarum 8Р-АЗ. Нами также установлена высокая АнтА штамма L. plantarum 8РАЗ, который и был использован в качестве составляющей при производстве бесклеточного пробиотика.
В наших исследованиях показано, что пробиотик на основе комплекса Lactobacillus и В. subtilis обладает большей антагонистической активностью, чем соответствующие монопрепараты. Многие авторы [5, 33, 95, 102, 124, 176] считают направление работ по созданию комплексных пробиотиков весьма перспективными. Пробиотики, принадлежащие к разным видам и штаммам бактерий, по-разному влияют на иммунологические процессы.
Препарат Споролакт создан с учетом различий в механизме и спектре действия бактерий В. subtilis и Lactobacillus. Показано высокое лечебное действие препарата для телят 10-14-дневного возраста, зараженных суспензией патогенных культур эшерихий и протея, которое выражалось в подавлении роста патогенных микроорганизмов и в восстановлении нормальной микрофлоры ЖКТ. Комплексный препарат Бактоцеллолактин (жидкий) эффективен при различных формах эндометрита (терапевтический эффект - 90-95%), мастита (терапевтический эффект - 75 и 100% при клиническом и скрытом течении заболевания соответственно) коров и диспепсии телят (терапевтический эффект-90%) при отсутствии негативного влияния иа физиологическое состояние животных. Препарат Субтикол (на основе взаимодополняющих друг друга колибактерина и биоспорина) обладает более широким спектром АнтА (по сравнению с колибактерипом и биоспорином) и высокой адгезив-ностыо к слизистым различных отделов кишечника.
Эффективность синбиотика № 1 для молодняка птицы и крупного рогатого скота
Анализ данных, полученных в ходе наших исследований, позволяет аргументировать целесообразность использования супернатаитов, получаемых в процессе глубинного культивирования пробиотических бактерий, для создания на их основе метаболитных пробиотиков нового поколения. Одним из перспективных технологических приемов данного направления является направленное выделение из КЖ метаболитных комплексов заданного состава [71].
Актуальность разработки и использования бесклеточных пробиотиков тесно связана с другим современным аспектом применения пробиотиков - их безопасностью [180]. Учитывая стремительный рост рынка пробиотиков и микробных кормовых добавок и расширение спектра применяемых живых микроорганизмов, получивших возможность свободной интродукции в окружающую среду, безопасность принимает глобальный характер и является неотъемлемой частью системы биобезопасности внутреннего рынка животноводческой продукции в охране здоровья животных и человека (цит. по [78]). В настоящее время оценка биобезопасности микроорганизмов, используемых в биотехнологии производства пищевых продуктов, пробиотических лекарственных средств и микробных добавок, считается ключевым вопросом при получении разрешения для выхода на рынок. Рассмотрев вопрос о гармонизации подходов к оценке безопасности живых микроорганизмов, Научный Комитет Европы по кормам для животных (Recently the Scientific Committee on Animal Nutrition - SCAN) считает, что широкая интродукция потенциально патогенной микрофлоры может вызвать серьезные побочные эффекты инфекционного характера, и поэтому, рассмотрев возможность использования микробных добавок из апатогенных штаммов микроорганизмов, например апатогенных вариантов E.coli, не рекомендует такого рода микробные добавки в кормлении животных. По мнению Ы.А. Зигаигирова мясные и молочные продукты могут быть источником генов антибиотикорезистеитно-сти среди здорового населения, благодаря тому, что молочнокислые бактерии вследствие своего повсеместного распространения могут выступать в роли универсальных векторов для передачи этих генов другим бактериям, включая возбудителей пищевых инфекций и энтеропатогенные бактерии [37].
Технологическая схема производства пробиотиков и пребиотиков включает основные стадии, обеспечивающие их качество: изготовление и контроль питательных сред и посевного материала; культивирование микроорганизмов; получения готовой формы препаратов; контроль качества согласно нормативной документации, упаковка, маркировка и хранение [88].
При разработке технологии производства препаратов мы уделили внимание такому важному экологическому аспекту, как использование при культивировании микроорганизмов универсальной питательной среды на основе молочной сыворотки - отхода переработки молока. Одним из факторов успешного производства препаратов пробиотических бактерий в промышленности является правильно подобранная питательная среда. Культивирование бактерий на стандартных ПС чрезвычайно дорого; более доступной средой является молочная сыворотка - отход молочной промышленности, утилизация которого является актуальной экологической и экономической проблемой. Поскольку молоко не является естественной средой обитания бактерий, в среду для культивирования вводят дополнительные вещества, стимулирующие их рост [30]. В наших исследованиях показана возможность использования питательной среды на основе молочной сыворотки в качестве универсальной при культивировании как пробиотических бактерий, так и мицелиального гриба, что существенно упрощает и удешевляет технологический процесс.
Перспектива использования продуктов переработки мицелиального гриба в качестве пребиогика и БАД, установленная в работе, подтверждается опытом отечественных и зарубежных разработок [25]. Грибы являются богатыми источниками минеральных веществ, провитаминов А и D, витаминов группы В: тиамина, рибофлавина, В12, витамина И, а также витамина F - эс-сенциальных ненасыщенных жирных кислот, арахидоновой кислоты - предшественника простагландинов Е и F, лейкотриенов - фосфолипидов и убихи-нопов (коферментов) Q3, Q6, Q10, полисахаридов, липолитических, протеаз-ных, коллагеназпых и других ферментов . Как показывают исследования, в грибах содержится большое число невитаминных факторов, которые защищают человека от болезней. Многие из этих веществ, называемых фитонут-риентами, оказались способными замедлять и останавливать некоторые патологические процессы, обусловленные потерей иммунитета. Это связано с тем, что субстанции из грибов способны активизировать работу иммунной системы. Совместно с ведущими научными коллективами бывшего СССР были проведены исследования штаммов грибов с ценными фармакологическими свойствами. Институтом питания АМН СССР были проверены ряд штаммов на показатели безвредности в соответствии с требованиями Всемирной организации здравоохранения. В ООО «Гелла-Фарма» разработана технологию и организовано промышленное производство БАД нового поколения на основе экстрактов мицелиальных грибов Fusarium sambucinum [24].
В результате проведенных исследований разработан режим сублимационного высушивания концентрированной бактериальной массы (КБМ) лак-тобактерий с защитной средой обезжиренное молоко.
Результаты определения влияния режимных и технологических параметров сублимационного высушивания КБМ лактобактерий на качественные и количественные характеристики продукта показали необходимость планирования и реализации дальнейших экспериментов. Это особенно актуально в плане моделирования влияния режимов замораживания-высушивания на выживаемость бактерий и их стабильность в проиессе хранения, поскольку в наших исследованиях реализация дробного факторного эксперимента показала, что для у3 (снижение титра после сушки) Fp = FKp = 2,54, то есть при заданной доверительной вероятности гипотезы Р = 95% принятая нами модель находится на границе адекватности.
