Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Промышленное культивирование бази диомицета pleurotus ostreatus (fr.) kumm. медико биологические свойства препаратов из базиди альных грибов 25
1.1. Промышленное культивирование базидиомицета Pleurotus ostreatus 25
1.2. Направления по совершенствованию технологии промышленного культивирования мицелия Pleurotus ostreatus в глубинной культуре 45
1.3. Медико-биологические свойства препаратов на основе базидиаль-ных грибов Pleurotus ostreatus 50
1.4. Обоснование направлений по разработке и созданию препарата на основе экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 84
1.5. Формулировка проблемы исследования 91
ГЛАВА 2. Разработка технологии двухстадийного промышленного культивирования мицелия pleurotus ostreatus 1137 в системе: «ротационная качалка (инокулятор) - ферментер с механическим переме шиванием среды» 96
2.1. Постановка цели и задач исследования 96
2.2. Экспериментальные исследования двухстадийного глубинного культивирования мицелия в системе «ротационная качалка (инокулятор) - ферментер с механическим перемешиванием среды» 97
2.2.1. Материалы и методы исследования 97
2.2.2. Результаты культивирования и экстракции мицелия вешенки .. 112
2.3. Химический состав экстракта мицелия вешенки 123
2.3.1. Материалы и методы исследования 123
2.3.2. Результаты определения химического состава экстракта мицелия вешенки
2.4. Технология промышленного двухстадийного глубинного культивирования мицелия и выделения из него экстракта 125
2.5. Стимулирующий эффект наноструктурных частиц серебра на рост и продуктивность мицелия вешенки в глубинной культуре 148
Выводы по главе 2 174
ГЛАВА 3. Эффект синергизма эмв (фармакологической субстанции) с цитостати ками при сочетанном действии на трансфор мированные клетки in vitro 180
3.1. Постановка задачи исследования 180
3.2. Действие экстракта и цитостатиков на цитокинетические параметры культивируемых клеток 181
3.3. Индивидуальное и сочетанное с цитостатиками действие экстракта на пролиферативную активность трансформированных клеток HeLa 183
3.4. Индивидуальное и сочетанное с цитостатиками действие экстракта на индукцию апоптоза трансформированных клеток HeLa 187
3.5. Действие экстракта и циклофосфана на культивируемые нормальные фибробласты человека 195
3.6. Клеточные мишени действия экстракта 197
3.6.1. Индивидуальное действие экстракта и циклофосфана на
митотические хромосомы трансформированных клеток HeLa 197
3.6.2. Сочетанное с циклофосфаном действие экстракта на митоти ческие хромосомы трансформированных клеток HeLa 199
3.6.3. Эффект синергизма действия экстракта с факторами, влияющими на структурно-функциональное состояние хроматина 200
3.6.4. Определение роли митохондрий, как возможных мишеней действия экстракта на индукцию апоптоза 204
3.6.5. Индивидуальное и сочетанное с циклофосфаном действие экстракта на плазматические мембраны клеток 210
3.6.6. Влияние экстракта при его индивидуальном или сочетанном с
циклофосфаном действии на подвижность клеток 211
3.6.7. Гипотеза о механизме действия экстракта 212
Выводы по главе 3 213
ГЛАВА 4. Действие экстракта (фармакологической субстанции) на различные нозологические формы на модели экспериментальных животных (in vivo) 219
4.1. Постановка задачи исследования 219
4.2. Проверка токсичности фармакологической субстанции 222
4.3. Противоопухолевая активность фармакологической субстанции
2 4.3.1. Материалы и методы 225
4.3.2. Результаты исследований 227
4.4. Влияние фармакологической субстанции и циклофосфана на гематологические показатели периферической крови здоровых мышей 232
4.4.1. Материалы и методы 233
4.4.2. Результаты исследования 233
4.5. Гиполипидемическая активность фармакологической субстанции 235
4.5.1. Материалы и методы 235
4.5.2. Результаты исследования 240
4.6. Гепатопротекторное действие фармакологической субстанции 243
4.6.1. Материалы и методы 243
4.6.2. Результаты исследований 247
4.7. Действие фармакологической субстанции на коррекцию лекарственной непереносимости в комплексной терапии туберкулеза легких 249
4.8. Перспективы применения экстракта мицелия вешенки в ветеринарии 273
4.8.1. Экстракт мицелия вешенки в животноводстве 273
4.8.2. Экстракт мицелия вешенки в ветеринарии домашних животных.. 277
Выводы по главе 4 279
ГЛАВА 5. Активное вещество фармакологической субстанции: технология выделения, идентификация и биологическая активность 282
5.1. Технология выделения активного вещества 282
5.1.1. Фракционирование экстракта 282
5.1.2. Выделение активного вещества из экстракта хлористым метиленом 288
5.2. Идентификация вещества, определяющего биологическую активность экстракта 290
5.3. Действие дезметилинцистерола на цитокинетические параметры культивируемых клеток 301
5.4. Действие дезметилинцистерола на цитокинетические параметры культивируемых клеток в условиях модификации клеточных мембран глутаровым альдегидом 304
5.5. Биологические мишени и механизм действия экстракта с активным веществом 310
Выводы по главе 5 314
ГЛАВА 6. Предложения по созданию и производству лекарственного препарата и оценка его полифункциональной медико-биологической активности 316
6.1. Базовые предпосылки создания лекарственного препарата 316
6.2. Состав лекарственного препарата 320
6.3. Задачи медико-биологических исследований разработанного лекарственного препарата 322
6.4. Результаты медико-биологических исследований разработанного лекарственного препарата 322
6.4.1. Проверка токсичности препарата 322
6.4.2. Противоопухолевая активность препарата и отдельных его фракций на модели солидной опухоли меланомы В16 325
6.4.3. Действие препарата и отдельных его фракций на прогрессию дислипидемии, индуцированной атерогенной диетой 337
6.5. Предложения по производству инновационного лекарственного препарата-адаптогена с полифункциональной медико-биологической активностью 362
6.5.1. Феноменологическая модель технологического процесса производства препарата 362
6.5.2. Предложения по созданию технологического комплекса по производству фармакологической субстанции и лекарственного препарата 365
6.5.3. Способы получения обогащенных фракций, применяемых в составе препарата 372
6.5.4. Предложения по производству лекарственного препарата 375
6.5.5. Технико-экономическая оценка промышленного производства
фармакологической субстанции препарата 383
Выводы по главе 6 385
Заключение 389
Выводы 394
Практические предложения 397
Список сокращений и условных обозначений 399
Список литературы
- Медико-биологические свойства препаратов на основе базидиаль-ных грибов Pleurotus ostreatus
- Результаты культивирования и экстракции мицелия вешенки
- Действие экстракта и циклофосфана на культивируемые нормальные фибробласты человека
- Действие фармакологической субстанции на коррекцию лекарственной непереносимости в комплексной терапии туберкулеза легких
Медико-биологические свойства препаратов на основе базидиаль-ных грибов Pleurotus ostreatus
Экстенсивный способ выращивания грибов предусматривает их выращивание в условиях, приближенных к естественным.
Известно, что в природе вешенка устричная, или обыкновенная, произрастает на стволах многих лиственных деревьев, однако наилучшими для нее являются различные виды тополя, ивы, граба, бука и дуба. На лиственных породах с мягкой древесиной (тополь, ива, граб) мицелий вешенки разрастается быстрее, но урожайность его ниже, чем на деревьях с более твердой древесиной (бук, дуб), на которых грибница развивается медленнее. В естественных условиях вешенка плодоносит в конце сентября - в октябре [59, 190].
Для культивирования вешенки используют свежесрубленную древесину, содержащую достаточное количество влаги для развития мицелия гриба. При использовании давно срубленной древесины ее вымачивают в воде в течение недели. Разрезают ствол на бруски (обрубки) в день инокуляции или накануне. Оптимальный их диаметр 30-40 см. Высота брусков составляет 30-35 см. Посевной мицелий наносят на заболонью часть поверхности пня в мае-июне, предварительно срезав с него диск толщиной 3-5 см. Норма расхода мицелия 70 -100 г на один пенек. Плодовые тела вешенки появляются в конце сентября -начале октября [190].
Появлению грибов способствуют низкие ночные температуры (4-6С) и высокая влажность воздуха (90-95%). Через 7-10 дней после инициации примордиев собирают урожай. Плодоношение продолжается 40-50 дней и имеет 2-3 волны. Грибы собирают в течение 3-5 лет. Урожай зависит от качества древесины и мицелия, погодных условий, санитарного состояния леса и т.д.
Недостатком экстенсивного способа выращивания вешенки является сезонность сбора плодовых тел и зависимость величины урожая от климатических условий. Именно по этим причинам этот способ не находит широкого применения в промышленности для использования собранных плодовых тел для дальнейшей их обработки и выделения из них биологически активных веществ и является неперспективным для его применения в биотехнологиях создания медицинских препаратов.
Интенсивный способ выращивания вешенки предполагает культивирование плодовых тел в специальных помещениях, где есть возможность регулирования условий микроклимата и подготовки субстрата для культивирования посевного мицелия и плодовых тел. Достоинством этого способа перед экстенсивным способом выращивания грибов является то, что процесс выращивания проводится круглогодично. Урожайность плодовых тел вешенки более высокая и стабильная. Для культивирования посевного мицелия и плодовых тел используется большое количество субстратов из отходов сельского хозяйства и промышленности (опилки, стружки, кора хвойных и лиственных пород деревьев, бумага, отстой пульпы соломы злаковых культур, початки и стебли кукурузы, отходы сахарного тростника, отходы кофе, очес, камыш, лузга подсолнечника и другие материалы, содержащие целлюлозу) в связи с наличием в технологическом процессе фазы их тепловой обработки. Культивирование посевного мицелия и плодовых тел осуществляется в более короткий производственный цикл, равный 8-10 неделям, при широкой возможности применения механизации и автоматизации технологических процессов [59, 190].
На сегодняшний день в России в качестве помещений для выращивания грибов по специально разработанной для каждого вида культуры технологии используются теплицы, птичники, коровники, овощехранилища, склады, цехи пищевых предприятий, гаражи, бомбоубежища и другие оборудованные для этих целей нежилые помещения. Технология производства грибов вешенка включает общепринятые технологические операции [190]. - термообработка органического субстрата; - инокуляция (посев) мицелия и формирование грибных блоков; - термостатирование грибных блоков; - получение и сбор плодовых тел грибов. Один цикл выращивания грибов интенсивным способом длится 2-2,5 месяца. При круглогодичном культивировании грибов можно осуществить 5-6 циклов.
Традиционным субстратом для выращивания плодовых тел вешенки по вышеуказанной технологии является солома злаковых культур: пшеницы, ржи, ячменя, овса, проса. Широко используются также измельченные стержни и початки кукурузы, рисовая солома [190]. Технико-экономические показатели грибного производства меняются в зависимости от применяемого сырья, технологического оборудования, используемых производственных площадей и стоимости энергоносителей. Средняя рентабельность грибоводческих хозяйств в России составляет до 40%.
Вместе с тем добиться такой рентабельности и, соответственно, прибыли при выращивании грибов по известным технологиям из-за различных потерь как посевного материала (мицелия), так и плодовых тел в процессе их культивирования трудно, а вследствие возникающих климатических и других природных и технологических нештатных ситуаций порой и невозможно.
Так, например, развитие болезнетворных микроорганизмов (патогенов) в процессе подготовки субстрата и посевного мицелия, а также выращивания плодовых тел иногда вызывает настоящие эпидемии, которые губят урожаи и делают плодовые тела невзрачными и вследствие этого непригодными для дальнейшего их производственного и коммерческого применения.
К патогенам, наряду с различными бактериями и иногда встречающимися микромицетами и вирусами, относятся, прежде всего, несовершенные грибы, споры которых активно развиваются и подавляют рост мицелия и плодовых тел. Это происходит вследствие нарушения технологии при подготовке зерновой культуры для мицелия, субстрата для прорастания товарного мицелия и плодовых тел, а также несанкционированного изменения (колебаний) температурно-влажностного режима внутри помещений [59].
Опыт специалистов-грибоводов позволяет снижать масштабы возможных потерь. Но добиться существенного их снижения только за счет применения известных методов и средств, как показывает опыт, невозможно.
Для подтверждения приведенных доводов рассмотрим применяемые на сегодняшний день способы выращивания вешенки и их недостатки.
В настоящее время в практике промышленного твердофазного поверхностного культивирования съедобных грибов вешенки известны два способа [50]: - выращивание вешенки на стерилизованном субстрате; - выращивание вешенки на нестерильном субстрате. зо Применение способа выращивания вешенки на стерилизованном субстрате в асептических условиях экономически невыгодно.
К недостаткам этого способа, прежде всего, относится сложность его реализации и высокая себестоимость продукции, связанные с необходимостью приобретения и эксплуатации дорогостоящего технологического оборудования. Вследствие этого способы выращивания вешенки в стерильных условиях не находят широкого применения в промышленном грибоводстве как в России, так и за рубежом.
Интенсивное выращивание вешенки в нестерильных условиях позволяет устранить данные недостатки. Однако при этом появляется другая проблема -размножение в субстрате конкурирующих бактерий и плесневых грибов.
Известно, что качество выращиваемой вешенки поддерживают путем создания селективных условий роста за счет предварительной обработки субстрата с помощью защитных микроорганизмов [87, 167], подготовки многокомпонентных субстратов [99], добавки в субстрат беномила [253], препарата «Custos», а также применения быстрорастущих «агрессивных» культур вешенки. Трудности при реализации интенсивного выращивания вешенки по указанным способам [87, 99, 167] связаны с необходимостью раскрытия или покупки «ноу-хау» и использования дефицитных препаратов - беномила и «Custos». Предметом «ноу-хау» являются штаммы защитных микроорганизмов, состав многокомпонентных субстратов и культуры вешенки. Кроме того, известно, что при длительном применении беномил и препарат «Custos», как и другие пестициды, теряют свою эффективность.
Результаты культивирования и экстракции мицелия вешенки
Известно, что плодовые тела Pleurotus ostreatus содержат вещества, обладающие противоопухолевой активностью [12, 41, 59, 92].
Включение гриба Pleurotus ostreatus в рацион питания существенно снижает риск возникновения раковых заболеваний. Так, например, в 1997 году этот эффект был экспериментально подтвержден японскими учеными. Добавление в пищу мышей сильного канцерогена N-бутил-М -бутанолнитрозоамина в течение двух месяцев приводило у испытуемых мышей к раку мочевого пузыря в 100% случаев. Когда одновременно с канцерогеном в рацион питания добавили гриб Pleurotus ostreatus, то по истечении двух месяцев только 65% животных имели раковую опухоль. Авторы эксперимента, объясняя протективное действие Pleurotus ostreatus при раковых опухолях, предположили, что полисахариды гриба (глюканы) стимулируют противоопухолевую активность иммунной системы [81].
Многочисленными исследованиями было доказано, что Pleurotus ostreatus эффективен как при доброкачественных, так и при злокачественных опухолях.
При исследовании противоопухолевого действия и влияния на иммунную систему доказано наличие в плодовых телах и вегетативном мицелии съедобных грибов рода вешенка {Pleurotus ostreatus, Pleurotus spodoleucus, Pleurotus sajorcaju и др.) целого ряда метаболитов с антиканцерогенной и противоопухолевой активностью. Это полисахариды (прежде всего Р-(І-З)-О-глюканьі) и их комплексы с пептидами. Действие этих соединений базируется на усилении иммунных ответов организма. Подавляющее большинство работ проведено на лабораторных животных [233, 244, 271].
Противоопухолевый эффект был показан в экспериментах на мышах, у которых под воздействием канцерогенов были индуцированы опухоли. Карцинома мочевого пузыря была обнаружена у всех мышей в контрольной группе и только у 65% в той группе, в которой в качестве кормовой добавки использовали Pleurotus ostreatus [233]. Авторы экспериментов, объясняя протективное действие вешенки, предположили, что полисахариды гриба (глюканы) стимулируют иммунную систему. Иммуномодулирующая активность Pleurotus ostreatus и полисахаридов, выделенных из этого гриба, была подтверждена в большом количестве экспериментов. Так, было показано, что водорастворимые глюканы увеличивают как количество иммунокомпетентных клеток в крови, так и их функциональную активность. Причем этот эффект имеет устойчивый характер. Он наблюдается более 2-х недель после введения глюканов (Paulik S., 1992, 1996).
Сравнение показателей иммунной системы, таких как хемотоксическая активность макрофагов, реакция бласттрансформации лимфоцитов и цитостатическая активность натуральных киллеров, показало, что добавление вешенки в рацион питания полностью восстанавливает указанные показатели.
Кроме того, значительно возрастает цитостатическая активность натуральных киллеров против раковых клеток даже по сравнению с контрольной группой мышей, которые не получали ни канцероген, ни грибы (Kurashige S., 1997; Sasaki Т., TakasukaN., 1993; Zhuang С, Mizuno Т., Shimada A., Jto Н., 1993).
Известно, что для поддержания иммунной системы организма в качестве сопроводительной терапии при проведении операций по пересадке органов в качестве иммуномодулятора и как агента, обладающего противоопухолевой и антибактериальной активностью, используют ловастатин. Эксперименты, проведенные при трансплантации почек и сердца, показали, что применение ловастатина позволяет снижать дозу иммунодепрессантов, в частности, циклоспорина. Эффективность ловастатина при пересадке сердца проявляется в его способности снижать уровень холестерина в крови, что крайне важно для больных сердечно-сосудистыми заболеваниями [81].
Одним из компонентов препаратов из Pleurotus ostreatus, эффективных при саркоме и гепатите, является лектин, сходный по N-концевой последовательности с известным лектином из Aleuria aurantia. В зависимости от метода выделения биологически активных веществ содержание лектина в них варьируется, поскольку он разрушается при кислотной и щелочной обработке. Он также термолабилен [257]. Недавнее исследование (Gu Y.H., Sivam G.) посвящено поиску активного соединения, обеспечивающего противоопухолевую активность экстрактов из Pleurotus ostreatus (2006, J. Med. Food, 9, 196). Приводится ссылка на то, что проанализировано уже два десятка видов медицинских грибов и выделенных из них полисахаридов с точки зрения их антиканцерогенного действия на РС-3 клетки андрогеннезависимого рака человека. Авторы изучали водорастворимый экстракт из Pleurotus ostreatus (РОЕ). РОЕ быстро индуцировал апоптоз РС-3 клеток в дозе 150 мкг/мл в течение 2 часов, через 6 часов наблюдали сопутствующую апоптозу фрагментацию ДНК. Оба эффекта дозозависимы. Также блокировалась колониеобразующая способность. Интересно, что биологическая активность препарата снижалась при высокой температуре (80С, 2 часа), но оставалась стабильна в течение длительного времени при температуре ниже 40С.
Механизм действия иммуномодулирующих веществ, т.н. BRM (Biological response modifier), снижающих риск развития метастазов, связан с запуском каскада иммунологических реакций, активирующих макрофаги. Испытывали действие водорастворимого экстракта грибов, включающего Р-глюканы (Ebina Т.2005, Gan То, Kadaku Ryoho, 32, 1654). Различные экстракты содержали комплекс Р-глюканов с белками (50,4 % белка). В более ранних работах (Zhang J. el al, 1994, Bios. Biotechnol Biochem, 58, 1195) приведены результаты исследований гетерополисахарида (от 10 до 40% белка).
В исследовании [252], проведенном на мышах, было выявлено протективное действие экстракта Pleurotus ostreatus на индукцию карциномы мочевого пузыря в ответ на введение канцерогена (N-бутил-М -бутанолнитрозоамина). При этом показано, что активность макрофагов, лейкоцитов и цитотоксическая реакция NK лимфоцитов противоопухолевых клеток у мышей, получавших только канцероген, были угнетены. С другой стороны, у мышей, получавших совместно канцероген и экстракт, активность этих клеток оставалась на уровне нормы.
Действие экстракта и циклофосфана на культивируемые нормальные фибробласты человека
Тесты проводили на первичных фибробластах человека (10-14 пассаж).
Клетки культивировали на покровных стеклах в среде DMEM с добавлением эмбриональной сыворотки теленка (HyClone) и антимикробного и антигрибкового реагента (Gibco) в течение 5 дней, до формирования субконфлюэнтного монослоя.
Биологические эффекты, вызываемые присутствием наночастиц коллоидного серебра в Препаратах 1, 2, и 3, тестировали посредством внесения аликвот суспензии Препаратов в среду культивирования клеток в концентрациях: 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 и 15,0 мкл на 1,0 мл среды.
Контролем служили клетки, культивируемые в среде без добавления Препаратов. Клетки инкубировали в присутствии тестируемых Препаратов 1, 2 и 3 в течение 24 часов. Через час после внесения анализировали клетки для выявления возможных быстрых токсических эффектов. Через 24 часа после внесения тестируемых Препаратов 1,2,3 клетки фиксировали 3,7% раствором формальдегида на PBS (15 минут), пермеабилизровали плазматические мембраны 0,5% раствором Тритона Х-100 на PBS, окрашивали ДНК-связывающим флуорохромом DAPI (0,5 мкг/мл) и заключали в мовиол. Для анализа действия Препаратов 1,2,3 определяли состояние популяции культивируемых клеток по двум цитокинетическим параметрам - митотическому и апоптотическому индексам.
Микроскопический анализ клеток, проведенный через час после пересева в среду, содержащую испытуемые Препараты 1, 2, 3, не выявил нарушений в структуре интерфазных и митотических клеток и в динамике роста популяции.
Микроскопический анализ, проведенный через 24 часа инкубации клеток в среде, содержащей препараты № № 1, 2 и 3, показал, что испытуемые препараты не обладают токсическим действием на культивируемые клетки (рисунки 2.38-2.40).
Таким образом, в результате изучения в клеточной системе in vitro действия препаратов наноструктурных частиц коллоидного серебра в водной дисперсии на цитокинетические параметры культивируемых клеток было установлено, что испытываемые «Препараты коллоидного серебра в водной дисперсии» (Препарат КС ТУ 9185-001-38363343-13) с содержанием в них в используемых концентрациях «Концентрата коллоидного серебра в водной дисперсии» (Концентрат КС ТУ 9185-025-87552538-12), не обладают цитотоксическим действием на культивируемые нормальные фибробласты человека.
Культивирование мицелия в присутствии препарата «Концентрат коллоидного серебра в водной дисперсии»
Целью этой части исследования являлось изучение особенностей двухстадийного культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в ферментативной среде, обогащенной ККС, и получения из выращенного мицелия экстракта в виде геля. Подробно метод двухстадийного глубинного культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 описан в работах [23, 66].
Культивирование осуществлялось в две стадии: первая стадия - выращивание посевного материала, вторая стадия - ферментативное культивирование мицелия для получения большого количества его биомассы.
Соответственно использовались две среды, различающиеся по составу -«посевная» и «ферментационная». ККС добавлялся в ферментационную среду в концентрациях 0,0033, 0,005 и 0,0066 мл на 1мл питательной среды II пассажа. В качестве контроля использовался мицелий, культивирующийся без добавления ККС. Общая последовательность этапов культивирования показана на рисунке 2.41.
Полученные результаты показывают, что количество биомассы мицелия возрастает при использовании добавки ККС в концентрации 0,005 мл на 1 мл среды и снижается при использовании ККС в концентрации 0,0066 мл на 1 мл среды (рисунок 2.42).
Количество биомассы мицелия Pleurotus ostreatus 1137 после его культивирования в контроле (г) и в присутствии в ферментационной среде препарата ККС.
Экстракт получали по ранее описанной технологии [66] из вариантов контрольных образцов мицелия и из мицелия, выращенного в присутствии различных концентраций ККС.
Полученные данные показывают, что максимальное количество экстракта удается выделить из мицелия Pleurotus ostreatus 1137, культивируемого в присутствии 0,005 мл ККС на мл среды (рисунок 2.43).
Анализ мицелия в сканирующем электронном микроскопе не показал существенных различий в структуре гиф и плотности их расположения в контрольных образцах и в образцах, растущих в присутствии ККС (фотография на рисунке 2.44).
Культурно-морфологическая характеристика мицелия Pleurotus ostreatus 1137, полученного при его культивировании в ферментативной среде 2-го пассажа, соответствует изученным ранее и описанным в работе [23] культурально-морфологическим свойствам штаммов Pleurotus ostreatus.
Действие фармакологической субстанции на коррекцию лекарственной непереносимости в комплексной терапии туберкулеза легких
Атерогенную диету создавали по методу Н.Н.Аничкова, путем введения животным 10% масляной суспензии холестерола и дополнительно пропилтиоурацил (в дозе 7 мг/кг) для подавления функции щитовидной железы. Суспензию вводили перорально 1 раз ежедневно натощак в течение 14 дней.
Испытываемые вещества Зокор, экстракт мицелия вешенки (ЭМВ) перед применением развешивали в расчетных дозах и разводили для каждой крысы в 2 мл физиологического раствора.
Все испытываемые вещества вводили крысам перорально с интервалом 3 часа после атерогенной нагрузки в течение последних 10 дней атерогенной диеты.
В конце эксперимента у животных после 18 часов голодания брали кровь из хвостовой вены в центрифужные пробирки. Кровь центрифугировали, отбирали сыворотку и проводили изучение содержания в ней холестерина и триглицеридов.
Анализы проводили унифицированными методами на биохимическом фотометре «Стат факс 1904+», производства США с использованием стандартных наборов реагентов. Определение содержания общего холестерина (ХС) Определение концентрации общего холестерина в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «ХОЛЕСТЕРИН CHOL FS» фирмы «DiaSys» ферментативным фотометрическим методом.
Принцип метода заключается в том, что присутствующие в сыворотке крови эфиры холестерина гидролизуются холестеролэстеразой (ХЭ). При этом образуется свободный холестерин, который окисляется кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы (ХО) с образованием эквимолярного количества перекиси водорода. Под действием пероксидазы (ПО) перекись водорода окисляет 4-аминоантипирин (4-ААП) и фенол с образованием окрашенного соединения хинонимин.
Эфиры холестерина + Н20... —»холестерин + жирная кислота Холестерин + Ог... хо -холестенон + Н2Ог 237 2 H202 + 4 - ААП + фенол... - хинонимин + 4 Н20 Состав набора. Реагент: буфер рН 6,7-50 ммоль/л; фенол - 5 ммоль/л; 4-аминоантипирин (ААП) - 0,3 ммоль/л; холестеринэстераза - 200 Е/л; холестериноксидаза (ХО) - 50 Е/л; пероксидаза - 3 Е/л. Стандарт: раствор холестерина - 5,2 ммоль/л (200 мг/ЮОмл).
Проведение анализа: опытные пробы - в пробирку помещают 1000 мкл реагента, добавляют 10 мкл сыворотки; калибровочная проба - к 1000 мкл реагента добавляют 10 мкл стандарта; холостая проба - к 1000 мкл реагента добавляют 10 мкл дистиллированной воды. Реакционную смесь перемешивают и инкубируют 20 минут при 20-25С или 10 минут при 37С. Измеряют оптическую плотность всех образцов не позднее, чем через 60 минут при длине волны 500 (480-520) нм.
Расчет концентрации холестерина производят по формуле: где Е0 и Ест - оптические плотности опытной и стандартной проб, измеренные относительно контрольной пробы, ед.опт.пл; Сст - концентрация стандарта (5,2 ммоль/л). Определение содержания холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВГГ). Определение концентрации холестерина липопротеинов высокой плотности в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «ХОЛЕСТЕРИН ЛПВП ФС» фирмы «Диакон-ДС» ферментативным фотометрическим методом при длине волны 500 (480-520) нм. Принцип метода состоит в том, что фосфовольфрамовая кислота и ионы магния связывают хиломикроны, липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеины низкой плотности (ЛПНП) в сыворотке крови. Образовавшийся осадок осаждают центрифугированием. Фракция липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) остается в прозрачном супернатанте, в котором определяют содержание холестерина ЛПВП.
Состав набора. Реагент 1: раствор, содержащий фосфовольфрамовую кислоту - 0,55 ммоль/л и магний хлористый - 25 ммоль/л. Реагент 2: Калибратор (калибровочный раствор холестерина - 0,52 ммоль/л, содержащий тезит - 10% и азид натрия - 0,095%.
Проведение анализа. Получение супернатанта для определения холестерина ЛПВП: в центрифужную пробирку вносят 500 мкл анализируемой сыворотки крови, добавляют 1000 мкл реагента 1. Пробу перемешивают и выдерживают в течение 10 минут при температуре +18-25С, затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре. Используют только абсолютно прозрачный супернатант. Опытная проба: в пробирку помещают 1000 мкл реагента 1 и добавляют 100 мкл супернатанта; калибровочная проба: в пробирку помещают 1000 мкл реагента 1 и добавляют 100 мкл калибратора; холостая проба: в пробирку помещают 1000 мкл реагента 1 и добавляют 100 мкл дистиллированной воды. Реакционную смесь перемешивают и инкубируют 20 минут при 20-25С или 10 минут при 37С. Измеряют оптическую плотность всех образцов не позднее, чем через 60 минут при длине волны 500 (480-520) нм.
Расчет содержания холестерина ЛПВП производят по формуле: Собр = Е0/Ест х 0,52 х 3,0, где Е0 и Ест - оптические плотности опытной и стандартной проб, измеренные относительно контрольной пробы, ед.опт.пл.; 0,52 - содержание холестерина в калибраторе, моль/л; 3,0 - коэффициент разведения сыворотки. Определение содержания триглицеридов (ТГ). Определение концентрации триглицеридов в сыворотке крови проводили с помощью набора реагентов «ТРИГЛИЦЕРИДЫ ФС» фирмы «Диакон-ДС» фотометрическим методом при длине волны 500 (480-520) нм.
Принцип метода: липаза катализирует реакцию гидролиза триглицеридов с образованием жирных кислот и эквимолярного количества глицерина. Глицерин при наличии АТФ, гексокиназы и глицерофосфатоксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием эквимолярного количества перекиси водорода. Пероксидаза катализирует окисление хромогенных субстратов перекисью водорода в присутствии хлорфенола с образованием окрашенного продукта, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации триглицеридов в пробе и измеряется фотометрически при длине волны 500 (480-520) нм.
Состав набора. Реагент 1: буферно-ферментный раствор, содержащий фосфатный буфер рН 7,2-50 ммоль/л; 4-хлорфенол - 4 ммоль/л; 4-аминоантипирин - 0,5 ммоль/л; АТФ - 2 ммоль/л; магний хлористый - 15 ммоль/л; глицеринкиназу -400 Е/л, глицеро-3-флосфатоксидазу - 1500 Е/л; липопротеинлипазу - 4000 Е/л; пероксидазу - 2000 Е/л; азид натрия - 0,095%. Реагент 2: Калибратор (калибровочный раствор триглицеридов - 2,3 ммоль/л в растворе Тритона Х-100 -0,3% и азида натрия - 0,095%.
Проведение анализа. Опытная проба: в пробирку помещают 1000 мкл реагента 1 и добавляют 10 мкл сыворотки крови; калибровочная проба: в пробирку помещают 1000 мкл реагента 1 и добавляют 10 мкл калибратора; холостая проба: в пробирку помещают 1000 мкл реагента 1 и добавляют 10 мкл дистиллированной воды. Реакционную смесь перемешивают и инкубируют 20 минут при 20-25С или 10 минут при 37С. Измеряют оптическую плотность всех образцов не позднее, чем через 60 минут при длине волны 500 нм.
