Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта поросят-отъемышей ... 11
1.2. Кормовые добавки, применяемые для профилактики диареи у поросят-отъемышей 15
1.3. Принципы конструирования кормовых добавок с пробиотическим действием 20
1.4. Биологически активные вещества, продуцируемые бактериями Bacillus subtilis 21
1.5. Опыт применения глауконитов 24
1.6. Профилактика и лечение желудочно-кишечных болезней у поросят-отъемышей 28
1.7. Растительные производные, используемые в кормовых добавках при желудочно-кишечных болезнях 32
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 34
2.1. Материалы и методы 34
2.2. Результаты исследований 40
2.2.1. Обоснование использования компонентного состава кормовой добавки 40
2.2.2. Оценка питательной ценности шрота расторопши пятнистой 42
2.2.3. Оценка безопасности, фазового, минералогического
состава, безвредности и сорбционных свойств глауконита 46
2.2.4. Оценка безвредности и определение оптимальной дозы кормовой добавки 50
2.2.5. Оценка гепатозащитнои активности на модели острого токсического гепатита у мышей 53
2.2.6. Приготовление лабораторного образца кормовой добавки Бион и оценка его физико-химических свойств 54
2.2.7. Технология приготовления кормовой добавки Бион в условиях промышленного производства 60
2.2.8. Приготовление обезвоженных компонентов фильтрата культуральной жидкости Bacillus subtilis 3 63
2.2.9. Технология приготовления конечной формы добавки 65
2.2.10. Разработка методов контроля кормовой добавки 66
2.2.11. Оценка биологических свойств кормовой добавки Бион 68
2.2.12. Исследование стабильности кормовой добавки Бион в процессе хранения 69
2.2.13. Определение профилактической эффективности Биона при болезнях желудочно-кишечного тракта поросят-отъемышей 71
2.2.14. Оценка терапевтической эффективности Биона при болезнях желудочно-кишечного тракта поросят-отъемышей 75
3. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ БИОН... 82
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 85
5. ВЫВОДЫ 89
6. СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 91
7. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ 92
8. БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 93
ПРИЛОЖЕНИЯ 107
- Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта поросят-отъемышей
- Кормовые добавки, применяемые для профилактики диареи у поросят-отъемышей
- Материалы и методы
Введение к работе
Лечение ЖКБ молодняка сельскохозяйственных животных остается в настоящее время одной из актуальных проблем ветеринарной медицины. Несмотря на большое количество природных и синтетических лечебно-профилактических препаратов, многие вопросы, касающиеся лечения диспепсии, остаются до настоящего времени нерешенными.
Широко применяемые с этой целью антибактериальные препараты наряду с положительным воздействием на течение и форму заболевания вызывают побочные эффекты: возникновение антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов, развитие дисбиотических состояний кишечника, аллергические реакции и др.
В этой связи разработка и внедрение в практику ветеринарии новых комплексных высокоэффективных биологических препаратов для лечения и профилактики ЖКБ животных представляет собой задачу, актуальность которой не вызывает сомнений [1-4].
Перспективным направлением в данной области, по мнению многих отечественных и зарубежных специалистов [1,4,5-10], является конструирование пробиотиков.
Опыт многих российских и зарубежных ученых [11-15] показал, что применение в ветеринарии препаратов растительного происхождения для лечения и профилактики диарейных заболеваний в целом ряде случаев имеет положительный результат.
Многие растения одновременно оказывают положительное влияние на различные системы: пищеварительную, сердечно-сосудистую, мочеполовую и т.д. Однако наиболее ценными считаются препараты растительного происхождения, которые обладают наряду с основным механизмом действия еще и дезинтоксикационными свойствами за счет воздействия на ретикулогистиоцитарную систему и печень, в частности. Основным представителем таких растений является пятнистая Silybum marianum (L.) Gaerth., сем. Астровые - Asteraceae, опыт применения которой насчитывает более 2000 лет [11-14].
Биологически активные компоненты расторопши входят в состав таких гепатопротекторных средств, как карсил, силибор, легалон, натурсил [16-20].
Главными составляющими ее являются биологически активные вещества - флаволигнаны (силибин, силидианин, силикристин и их стереоизомеры), обладающие гепатопротекторным действием, флавоноиды (таксифолин, кверцетин, кемпферол, дигидрокемпферол), органические кислоты, горечи, смолы, жирное масло, белки, в состав которых входит полный набор незаменимых аминокислот, фосфолипиды и другие вещества [21-23].
Поэтому препараты расторопши по механизму действия следует отнести не только к гепатозащитным средствам, но и к универсальным мембрано- и органопротекторам [24].
Матрицей для иммобилизации бактерий-антагонистов и продуктов их метаболизма могут быть природные глаукониты, обладающие уникальными ионообменными и адсорбционными свойствами [25-29].
Эффективность использования природных энтеросорбентов в рационах сельскохозяйственных животных неоспоримо доказана работами отечественных и зарубежных специалистов [30-35].
Глаукониты благоприятно влияют на морфологическое состояние слизистой оболочки кишечника, усиливают функционирование микроворсинок, что улучшает пищеварение и всасывание, регулируют содержание свободной жидкости в кишечнике, тем самым, способствуя нормализации пищеварения.
Конструирование и производство биологических препаратов на основе комбинаций ионообменных матриц с компонентами растительного происхождения и метаболитами бацилл для комплексной профилактики желудочно-кишечных болезней сельскохозяйственных животных являются актуальной задачей для обеспечения здоровья и производительности сельскохозяйственных животных. Цель и задачи исследований
Целью настоящей работы являлась разработка новой кормовой добавки с пробиотическими и гепатопротекторными свойствами на основе безотходной технологии приготовления пробиотиков и оценка ее эффективности при желудочно-кишечных болезнях поросят-отъемышей.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Обосновать компонентный состав кормовой добавки с пробиотическим и гепатопротекторным действиями и оценить биологические свойства ее компонентов.
2. Разработать технологию производства кормовой добавки Бион на оборудовании АТЛ пробиотиков Биоспорин и Бактистатин.
3. Приготовить лабораторные образцы кормовой добавки и изучить ее биологические свойства.
4. Приготовить производственную серию и оценить лечебно-профилакти-ческую эффективность кормовой добавки Бион при ЖКБ на поросятах-отъемышах.
5. Рассчитать экономическую эффективность кормовой добавки Бион при откорме поросят.
6. Разработать проекты нормативно-технической документацию на кормовую добавку Бион.
Научная новизна
Впервые на основе комбинации метаболитов спорообразующего штамма
В. subtilis 3, иммобилизованных на природном энтеросорбенте - глауконите в смеси со шротом плодов расторопши пятнистой, получена новая отечественная кормовая добавка, обладающая комплексным сорбционным, гепатопротекторным и пробиотическим действием при лечении ЖКБ, за счет эффективно подобранного композиционного состава Российских природных компонентов, получаемая по безотходной технологии производства пробиотиков на отечественном технологическом оборудовании.
Обоснована возможность использования природного алюмосиликата -глауконита, шрота плодов расторопши пятнистой и их смеси с метаболитами B.subtilis 3 в комплексных кормовых добавках для сельскохозяйственных животных.
Исследованы биологические свойства кормовой добавки Бион, способность подавлять размножение сальмонелл, кандид и стафилококков, стимулировать рост лактобацилл и бифидобактерий в ЖКТ животных, способность улучшать перевариваемость кормов и проявлять адсорбционное и гепатопротекторное действия, обеспечивающие возможность ее применения при лечении и профилактике ЖКБ поросят, в том числе в комплексе с антибиотиками при инфекционных болезнях животных и их осложнениях.
Установлена высокая (95-97%) лечебно-профилактическая эффективность готовой формы кормовой добавки Бион при ЖКБ поросят-отъемышей.
Практическая и теоретическая значимость работы
Создана безотходная технология, позволяющая одновременно получать пробиотики Биоспорин, Бактистатин и кормовую добавку Бион в виде порошка на единой аппаратурно-технологической линии в филиале ФГУ «48 ЦНИИ МО РФ-Центр военно-технических проблем биологической защиты».
В практику ветеринарии Российской Федерации будет введена первая отечественная комбинированная пробиотическая кормовая добавка Бион, обладающая широким спектром лечебно-профилактической эффективности.
Разработаны и утверждены проект ТУ 9365-001-46392258-2008 на кормовую добавку Бион; промышленный регламент производства кормовой добавки Бион в сухой форме (15.02.2008 г. № 3458); разработан проект инструкции по применению кормовой добавки Бион для лечения и профилактики дисбактериозов ЖКТ поросят-отъемышей.
Независимая экспертиза производственных серий подтвердила соответствие показателей качества кормовой добавки Бион требованиям ТУ (акт от 20.03.2008 г. ООО «Лаборатория технологии оздоровительных препаратов»).
На поросятах-отъемышах установлена эффективность действия кормовой добавки Бион. Исследовано влияние ее на микробиоценоз кишечника, установлена высокая лечебно-профилактическая эффективность при диспепсиях ЖКТ, что подтверждено актами, утвержденными руководителями животноводческих хозяйств.
В соответствии с порядком регистрации в Российской Федерации нормативная документация и отчеты об испытании кормовой добавки Бион подготовлены для представления на экспертизу в профильной лаборатории ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ВГНКИ) и государственную регистрацию.
Результаты исследований по созданию кормовой добавки с пробиотическими и гепатопротективными свойствами и безотходной технологии используются в учебном процессе по дисциплине «Биотехнология» в ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К.И. Скрябина.
Основные положения и результаты, выносимые на защиту
1. Теоретическое и экспериментальное обоснование компонентного состава кормовой добавки Бион на основе фильтрата культуральной жидкости, содержащей продукты метаболизма В. subtilis 3, иммобилизованные на природном минеральном адсорбенте - глауконите в смеси с сухим шротом плодов расторопши.
2. Промышленная безотходная технология с использованием современных средств концентрирования, позволяющая получать кормовую добавку Бион на АТЛ производства пробиотиков Бактистатин и Биоспорин.
3. Результаты лечебно-профилактической эффективности пробиотической и гепатопротекторной кормовой добавки Бион при желудочно-кишечных болезнях поросят-отъемышей.
Апробация работы: основные положения диссертации были доложены и обсуждены: на X Юбилейном Международном Славяно-Балтийском научном форуме "Санкт-Петербург — Гастро-2008" (Санкт-Петербург -2008 г.); конференции «Международное сотрудничество и развитие биотехнологии в Кировской области» (г. Киров). Публикации
По материалам диссертационной работы опубликовано 5 научных работ, в том числе: 2 статьи в сборниках международных конференций, в журнале, включенном в перечень ВАК РФ, 3 статьи. Объем и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 106 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (126 источников, из которых 114 отечественных и 12 иностранных), 29 таблиц, 2 рисунка.
Автор работы выражает глубокую признательность и благодарность сотрудникам МГАВМиБ, филиалу ФГУ «48 ЦНИИ МО РФ - ЦВТП БЗ», ООО «Лаборатория технологии оздоровительных препаратов», ЗАО СП «Медвежьи озера», а также руководству этих организаций и хозяйств за возможность выполнения научных и практических исследований по производству кормовой добавки и изучению свойств кормовой добавки Бион. Одновременно выражает благодарность научному руководителю за оказанную помощь при проведении исследований по теме диссертации и оформлению работы.
Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта поросят-отъемышей
Не вызывает сомнений тот факт, что увеличение неблагоприятных экологических факторов ведет к ухудшению эпизоотической ситуации в животноводстве. В связи с этим решение проблем профилактики и лечения болезней животных, особенно в раннем возрасте, возможно лишь при условии успешной реализации противоэпизоотических, ветеринарно-санитарных, зоогигиенических, экологических и других мероприятий, а в ряде случаев и целого комплекса мероприятий, включая разработку, серийное производство и внедрение в ветеринарную практику новых эффективных биопрепаратов, отвечающих современным требованиям [36, 37].
Вполне очевидным является то, что микробиоценоз кишечника животных есть не что иное, как основная составляющая организма, выполняющая или регулирующая многочисленные его функции, как по поддержанию гомеостаза, так и по уровню защиты животного [36-39].
В пищеварительном тракте животных обитает более 500 видов различных микроорганизмов.
Становление микробного биоценоза начинается с первых дней жизни животного, особенно в течение первых 5-8 суток. Поступление микрофлоры из родовых путей материнского организма происходит во время родов при заглатывании вагинальной флоры и последующей их колонизации в пищеварительной системе новорожденного. Колонизация кишечника молодняка микрофлорой матери обеспечивает предупреждение последующего развития дисбактериозов у новорожденных [38-40]. Одновременно с этим новорожденные получают с молозивом уникальные защитные факторы, в том числе иммуноглобулины различных классов, лизоцим, лактоферрин, бифидогены, живые клетки - макрофаги и лимфоциты [41-43].
Стрессы, неправильное кормление, несвоевременная вакцинация, вирусные, бактериальные и некоторые другие заболевания матери в периоды беременности или кормления новорожденных могут снижать защитные свойства молозива, способствуя его обсеменению потенциально-патогенными микроорганизмами [45,46].
Начиная с 4-го дня жизни, в толстом кишечнике новорожденного определяются лактобактерии, эшерихии, стрептококки, стафилококки. К концу первой недели жизни концентрация лактобактерии, эшерихии, бифидобактерий возрастает, появляются бактероиды, клостридии [47-49].
Значительные отклонения в аутофлоре животных вызваны нарушениями гигиены содержания и кормления.
Низкое содержание бифидо-, лактобактерии и повышение ассоциации условно-патогенных бактерий проявляются как неблагоприятные факторы, активно влияющие на секреторную функцию, процессы всасывания, показатели белкового, липидного и минерального обменов, витаминсинтезирующую и ферментативную функции кишечника. Размножающиеся патогенные микроорганизмы и продукты их метаболизма создают условия для дисбактериоза.
У новорожденных поросят, находящихся на искусственном вскармливании, в более высоких титрах появляются патогенные микроорганизмы: клебсиеллы, протеи, морганеллы, энтеробактер, цитробактер, серрации. При снижении резистентности организма они приобретают патогенные свойства и вызывают воспалительный процесс [47-49].
Таким образом, естественное вскармливание в сочетании с пробиотическими препаратами, начатое сразу после рождения, формирует более благоприятную флору пищеварительного тракта, которая способна к колонизационной резистентности и обеспечивает адекватные процессы пищеварения.
Кормовые добавки, применяемые для профилактики диареи у поросят-отъемышей
Главными причинами развития дисбактериозов у поросят в период отъёма являются стрессовые реакции, неправильное кормление и непривычные условия содержания животных. Косвенными причинами также являются ненормированное, несбалансированное по питательным веществам кормление, использование недоброкачественных кормов, антибиотиков, что ведёт к возникновению различного вида патологий. Среди них чаще всего отмечаются аллергии, нарушения обмена веществ, дисбактериозы различной этиологии, диареи [41, 45].
Профилактику и лечение диареи у поросят-отъемышей можно проводить с применением лечебных диет и биологически активных кормовых добавок.
Кормовая добавка «Бета Плюс» для сельскохозяйственных животных и птицы содержит в своем составе лиофилизированные спорообразующие бактерии: Bacillus subtilis, Bacillus liheniformis и аминокислоту бетаин. Входящие в состав бактерии и бетаин способствуют улучшению пищеварения за счет стабилизации кишечной микрофлоры, повышают эффективность кормления, увеличивают привесы и улучшают конверсию корма при откорме [59].
Кормовая добавка «Цеогумит» (сахаптин+гумитон) предназначена для профилактики субклинических микотоксикозов и кормовых стрессов у поросят и цыплят.
Природный цеолит — «Сахаптин» - обладает уникальными адсорбционными, ионообменными, каталитическими, детоксикационными, дезодорирующими и пролонгирующими свойствами [60]. Гумитон, изготовленный на основе торфа, содержит комплекс соединений, обладающих высокой биологической активностью, 85% сухого вещества составляют гумитоновые кислоты, фульвокислоты. В его состав входят 16 аминокислот, в том числе 7 незаменимых, до 40 макро- и микроэлементов, витамины группы В, А, Е. Доказано, что гуминовые соединения проявляют мембранотропное действие, способность усиливать активность обменных процессов в организме, повышают его сопротивляемость к неблагоприятным факторам внешней среды [60].
Высокоэффективный ветеринарный препарат из торфа «ЭСТ-1» предназначен для профилактики и лечения диареи молодняка сельскохозяйственных животных [61].
Эффективной кормовой добавкой для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний является "Рекицен" - ферментированный растительно-дрожжевой продукт, для приготовления которого в качестве сырья используются пшеничные и ржаные отруби и специально отселектированный штамм инактивированных винных дрожжей Saccharomyces cerevisiae (vini) [62].
Препараты Ветом и Ветоцил применяют с целью профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний с синдромом диареи, а также для профилактики иммунодефицитных состояний у молодняка сельскохозяйственных животных. В качестве детоксицирующего средства назначают при токсикозах экзо- и эндогенного происхождения.
Кормовая добавка Велес предназначена для повышения сохранности и продуктивности животных, стимуляции роста и развития животных, а также для повышения неспецифической резистентности животных к инфекционным заболеваниям и абиотическим стресс-факторам, нормализации видового состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта, лечения и профилактики дисбактериоза, диареи и диспепсии [63].
Материалы и методы
Работа выполнена в период с 2006 по 2008 годы на кафедре биотехнологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ (г. Москва); ЗАО СП «Медвежьи озера» (Московская область), в филиале ФГУ «48 ЦНИИ МО РФ - ЦВТП БЗ» (г. Екатеринбург), ООО «Лаборатория технологии оздоровительных препаратов» (г. Санкт-Петербург).
Экспериментальные животные
В экспериментах по изучению и оценке свойств препарата Бион были использованы следующие животные: 150 белых беспородных мышей массой 18-22 г, 22-26 г, 26-32 г; 18 крыс-самцов и 16 крыс-самок линии ВИСТАР, 200 поросят-отъемышей.
Материалы, питательные среды, растворы, реактивы
В процессе работы было отобрано и исследовано 125 проб фекалий животных (95 - поросят, 30 - белых мышей) и 64 пробы крови поросят-отъемышей.
Для выделения и идентификации микроорганизмов использовали следующие питательные среды: МПА, МПБ, МРС-2, среды Гаузе № 2, Эндо, Плоскирева, Блаурока, Сабуро, Чапека, Клиглера, Олькеницкого, солевой агар, Лакто-бак агар, висмут-сульфит агар, желточно-солевой агар, агар Эндо с желчью, кровяной агар, среду 199, среду Игла, гидролизат-молочную среду.
Культивирование В. subtilis 3 кормовой добавки Бион проводили с использованием стандартных жидких и плотных питательных сред, приготовленных в соответствии с регламентом. Стандартные ПС готовили на основе ферментативного гидролизата мяса, солянокислотного гидролизата соевой муки либо солянокислотного гидролизата казеина. Для приготовления гидролизатов использовали говяжью вырезку (ГОСТ 779-87); соевую муку (ГОСТ 3898-56); казеин технический (ГОСТ 17626-81); поджелудочную железу (ГОСТ 11285-73); панкреатин (ГФ, изд. 9-ею.- С. 353).
Для приготовления ПС и дополнительных растворов применяли дистиллированную воду, концентрированную соляную кислоту, фосфатный буфер, 50 %-ный раствор глюкозы.
Глауконит поступал из Карийского месторождения Челябинской области.
Все используемые компоненты прошли контроль в отделе биолого-технологического контроля филиала ФГУ «48 ЦНИИ МО РФ - ЦВТП БЗ».
Технологическое оборудование
Культивирование В. subtilis 3 проводили в жидкой ПС во флаконах (объем 0,1 дм ) на качалках New Branswick (США, модель G-53), в аппаратах ферментерах марки «БИОР-0,25», при глубинном методе культивирования в течение 48 часов.
Отделение В. subtilis от среды культивирования осуществляли с использованием ультрафильтрационной установки «Сартокон-мини».
Анализ аминокислотного состава среды культивирования проводили с использованием метода обращенно-фазовой ВЖХ системы LC-10A фирмы «Shimady» (Япония) с флуоресцентным детектором RF-10AxL. Разделение проводили на колонке Supelcosil ь LC-18 при комнатной температуре [134].
Для приготовления опытных, контрольных образцов Биона глауконит просеивали на вибросите ВС-2М с диаметром отверстий сетки 0,5 мм.
Прокаливание глауконита осуществляли при температуре 200±5С.
Для иммобилизации фильтрата культуральной жидкости и порошка расторопши на природном ионообменнике глауконите применяли установку гранулирования и сушки типа 524Р-АК или сушильный шкаф ШС-1000.
Порошок Биона рассыпали в двойные пакетики из ламинированной бумаги на автомате типа АР-И 3.
Методы исследований
Бактериологические исследования фекалий животных проводили согласно «Методическим рекомендациям по выделению и идентификации условно-патогенных энтеробактерий и сальмонелл при острых кишечных заболеваниях молодняка сельскохозяйственных животных» [111].
Похожие диссертации на Технология приготовления и оценка эффективности кормовой добавки Бион
