Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы .11
1.1 Состояние проблемы и задачи исследований .11
1.2 Получение биологически активных добавок на основе микроорганизмов 16
1.3 Структура и биохимический состав дрожжевой клетки 20
1.4 Методы трансформации дрожжевой клетки .32
1.4.1 Физические методы дезинтеграция микробных клеток 34
1.4.2 Химические методы дезинтеграции микробных клеток .35
1.4.3 Биологические методы деструкции полимеров дрожжевой биомассы .36
1.4.3.1 Автолиз дрожжевых клеток 36
1.4.3.2 Ферментативный гидролиз 40
1.5 Методы получения биологически активных препаратов из микробной биомассы и исследования их структурно-спектральных свойств .44
1.5.1 Электрофоретические методы разделения белка .46
1.5.1.1 Изоэлектрическое фокусирование белков .47
1.5.2 Хроматографическое разделение белков .47
1.5.2.1 Гель-хроматография (гель-фильтрация) 48
1.5.2.2 Аффинная хроматография .49
1.5.2.3 Распределительная хроматография 50
1.5.3 Масс-спектрометрический анализ белков и пептидов .51
Заключение по обзору литературы .55
Глава 2 Объекты и методы исследований 57
2.1 Объекты исследования .57
2.2 Методы исследований .57
2.2.1 Исследование влияния физико-механических способов предобработки дрожжевой биомассы .57
2.2.2 Исследование биохимического состава ферментолизатов 58
2.2.3 Методы математического планирования эксперимента и обработка экспериментальных данных .63
2.3 Структура проведенных исследований 63
Глава 3 Результаты экспериментов и их обсуждение 64
3.1 Исследование различных способов деструкции клеточных стенок для подготовки дрожжевой биомассы к ферментативному воздействию .64
3.1.1 Изучение влияния ультразвукового излучения на интенсификацию процесса ферментолиза клеточной стенки дрожжей 64
3.1.2 Влияние баротермического воздействия на степень подготовки дрожжевой биомассы к ферментативной деструкции. Исследование влияния баротермического воздействия на степень деструкции клеточных стенок дрожжей (КС) в технологии получения белковых препаратов .69
3.1.3 Влияние баротермического воздействия на эффективность процесса ферментативной деструкции внутриклеточных структур дрожжей . 77
3.2 Изучение степени деструкции клеточных структур дрожжей Saccharomyces сerevisiae под действием ферментативных систем .85
3.2.1 Влияние длительности процесса ферментолиза на степень деструкции клеточных стенок и внутриклеточных структур дрожжевой биомассы 85
3.2.2 Влияние ферментативных систем с различной субстратной специфичностью на степень деструкции дрожжевой биомассы 92
3.3 Изучение степени деструкции клеточных структур с применением электронной и сканирующей микроскопии 95
3.4 Научное и экспериментальное обоснование получения функциональных продуктов пищевого и кормового назначения с использованием ферментолизата дрожжевой биомассы 101
Заключение и основные выводы .113
Список сокращений 115
Список литературы
- Структура и биохимический состав дрожжевой клетки
- Гель-хроматография (гель-фильтрация)
- Исследование биохимического состава ферментолизатов
- Влияние баротермического воздействия на эффективность процесса ферментативной деструкции внутриклеточных структур дрожжей .
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В современном мире с быстро растущим населением и недостаточно развитым сельским хозяйством, чрезвычайно важным становится поиск альтернативных источников пищевого белка. Большая часть населения Земли голодает из-за нерационального распределения продовольствия и отсутствия сбалансированного питания. Данная проблема обусловлена ограниченными сырьевыми ресурсами и сельскохозяйственными угодьями, необходимыми для глобального продовольственного снабжения и производства.
В последнее время с подобной проблемой столкнулись и в России. Анализ структуры питания населения России свидетельствует о дефиците пищевого белка, который по прогнозам экспертов, сохранится и в ближайшем будущем. В питании россиян стала преобладать углеводная пища, что повлекло за собой острый дефицит таких биологически важных нутриентов, как белки, незаменимые аминокислоты, витамины и минералы. Белки в живых организмах играют важную роль, выполняя регуляторные, структурные, каталитические, транспортные, защитные и другие функции, обеспечивают обмен веществ. Распад белков компенсируется ресинтезом из фонда свободных аминокислот, полученных при переваривании пищи. Однако если в составе пищи будет отсутствовать, хотя бы одна незаменимая аминокислота в организме человека не смогут синтезироваться необходимые белки. В итоге в результате неправильного питания понижается сопротивляемость населения неблагоприятным факторам, развиваются хронические заболевания, снижается продолжительность жизни.
Одними из перспективных продуцентов белка, аминокислотный скор (показатель биологической ценности белка) которого приближается к животному, являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae. С целью повышения усвояемости внутриклеточных биологически ценных компонентов разрабатываются различные способы деструкции полимеров микробной клетки для выделения белковых веществ, из которых наиболее эффективными являются ферментативные.
В связи с вышесказанным следует, что в условиях высокого дефицита пищевого белка и несбалансированности питания, актуальной задачей является разработка эффективного способа конверсии микробной биомассы на основе регулируемого процесса деструкции субклеточных структур для получения конкурентоспособных биологически полноценных корректоров пищи и кормов с заданными структурно-функциональными свойствами.
Степень разработанности проблемы. Проведенные исследования основаны на научно-теоретических трудах и экспериментальных исследованиях ученых: А.И. Албулова, В.М. Беликова, Г.Л. Воробьева, Л.А. Ивановой; С.А. Коновалова, В.А. Полякова, Л.В. Римаревой, Е.М. Сербы, М.А. Фроловой и других ученых, работающих над этой проблемой. В этих работах исследовались проблемы получения белковых обогатителей и БАД на основе дрожжевой биомассы. Однако высокая механическая прочность клеточных стенок микроорганизмов и низкая доступность ферментов к биокаталитическому воздействию на внутриклеточные полимеры не позволили осуществить глубокий гидролиз микробной биомассы. Кроме того, в проведенных ранее работах не изучен спектральный состав белковых веществ после ферментативной деструкции микробной биомассы и не установлена его взаимосвязь с функциональными свойствами ферментолизатов дрожжевых клеток. Все это указывает на необходимость разработки комбинированных методов регулируемой деструкции дрожжевой биомассы для получения белково-аминокислотных обогатителей пищи и кормов с заданными структурно-функциональными свойствами.
Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы состояла в совершенствовании основных этапов получения биологически активных добавок (БАД), белково-аминокислотных корректоров пищи и кормов, получаемых на основе направленной ферментативной конверсии высокомолекулярных полимеров дрожжевой биомассы, для повышения эффективности производства биологически полноценных продуктов пищевого и кормового назначения и использование их в АПК РФ.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
- проведение мониторинга существующих методов подготовки дрожжевой биомассы к ферментативной деструкции субклеточных структур;
- изучение степени баротермического воздействия на клеточные стенки (КС) дрожжей Saccharomyces cerevisiae для выделения белковых веществ;
Научная новизна работы. Получены и научно обоснованы экспериментальные данные в области биокаталитической деструкции полимеров дрожжевой биомассы:
- изучено влияние баротермической обработки дрожжевой биомассы на степень конверсии белково-полисахаридных полимеров клеточных стенок дрожжей;
- установлена зависимость глубины гидролиза субклеточных структур дрожжевой биомассы от параметров предобработки дрожжевой биомассы (давления, температуры, длительности воздействия);
- исследован спектральный состав белковых веществ ферментолизатов дрожжевой биомассы;
- установлено влияние ферментативных систем на степень деструкции белковых веществ дрожжевой клетки;
- определены параметры процесса направленной биокаталитической конверсии субклеточных полимеров дрожжей с получением ферментолизатов с заданным структурно-фракционным составом;
- установлена взаимосвязь спектрального состава дрожжевых гидролизатов с функциональными свойствами получаемых продуктов.
Практическая значимость. На основе установленных закономерностей баротермической и ферментативной конверсии полимеров микробной клетки усовершенствована технология получения белково-аминокислотных обогатителей пищи и кормов. Разработанная технология позволяет повысить степень деструкции внутриклеточных структур дрожжей и получать добавки целевого назначения с заданными структурно-функциональными свойствами аппаратурно-технологическая схема. На целевые продукты разработана нормативная документация (ТУ 9182-056-00334586-2012 «Белково-аминокислотный биокорректор пищи»; ТИ по производству белково-аминокислотного биокорректора пищи; ТУ 9182-114-00334586-2013 «Кормовая белково-аминокислотная добавка Протамин»; ТИ по производству кормовой белково-аминокислотной добавки Протамин; ТУ 9182-115-00334586-2013 «БАД Суперпротамин»). Проведена наработка опытных партий белково-аминокислотных обогатителей пищи и кормов на ЗАО «Биопрогресс» ВНИТИБП (Московская область, Щелковский район).
Показана перспективность использования продуктов конверсии дрожжевой биомассы, в качестве эффективных добавок повышающих биологическую ценность пищи и кормов. Проведены испытания по использованию ферментолизатов дрожжей для обогащения ферментированных молочных продуктов, косметических изделий и стартовых комбикормов для личинок осетровых рыб, подтвердившие их высокую биологическую эффективность.
Положения, выносимые на защиту:
-
Результаты исследований по влиянию баротермической предобработки дрожжевой биомассы на повышение степени биокаталитического воздействия ферментативных систем на высокомолекулярные полимеры клеточных стенок и протоплазмы клетки.
-
Закономерности направленной ферментативной деструкции дрожжевой биомассы с получением ферментолизатов с заданным фракционным составом белковых веществ.
-
Усовершенствованная технология получения биологически активных добавок (БАД), белково-аминокислотных корректоров пищи и кормов.
-
Спектральный состав целевых добавок и перспектива их применения для повышения биологической ценности продуктов питания и кормов.
Апробация работы. Основные положения работы были представлены на следующих конференциях: Международная конференции «Биология – наука ХХI века». Москва, 2012 г; 46-ая Международная научная конференция молодых ученых, докторантов, аспирантов и соискателей ученых степеней доктора и кандидата наук «Эффективность применения средств химизации в современных технологиях возделывания сельскохозяйственных культур. ГНУ ВНИИ агрохимии им. Д.Н.Прянишникова, Москва, 2012 г; Международная конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», Мурманск, 2012 г; Всероссийская научно-практическая конференция «Научно-инновационные аспекты при создании продуктов здорового питания», Углич, 2012 г; VII Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2013 г; Всероссийская научно-практическая конференция «Пищевые ингредиенты и инновационные технологии в производстве продуктов питания» С.-Петербург, 2013.
Публикации. По теме диссертационной работы подготовлено и опубликовано 15 печатных работ, из них 5 статей в журналах, рекомендуемых ВАК.
Структура и объем диссертации
Структура и биохимический состав дрожжевой клетки
Таким образом, производство микробной биомассы для употребления в пищу является основной задачей для промышленности и научного сообщества. Интерес к этой проблеме подтверждается многими работами последних лет. Вопрос использования микробного белка в пищу в настоящее время нельзя считать решенным, так как в некоторых случаях белок не удовлетворяет полностью санитарно-гигиеническим требованиям, предъявляемым к пищевым продуктам. В связи с этим проводятся исследования по подбору непатогенных продуцентов белковых веществ, способов получения ферментализатов микробной биомассы и по их взаимосвязи со структурным и биохимическим составом [54]. Рационально подобранные мультиэнзимная система, условия биокатализа и микроорганизм, как исходный субстрат позволят проводить направленный гидролиз высокомолекулярных полимеров микробной биомассы для получения биологически активных добавок с заданными функциональными свойствами.
Так специалистами ГНУ ВНИИ пищевой биотехнологии проведено сравнительное исследование более 100 штаммов дрожжей S. cerevisiae, на перспективность использования их в качестве продуцента белка и аминокислот. Критериями отбора являлись накопление биомассы в процессе роста дрожжей, а так же удельная скорость роста дрожжей, так называемая генеративная активность дрожжей. Удалось отобрать штаммы дрожжей с содержанием общего белка от 37,9 до 58,1% [51].
Позже в продолжение этой тематики были проведены исследования, направленные на изучение биохимического и фракционного состава ферметализатов дрожжевой биомассы, полученных на разных этапах процесса биокатализа внутриклеточных полимеров для выявления их функционального значения. В работе использовали ферментный препарат протеолитического и глюканолитического действия глюканопротооризин Г18Х (продуцент Asp. oryzae РОМ 156), активность которого по общей протеолитической способности (ПС) составила 150 ед/см3, по -глюканазе (-ГКС) - 140 ед/см3[49, 56, 69]. Объектом исследования служили сухие пекарские дрожжи S. cerevisiae, а лабораторные исследования выполнялись с использованием современных физико-химических, спектрофотометрических методов анализа. С помощью подобранного ферментного комплекса и условий проведения биокатализа был осуществлен направленный ферментативный гидролиз и наработаны экспериментальные образцы ферментализатов с различной степенью деструкции внутриклеточных биополимеров. Результаты исследований показали, что при 12-ти часовом гидролизе происходит наиболее полная и глубокая деструкция белковых полимеров клетки, содержание аминного азота при этом достигает 5,1% а.с.в., свободных аминокислот - 89% от общего количества белковых веществ. При 4-х часовом гидролизе высокомолекулярные полимеры дрожжевой биомассы переходят в растворимое состояние, концентрация аминного азота составляет 2,8% а.с.в. и 30% аминокислот в свободной форме. Полученные результаты указывают на возможность проведения регулируемого процесса ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы с получением ферментализатов (белково-аминокислотных смесей) заданного состава. [58].
В работах Римаревой Л.В. с соавторами был разработан регулируемый биокаталитический процесс направленной трансформации белково-полисахаридных матриксов микробной клетки для получения пищевых белково-аминокислотных биокорректоров с заданным структурно-фракционным составом. Для деструкции биополимеров в подготовленную дрожжевую суспензию вносили комплексную ферментную систему (КФС) в подобранной дозировке. Процесс ферментативного гидролиза проводили в течение 4, 8 и 16 часов. Результаты исследований показали, что при 4-х часовом гидролизе высокомолекулярные полимеры дрожжевой биомассы переходят в растворимое состояние. Концентрация аминного азота в готовом препарате составляет 2,8% на абсолютно сухое вещество, при 8-ми часовом гидролизе – 4,3% на а.с.в., а при 16 часовом – 5,8%.; содержание свободных аминокислот – 15,4%, 36,5% и 65,4% от общего количества белковых веществ соответственно. Увеличение продолжительности гидролиза ведет к увеличению содержания низкомолекулярных соединений и свободных аминокислот. Работой показана возможность регулировать процессом гидролиза дрожжевой биомассы, варьируя дозировкой ферментов и длительностью катализа. Однако не выявлен спектральный состав белковых веществ при получении продуктов ферментолиза, не установлена глубина гидролиза дрожжевого белка и качественный и количественный состав низкомолекулярных пептидов и аминокислот [59].
Ферментализаты дрожжевой биомассы помимо своей пищевой ценности проявляют еще и медико-биологическую активность. В работе Орловой Е.В. с соавторами описан эффект селективного апоптоза, вызываемый ферментализатами дрожжевой биомассы S. cerevisiae с различной степенью деструкции субклеточных структур, на клетках перевиваемых опухолей. Результаты исследований показали, что цитотоксический эффект полностью отсутствовал для нормальных лейкоцитов человека, а проявлялся только на линиях перевиваемых опухолей. [44].
Проводимые во ВНИИПБТ исследования [72] показали возможность использования ферментов микробного происхождения, преимущественно из микромицетов, для гидролиза дрожжевой биомассы S. cerevisiae. Полученный на основе регулируемого ферментативного биокатализа высокомолекулярных полимеров клетки ферментализат дрожжей (Суперпротамин) представляет собой препарат, содержащий полный набор свободных аминокислот, в том числе незаменимых, биологически активные пептиды, витамины, особенно группы B, а так же микро- и макроэлементы. Медико-биологические испытания этого препарата показали его высокую иммуностимулирующую способность[53]. Неблагоприятная экологическая обстановка, вызванная нарушением озонового слоя Земли и, как следствие, увеличением интенсивности ионизирующего бета-излучения, ослабляет защитные функции человека, что приводит к негативным последствиям, которые выражаются в снижении иммунологической толерантности при патологических состояниях.
В настоящее время известен широкий спектр природных и синтетических экзогенных антиоксидантов, поступающих в организм с пищей. При этом природные антиоксиданты обладают рядом преимуществ по сравнению с синтетическими, включающим отсутствие побочных и кумулятивных эффектов, а также более низкую токсичность. Основными классами природных антиоксидантов являются каротиноиды, тиолы, фенольные соединения и пептиды. В литературе описаны последовательности более 100 антиоксидантных пептидов, выделенных из различных источников, а также полученных при конверсии белков с использованием ферментов и / или микроорганизмов [122]. Однако механизмы их антиоксидантного действия остаются недостаточно изученными. В последнее время было установлено, что БАД Суперпротамин, полученный из дрожжевой биомассы на основе ферментативной деструкции внутриклеточных полимеров, является эффективным антиоксидантом, действие которого проявляется в нормализации уровня активности глутатион-зависимого звена. По-видимому, содержащиеся в препарате растворимые биологически-активные вещества, достаточно легко преодалевают гематоэнцефалический барьер и всасываются в кровь, а затем, вступают в биохимические процессы в организме, нормализуя систему клеточного и гуморального иммунитета, и проявляют антиоксидантные свойства [43].
Гель-хроматография (гель-фильтрация)
Процесс гидролиза дрожжевой биомассы оценивали по нарастанию в получаемых ферментолизатах концентрации растворимых сухих веществ (по рефрактометру), аминного азота, растворимого белка. В качестве контроля служила дрожжевая суспензия, не обработанная протеазами и подвергнутая автолизу в условиях, аналогичных опыту. Концентрацию аминного азота определяли медным способом в отсутствие аммонийных солей [9]. Массовую долю абсолютно сухих веществ дрожжевой суспензии устанавливали методом высушивания до постоянной величины при 105С [64]. Концентрацию общих белковых веществ суспензии и растворимого белка в супернатантах получаемых гидролизатов определяли по содержанию азота методом Кьельдаля на автоматической установке определения азота Vadopest 10 (Gerhardt, Германия) с использованием актоматического титратора DL 15 (Meltler Toledo, Швейцария). Степень гидролиза дрожжевого белка рассчитывали по количеству переведенного в растворимую форму белка и выражали в процентах от общего содержания белковых веществ в исходной суспензии [69]. Содержание растворимого белка определяли по методу Лоури. Метод Лоури основан на двух реакциях, приводящих к образованию сине-фиолетовой окраски: образовании биуретового комплекса при действии на белок сернокислой меди в щелочном растворе и восстановлении фосфомолибденового, фосфовольфрамового реагента (реактива Фолина-Чокальта) тирозином, триптифаном и другими аминокислотами, содержащимися в белке. Окрашенный раствор синего цвета колориметрировали при длине волны 750 нм. Далее по калибровочной кривой определяли концентрацию белка в растворе [20].
Концентрацию общих аминокислот определяли после гидролиза анализируемых образцов с 6 н НС1 на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 6 ч и последующим автоклавированием в течение 2 ч при 120С. Содержание свободных аминокислот, образующихся в результате гидролиза дрожжевой суспензии, определяли после осаждения белков и пептидов трихлоруксусной кислотой (ТХУ) [63]. Затем полученные пробы центрифугировали 15 мин при 6000g. Надосадочную жидкость использовали для количественного и качественного анализа общих и свободных аминокислот, который проводили по методу Мура и Штейна на аминокислотном анализаторе LC 200 фирмы “Biotronik”(Германия) и “Varian” (США); просчет аминограмм осуществляли методом сравнения площадей стандарта и образца [21].
Масс-спектрометрический анализ (LCMS) низкомолекулярных белковых фракций (с молекулярной массой менее 1000 Да) осуществляли на квадропульной масс-спектрометрической системе для ВЭЖХ Agilent 6120 [67]. Подготовку образцов к спектральному анализу осуществляли следующим образом. Перед хроматографированием для каждого образца была проведена следующая пробоподготовка: в круглодонную колбу объемом 100 мл помещали навеску образца (25мл), добавляли ацетон (25мл). Смесь перемешивали магнитной мешалкой в течение 12 часов, тем самым осаждая высокомолекулярные фракции. Осадок отфильтровывали на фильтровальной бумаге, фильтрат собирали и концентрировали путем упаривания ацетона на роторном испарителе. В итоге получали прозрачное масло светло-желтого цвета разной интенсивности. Далее хроматографировали в обычном режиме элюентом ацетонитрил-вода. Содержание растворимых белков и высокомолекулярных пептидов определяли методом гельэлектрофореза на вертикальной камере Protein II (Био-Рад, США) с белковыми маркерами от 1,4 до 250 кД.
Электронно-микроскопические исследования дрожжевых клеток Saсcharomyces cerevisiae и степени их ферментативной деструкции, размеров и морфологии проводили с применением методов атомно-силовой, сканирующей электронной микроскопии: - на приборе ИНТЕГРА Прима (NT-MDT, Россия) в полуконтактном режиме. Пробы осаждали и высушивали на подложках из свежесколотой слюды, измерения осуществляли на воздухе; для получения достоверных результатов для каждого образца использовали результаты серии измерений.
На электронном микроскопе JEOL 1200 СХ II (Япония). Для микроскопирования срезы готовили на ультрамикротоме LKB III (Австрия). Полутонкие срезы докрашивали толуидиновым синим, и просматривали в световом микроскопе "Поливар" (Австрия). Ультратонкие срезы докрашивали цитратом свинца, просматривали и фотографировали в электронном микроскопе JEOL.
На сканирующем электронном микроскопе Hitachi ТМ-3000 в режиме низкого вакуума микроскопирование проводили при увеличении до 30000х и разрешении до 10 нм. Накопление растворимых углеводов в среде при ферментолизе полисахаридов клеточных стенок микробной биомассы определяли колориметрическим антроновым методом [27].
Исследования по определению уровня ферментативной активности используемых ферментных препаратов проводили по методикам, изложенным в национальных стандартах Российской Федерации – ГОСТ Р «Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения активности».
Общая протеолитическая активность характеризует способность фермента катализировать расщепление белков до аминокислот или пептидов. Протеолитическую активность (ПС) определяли модифицированным методом Ансона по гидролизу гемоглобина препаратом фермента с последующей его инактивацией ТХУ [15, 61]. Методы определения протеолитической активности основаны на гидролизе гемоглобина (животного белка) в кислой (рН 3,0), слабокислой (рН 5,3), нейтральной (рН 7,0) и щелочной (рН 9,0) зонах исследуемым ферментным препаратом, находящимся в растворе, до низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот с последующей инактивацией фермента путем осаждения непрогидролизованного белка ТХУ и определением образовавших пептидов и свободных аминокислот. За единицу общей протеолитической активности (ПС) принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при 30 С приводит гемоглобин в неосаждаемое состояние ТХУ в количестве, соответствующем 1 мкмолю тирозина (1 мкмоль тирозина равен 0,181 мг); активность выражается в ед.ПС/г или см3 испытуемого препарата [15].
Количество белка, превращенного в низкомолекулярные пептиды и аминокислоты, определяли по оптической плотности на спектрофотометре при длине волны = 275 нм или по реакции свободных аминокислот с реактивом Фолина и дальнейшим определением оптической плотности образующихся голубых растворов на фотоэлектроколориметре при длине световой волны = 670 нм. Определение протеолитической активности слабокислых протеаз осуществляли при рН реакционной смеси 5,3 ± 0,2, нейтральных протеаз – при рН 7,0 ± 0,2 и рассчитывали по градуировочному графику, построенному для тирозина [61].
Метод определения экзо-b-глюканазной активности основан на определении редуцирующих (восстанавливающих) сахаров, образующихся при действии фермента -глюканазы на ячменный b-глюкан [16, 46]. За единицу -глюканазной активности (1 ед.-ГкС) принимают колич ество фермента, действующего на -глюкан из ячменя с высвобождением 1 мкмоля восстанавливающих сахаров (в глюкозном эквиваленте), образующихся за 1 мин при стандартных условиях (температура 50 С и значение рН 5,0) [16]. Содержание редуцирующих сахаров, образующихся в результате ферментативной реакции, определяли колориметрическим методом, основанным на взаимодействии сахаров с реактивом Шомоди–Нельсона [46]. В результате этой реакции образуется соединение голубого цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию редуцирующих сахаров, образовавшихся в процессе ферментативной реакции. Интенсивность окраски полученных растворов измеряли на фотоэлектроколориметре при длине световой волны 610 нм; активность выражается в ед.-ГкС/г или см3 испытуемого препарата.
Исследование биохимического состава ферментолизатов
Электронно-микроскопические исследования дрожжевых клеток Saсcharomyces cerevisiae, степени их ферментативной деструкции, размеров и морфологии проводили с применением методов атомно-силовой, сканирующей электронной микроскопии на электронном микроскопе JEOL 1200 СХ II (Япония), на приборе ИНТЕГРА Прима (NT-MDT, Россия) в полу-контактном режиме и сканирующем электронном микроскопе Hitachi ТМ-3000.
Исходные дрожжевые клетки (контрольная группа клеток, не обработанных ферментами) при электронном микроскопировании на сканирующем микроскопе ТМ-3000 были примерно одинакового размера, округло-овальной, вытянутой овальной, реже неправильной формы (рис.25). Встречались почкующиеся клетки. Клеточная оболочка преимущественно одинаковой толщины, имела неравномерную плотность, в отдельных клетках отмечалось некоторое утолщение стенок.
Исследована степень биокаталитической деструкции дрожжевой биомассы в процессе воздействия ферментативных систем (ФС) с различной субстратной специфичностью: на 1-ой стадии применяли ФС-1 (источник ферментов глюкано- и маннанолитического действия); 2-ой стадии – ФС-2 (комплекс протеиназ, глюканазы и маннаназы); 3-ей стадии – ФС-3 (комплекс протеиназ, пептидаз, -глюканазы и маннаназы). Известно, что основными структурообразующими полисахаридами клеточной стенки (КС) являются -глюканы и маннаны, находящиеся приблизительно в равных количествах и в сумме составляющие порядка 60 – 90 % сухой массы клеточной стенки, оставшаяся часть приходится на долю белка, хитина и липидов. Поэтому 1 стадию ферментолиза дрожжей осуществляли путем каталитической деструкции клеточных стенок ферментами глюканолитического и маннанолитического действия (рис.26). Исходное ультраструктурное строение клеток на 1-ой стадии ферментолиза изменялось несущественно. В большинстве клеток отмечено образование щелевидных пространств в цитоплазматической мембране между стенкой и цитоплазмой, при этом мембрана приобретала более расслоенный вид. В одних клетках она была утолщена, состояла из темных отдельных коротких волоконец, плотно прилегающих к цитоплазме. В других стенка имела зернистое строение, не разделялась на слои, но между ней и цитоплазмой также имелись щелевидные пространства различной толщины. а) б) Рисунок 26 - 1 стадия ферментативного катализа. Дрожжевые клетки после частичного гидролиза ферментами глюкано- и маннанолитического действия На рисунке 26 заметны изменения клеточной стенки при воздействии ферментов -глюканазного и маннаназного действия на 1 стадии процесса, увеличивающие проницаемость внутренней мембраны. Как видно, цитоплазма анализируемых клеток разной плотности, клеточные стенки приобрели более «рыхлую» структуру. С целью повышения степени деструкции клеточных стенок и, учитывая, что полисахариды находятся в комплексе с белками, на 2 стадии ферментолиза в состав ферментативной системы вводили протеолитические ферменты. Эти ферменты представлены протеиназами, катализирующими частичный гидролиз белка до пептидов, т.к. важно было не разрушить полимерную структуру белковых веществ протоплазмы. Этот этап ферментолиза предусмотрен в технологии получения белковых обогатителей пищи на основе дрожжевой биомассы.
В результате биокаталитической деструкции клеточной стенки дрожжей происходило частичное высвобождение деполимеризированных субклеточных структур. На рисунке 27, полученном при сканирующей атомно-силовой микроскопии на приборе ИНТЕГРА Прима, видно присутствие как целых клеток, так и разрушенных фрагментов клетки, образующихся на 2-ой стадии биокатализа КС дрожжей ферментами протеолитического и гемицеллюлазного действия.
Далее в процессе биокатализа дрожжевой клетки подобранным ферментативным комплексом, содержащим протеазы, -глюканазы и маннаназы, начиналась более глубокая деструкция биополимеров клеточной стенки. При этом клетка теряла свою форму, а участки деструкции клеточной стенки при микроскопировании имели вид отдельных фрагментов различной величины и формы (рис. 28а). Целостность клеточной стенки дрожжей под действием комплекса ферментов нарушалась в еще большей степени (рис.28б).
Таким образом, в дрожжевых клетках на 2-ой стадии ферментолиза наибольшие изменения претерпевали клеточные стенки. Для получения белково-аминокислотного обогатителя пищи с преобладающим содержанием свободных аминокислот и коротких пептидов используется протеолитический комплекс, в составе которого присутствуют пептидазы – ферменты, катализирующие гидролиз белков до свободных аминокислот. В дрожжевых клетках на 3-ей стадии ферментолиза, когда были применены не только комплексы ферментов, лизирующих клеточные стенки, но и протеиназы и пептидазы, катализирующие глубокий гидролиз белковых веществ протоплазмы, наиболее выражены явления деструкции цитоплазмы. В большинстве клеток сохранились лишь отдельные ее фрагменты и окружающая клетку стенка. Последняя чаще истончена, реже утолщена, светлая, прозрачная. Органоиды в сохранившихся участках цитоплазмы практически отсутствовали. На 3-ей стадии по сравнению со 2-ой стадией изменения клеток более заметны. Результаты ферментативного катализа выражены сильнее, отчетливо видны признаки деструкции в цитоплазме. В таких клетках нередко сохранялись лишь остатки цитоплазмы и клеточной стенки неправильной формы и различного размера (рис. 29). На данном этапе в результате эффективного гидролиза белковых веществ протоплазмы до пептидов и аминокислот были получены ферментолизаты дрожжевой клетки, обладающие антиоксидантной и иммуномодулирующей активностью. Рисунок 29 - Результаты 3 стадии ферментативного гидролиза: клетки с сохраненным контуром клеточной стенкой и остатками цитоплазмы
В результате глубокой ферментативной деструкции субклеточных структур под действием комплекса протеиназ и пептидаз, а также ферментов, оказывающих лизирующее воздействие на КС, получены ферментолизаты дрожжевой биомассы с размерами деполимеризованных фрагментов полисахаридов клеточных стенок и белковых веществ протоплазмы от 10 до 250 нм. Исследования функциональных свойств полученных ферментолизатов микробной биомассы выявили их селективную цитотоксичность по отношению к онкоклеткам, при этом исходные клетки не обладали антиканцерогенной способностью. Таким образом, в результате исследований с помощью электронной микроскопии проиллюстрировано влияние ферментативных систем различной субстратной специфичности на степень деструкции субклеточных структур дрожжей, подтверждающее эффективное действие ферментов, катализирующих биодеструкцию клеточных стенок и белковых веществ дрожжевой биомассы, в технологиях белково-аминокислотных обогатителей пищи, кормов и БАД с функциональными свойствами.
Влияние баротермического воздействия на эффективность процесса ферментативной деструкции внутриклеточных структур дрожжей .
Образцы йогуртов, полученные с добавлением суперпротамина, отличаются от образца 3 (рис.31, 32). Они богаче по фракционному составу, особенно образец номер 1, где преобладают вещества с массами до 300Да. Можно четко увидеть пики с массами 124, 160, 180, 198, 212 и 230Да. Так же в этом образце есть пики в области среднеполярных веществ с массами 373, 389, 401Да, можно предположить, что это гибридные соединения аминокислот с короткими углеводами или жирными кислотами. Спектр образца 2 идентичен образцу 1 по фракционному составу, но в нем отсутствуют вещества с массами 373, 389 и 401Да. В образцах йогурта 1 и 2 более 50% свободных аминокислот и коротких пептидов с молекулярной массой менее 200 Да (табл. 12). Контрольный образец 3 представляет собой коммерчески доступный йогурт – без добавок суперпротамина. Содержание аминокислот и коротких пептидов в нем крайне мало (вещества практически не детектируются прибором, спектр пустой) (рис.33). В образце натурального йогурта без суперпротамина содержание свободных аминокислот и коротких пептидов ниже, чем в опытных образцах и составляет около 10% (рис. 34).
Результаты исследований показали, что в образце 3 (контроль 1) содержание низкомолекулярных пептидов с М.М. менее 1000Да около 1%. В образце 4 (контроль 2), йогурт натуральный, приготовленный сквашиванием молока, в котором отсутствует Протамин, содержание низкомолекулярных пептидов с М.М. менее 300 Да около 20 %. В опытных образцах 1 и 2 содержание низкомолекулярных пептидов с М.М. менее 300 Да 66,5 % и 83,4% соответственно (табл. 12).
Полученные результаты спектрального анализа подтвердились при определении состава свободных аминокислот в контрольном и опытном образцах на аминокислотном анализаторе SmartlineA0323V2, фирмы “KNAUER”(Германия) (табл. 13). Анализировали содержание аминокислот в двух продуктах: Образец 1: продукт кисломолочный (контроль)
Общее количество 0,92303 1,53 Анализируя результаты, можно сделать вывод о том, что добавление в продукт препарата Суперпротамин, существенно улучшает его пищевые свойства, обогащая необходимыми аминокислотами.
Проведены испытания ферментолизата дрожжей в виде препарата Протамин в составе стартового комбикорма для личинок осетровых рыб, подтвердившие биологическую эффективность препарата (повышение интенсивности роста личинок на 18-48%, увеличение массы выращенных мальков на 20-55%).
Испытания проводили во ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт пресноводного рыбного хозяйства» в лаборатории физиологии и кормления рыб.
Исследованы питательные свойства ферментолизата дрожжевой биомассы как макрокомпонента стартового комбикорма для личинок осетровых рыб на начальном этапе постэмбрионального развития. Для проведения испытаний была наработана экспериментальная партия кормового препарата Протамин. Дрожжевую биомассу гидролизовали с использованием подобранного ферментативного комплекса, содержащего -глюканазу и протеазы (300 ед. -ГкС, 2 ед. ПС/г дрожжей). Полученный кормовой препарат содержал 1,75% аминного азота и около 50% от общих белковых веществ низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот (рис. 34). Исследования выполнялись на личинках стерляди. Протамин вводили в смесь в количестве 30%. Для испытаний были подготовлены несколько вариантов кормосмесей. Во всех вариантах компонентный состав кормов представлял собой одинаковый набор сырья, состоящий из строго определенного сочетания продуктов животного и растительного происхождения в одинаковых количественных соотношениях. Исключение составлял испытуемый вариант в который был добавлен Протамин. Результаты испытаний представлены в таблице 14.
Результаты показали, что ферментолизат дрожжей Протамин является эффективным препаратом для использования его в качестве макрокомпонентного стартера для личинок осетровых рыб. Средняя масса личинок при использовании препарата увеличивалась в 1, 2 – 1,9 раза по сравнению с контрольными вариантами.
Проведены испытания в косметологии по использованию ферментолизатов дрожжевой биомассы в составе косметических изделий.
БАД Протамин и Суперпротамин, полученные на основе разработанной технологии направленной ферментативной деструкции дрожжевой биомассы, использованы при наработке опытных партий шампуней и косметических кремов на ОАО «Свобода». Применение добавок позволило повысить биологическую эффективность воздействия изделий на кожу.
Для проведения испытаний ферментативный гидролиз дрожжевой биомассы осуществляли с использованием комплекса ферментов, содержащих -глюканазу, протеиназы и пептидазы (300 ед. -ГкС, 2 ед. ПС и 10 ед. ГПС/г дрожжей). Ферментативный гидролиз осуществляли в течение 4 и 12 часов. Характеристика целевых продуктов приведена в таблице 15.
С использованием полученных белково-аминокислотных добавок Протамин и Суперпротамин наработаны опытно-промышленные партии косметических кремов. В качестве контроля использовали косметический крем «Наташа». Испытание биологической эффективности этих кремов на волонтерах показали, что крема хорошо впитываются в кожу, легко наносятся, питают кожу, восстанавливая ее структуру. По сравнению с контрольным образцом испытанные крема были более эффективны для разглаживания морщин и лифтингого эффекта. Крем, приготовленный с препаратом Суперпротамин, проявил более высокую эффективность на кожные покровы, благодаря высокому содержанию в нем легкоусвояемых биологически активных веществ.
Белково-аминокислотные добавки Протамин и Суперпротамин были использованы в составе шампуней. Сенсорная и качественные оценки наработанных шампуней показали, что шампуни мягко и хорошо очищают, не повреждая структуру волос, бережно ухаживают за кожей головы, нормализуют рН баланс, защищают волосы от вредного воздействия окружающей среды, придают упругость и эластичность волосам.
