Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Актуальность применения биологически активных веществна основе хитозана в ветеринарии 11
1.2.Физико-химические свойства хитина и хитозана 13
1.3. Способы и источники получения хитина и хитозана 20
1.4. Биологически-активные препараты на основе хитозана и его производных 29
1.5. Меланины: источники, свойства, возможности использования 33
1.6. Использование препаратов на основе хитозана для лечения сельскохозяйственных животных 39
Глава 2. Объект и методы исследований 45
2.1. Теоретическое обоснование стадий технологии получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчёл 45
2.2. Теоретическое обоснование получения меланина, как сопутствующего продукта, при получении хитозан-меланинового комплекса 50
2.3. Теоретическое обоснование состава экспериментального комплексного препарата на основе хитозан-меланинового комплекса 53
2.4. Программа экспериментальных исследований 57
2.5. Разработка этапов получения хитин-меланинового, хитозан-меланинового комплексов и меланина 60
2.6. Использование общепринятых методик исследований полученных биологически активных веществ 64
2.7. Приготовление экспериментального комплексного препарата на основе хитозан-меланинового комплекса 69
2.8. Методики биохимических и иммунологических исследо ваний крови для определения общей резистентности молодняка животных 70
2.9. Методика математической обработки экспериментальных данных 74
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 77
3.1. Проведение экспериментов по разработке технологии полу чения хитозан-меланинового комплекса и меланина 77
3.1.1. Подготовка и исследование рабочей массы из исходного сырья - пчелиного подмора 77
3.1.2. Получение хитин-мел анинового комплекса из подготовленной рабочей массы 79
3.1.3. Получение хитозан-меланинового комплекса (оптимизация процесса) 82
3.1.4. Выделение меланина в качестве сопутствующего продукта 91 3.1..5. Определение физико-химических характеристик хитозан-меланинового комплекса и меланина 93
3.1.6. Исследование микробиологических и токсикологических характеристик хитозан-меланинового комплекса 98
3.1.7. Разработка состава экспериментального комплексного препарата на основе хитозан-меланинового комплекса 101 3.2.Производственные испытания эффективности хитозан-меланинового комплекса и экспериментального комплексного препарата на его основе 104
3.2.1. Результаты производственных испытаний эффективности выпаивания хитозан-меланинового комплекса на телятах 109
3.2.2. Результаты производственных испытаний эффективности выпаивания исследуемых препаратов на поросятах 114
3.2.3. Результаты производственных испытаний эффективности выпаивания исследуемых препаратов на козлятах 121
3.2.4. Экономическая эффективность использования хитозан-меланинового комплекса и комплексного препарата на его основе 126
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 133
ВЫВОДЫ 138
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ 139
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 140
ПРИЛОЖЕНИЯ 155
- Актуальность применения биологически активных веществна основе хитозана в ветеринарии
- Теоретическое обоснование стадий технологии получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчёл
- Подготовка и исследование рабочей массы из исходного сырья - пчелиного подмора
Введение к работе
Актуальность темы.
Уникальные свойства хитина и хитозана открывают большие перспективы для их применения в быту, медицине, ветеринарии, косметологии, фармацевтической промышленности.
Эти природные полимеры имеют ряд важных свойств, как, например, высокую биологическую активность, совместимость с тканями человека, животных и растений, оказывают иммуностимулирующее, противоопухолевое, бактериостатическое, ранозаживляющее действие. Они не загрязняют окружающую среду, так как полностью разлагаются ферментами микроорганизмов, а также снижают воздействие болезнетворных микроорганизмов, адсорбируясь на стенках желудочно-кишечного тракта человека и животных (Фомичев, 2004).
Повышенное внимание к свойствам хитина и его производного — хитозана, возникшее более трех десятилетий назад, является актуальным и в настоящее время. Несмотря на многочисленные исследования свойств (Варламов, 2002; Немцев, 2006; Muzzarelli, 1997), возможности применения хитозанов и их производных в различных отраслях деятельности человека далеко не исчерпаны. Их число и направленность действия непрерывно возрастают по мере дальнейшего изучения свойств этих биополимеров.
Актуальным является использование наиболее перспективного сырьевого источника, а именно - подмора пчел, для выделения хитина, хитозана и сопутствующего ему ценного биологически активного вещества - меланина, и разработка на его основе технологии получения препаратов с максимальным сохранением комплекса природных соединений (Комаров, 2003). За счет широкого распространения пчеловодства в нашей стране — по состоянию на 2005 г. в РФ во всех категориях хозяйств имелось 5,5 млн. пчелиных семей, существует возможность получать хитиновое сырьё (подмор пчел) в значительных масштабах (от 6 до 10 тысяч тонн в год). Весьма мало изученным является влияние комплексного воздействия хито- б зана и меланина на молодняк с.-х. животных в качестве биологически активной добавки, предотвращающей или смягчающей течение желудочно-кишечных заболеваний.
Цель работы — разработка технологии получения хитозан-меланинового комплекса и меланина из побочного продукта пчеловодства - подмора пчел с последующей разработкой на их основе нового биологически активного препарата для профилактики заболеваний и дисфункций желудочно-кишечного тракта молодняка сельскохозяйственных животных.
Задачи исследования:
1. Разработать рациональную технологию получения хитозан- меланинового комплекса из подмора пчёл, обеспечивающую более высо кий выход хитозана и меланина.
Изучить физико-химические характеристики, токсичность хитозан-меланинового комплекса.
Разработать рецептуру экспериментального комплексного препарата с полифункциональными свойствами на основе хитозан-меланинового комплекса с включением сухих экстрактов фитосборов.
Провести исследования биологической эффективности хитозан-меланинового комплекса и комплексного экспериментального препарата на его основе при выпаивании их молодняку сельскохозяйственных животных;
Определить рациональные сроки и оптимальные дозы выпаивания хитозан-меланинового комплекса и комплексного препарата на его основе для молодняка различных видов сельскохозяйственных животных.
Определить экономическую эффективность, экологическую безопасность хитозан-меланинового комплекса и комплексного препарата на его основе при применении его в ветеринарии.
Научная новизна работы.
Разработана малостадийная, экологически безопасная технология получения хитозан-меланинового комплекса (ХМК) из подмора пчёл, по- зволяющая с наименьшими энергетическими затратами при использовании 10% р-ра NaOH, 78-82 С, экспозиции 1,5-2,0 ч в стадии депротеинирова-ния и 30% р-ра NaOH, 90-95 С, 1,5-2,0 ч - в стадии дезацетилирования выделить 22,4% ХМК и 6,4% меланина от исходного сырья. При этом хи-тозан имеет степень дезацетилирования 82-89%, меланин содержит 1-10 спин активных парамагнитных центров на 1 г сухого вещества, что подтверждает высокую биологическую активность полученных веществ. Новизна предложенных технологических решений подтверждена патентом на изобретение № 2382051, приоритет от 21.07.2010, опубл. 20.02.2010 г.
Впервые получены РЖ-характеристики, изучен микроэлементный состав, определен класс токсичности ХМК.
Установлено, что использование ХМК снижает в кишечнике молодняка с.-х. животных количество бактерий рода Escherichia coli, Proteus, Citrobacter, предупреждает возникновение желудочно-кишечных заболеваний, повышает неспецифическую резистентность организма животных, сохранность и живую массу в раннем возрасте. Предложена рецептура нового комплексного препарата на основе ХМК с включением экстрактов фитосборов.
Научно-практическая значимость. Получены экспериментальные данные по оптимизации стадий технологии получения хитозан-меланинового комплекса, открывающие перспективы его использования в животноводстве. Разработана рецептура препарата на его основе с использованием экстрактов фитосборов. Для производства хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел разработаны ТУ на ХМК, утвержденные Министерством сельского хозяйства и центром стандартизации и метрологии Ставропольского края.
Проведенные испытания хитозан-меланинового комплекса и экспериментального комплексного препарата на его на основе показали, что при выпаивании их молодняку сельскохозяйственных животных наблюдается эффект общего повышения сопротивляемости организма к неблагоприят-
8 ным факторам внешней среды, сопровождающийся значительным уменьшением количества кишечных расстройств, увеличением живой массы животных.
Разработаны Методические указания и временная инструкция по применению хитозан-меланинового комплекса на молодняке с.-х. животных, утвержденные на ученом совете ГНУ Ставропольского НИИ животноводства и кормопроизводства (протокол № 4 от 4 мая 2009 года) и секции кормления Отделения зоотехнии Россельхозакадемии (протокол № 3 от 3 ноября 2009 года). Результаты использованы в производственной деятельности хозяйств Ставропольского края: ЗАО «им. Кирова» Труновского района, СПК колхозе «Новомарьевский» Шпаковского района, опытной станции ГНУ Ставропольского НИИ животноводства и кормопроизводства (СНИИЖК) и подтверждены актами о внедрении.
Работа выполнена согласно Государственному тематическому плану научных исследований ГНУ СНИИЖК в лаборатории биологически активных веществ отдела биотехнологии по заданию 06.03.02.02: «Разработать новые препараты биологически активных веществ, пробиотиков и способы регуляции биосинтеза основных компонентов животноводческой продукции, обеспечивающие повышение продуктивности и резистентности сельскохозяйственных животных и улучшения биологической полноценности продукции» - № Госрегистрации 15070.4003005276, 06.8.002.6.
Основные положения, выносимые на защиту: разработаная малостадийная, экологически безопасная технология получения биологически активных веществ из подмора пчёл, обеспечивает выход хитозан-меланинового комплекса — 22,4% и меланина - 6,4%;
ХМК стабилен, однороден по составу, не токсичен, не содержит патогенной микрофлоры; хитозан имеет степень дезацетилирования - 82-89%, меланин — 110 спин активных парамагнитных центров на 1 г сухого вещества; применение хитозан-меланинового комплекса на молодняке с.-х.
9 животных в дозе 15 мг/кг живой массы 2 раза в день снижает содержание в кишечнике бактерий рода Е. coli, Proteus, Citrobacter на 37,9-68,9%, предупреждает возникновение желудочно-кишечных заболеваний в 6,7-20,0% случаев, повышает естественную резистентность, сохранность животных на 9,4-50% и их живую массу в раннем возрасте на 5,1-41,7%; - использование ХМК и экспериментального препарата на его основе в животноводстве экономически выгодно и позволяет получить дополнительную продукцию за счет лучшей сохранности и развития молодняка с.-х. животных.
Апробация работы. Результаты работы представлены на: V Международной конференции «Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья сельскохозяйственных животных» (23-24 ноября, Ставрополь, 2007 г.);
IX Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (13-17 октября, Ставрополь, 2008 г.);
Международной научно-практической конференции «Инновация в аграрном секторе Казахстана, посвященная 75-летию академика К.С. Саб-денова» (15-16 ноября, Казахстан, Алматы, 2008 г.);
Юбилейной Международной 2-ой научно-практической конференции, посвященной 40-летию образования СКНИИЖ «Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных» (23-24 марта, Краснодар, 2009 г.).
Результаты работы представлены на 3 международных выставках:
Международной выставке-конгрессе Высокие технологии. Инновации. Инвестиции (22-25 сентября, Санкт- Петербург, 2008 г.);
2-й Биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех-2008» (5-7 ноября, Москва, 2008 г.);
Международном салоне инноваций и инвестиций (26-28 августа, ВВЦ Москва, 2009 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, включая 1 патент на изобретение и 1 статью в журнале, рекомендованном ВАК РФ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 2 глав собственных исследований, выводов, предложений производству, списка использованных литературных источников, приложений. Работа изложена на 167 страницах, содержит 21 рисунок, 29 таблиц. Библиографический список состоит из 139 наименований, в том числе 16 зарубежных.
Актуальность применения биологически активных веществна основе хитозана в ветеринарии
Загрязнение среды обитания человека и разводимых им сельскохозяйственных животных приводит к тому, что системы организма, наиболее чувствительные к неблагоприятным воздействиям, подвергаются интоксикации всё новыми токсическими веществами и болезнетворными микроорганизмами, что вызывает дисфункцию этих систем, а затем и гибель животных. Это (падёж, отходы молодняка, непригодное к употреблению мясо животных) наносит огромный ущерб животноводству.
Основную роль защиты организма животных от вредных веществ и болезнетворных организмов, проникающих в организм с пищей, принимают на себя: 1) печень; 2) иммунная система; 3) желудочно-кишечный тракт совместно с почками и другими выделительными органами. Вследствие ряда факторов техногенного характера, возникающие массовые желудочно-кишечные заболевания, наблюдающиеся, в основном, у молодняка сельскохозяйственных животных, стали одной из основных причин, наносящих значительный экономический ущерб животноводству. Имея широкое распространение, эти заболевания вызывают большой отход новорождённых, который в разных странах мира составляет от 3 до 30% [91]. Низкая сохранность молодняка приводит к резкому снижению темпов воспроизводства стада. Кроме того, животные, переболевшие острой токсической диареей, отстают в росте и по уровню продуктивности уступают на 10-12% здоровым животным [90].
Существенная роль отведена своевременному лечению животных ветеринарными препаратами, в том числе антибиотиками. Однако длительное их применение для профилактики и лечения болезней и стимуляторов продуктивности животных привело к появлению антибиотико- резистентных условно-патогенных микроорганизмов с одновременным нарушением микрофлоры кишечника животных, что делает применение таких препаратов недостаточно эффективным. В связи с этим разработка новых средств на основе безвредных природных компонентов, обеспечивающих надёжное антимикробное действие и обладающих иммуномоду-лирующей активностью, является перспективным направлением современного научного поиска. Основным способом при этом должно являться воздействие на защитные системы организма для улучшения метаболизма токсических веществ и активации процессов элиминации [10, 132].
В последние годы, как в медицине, так и в животноводстве быстро развиваются и внедряются в практику методы, основанные на выведении из организма различных опасных веществ, попавших извне или образовавшихся непосредственно в самом организме при различных заболеваниях. Одним из таких методов является использование в качестве сорбента хитозана - одного из производных хитина, широко распространённого в природе аминополисахарида [15].
О большом интересе к проблемам изучения этих биополимеров, технологии их получения и использования свидетельствуют восемь международных конференций по хитину и хитозану, проведенных за последние 27 лет: США (1977), Япония (1982), Италия (1985), Норвегия (1988), США (1991), Польша (1994), Франция (1997). В России за прошедшие годы хитину и хитозану были посвящены девять конференций: Владивосток (1983), Мурманск (1987), Москва (1991, 1995, 1999 и 2001), Санкт-Петербург (2003), Казань (2006), Ставрополь (2008). Из них три последних имели статус международных. Весной 2000 года было создано Российское Хитиновое Общество, объединившее более 50 региональных отделений.
Промышленное производство хитина и хитозана преимущественно из панциря крабов и креветок наиболее широкое развитие получило в Японии. Отечественная промышленность практически делает первые шаги в этой области, и общее производство хитозана, включая регионы Дальнего востока и центральную часть России, не превышает 10 т/год.
Известно около 70 направлений использования хитина и хитозана. Практические исследования хитина и хитозана в косметической, фармацевтической промышленностях, сельском хозяйстве, медицине, ветеринарии и биотехнологии показывают, что эти вещества обладают сорбцион-ными, антиоксидантными, антисептическими и иммуномодулирующими свойствами. Все в большей степени расширяются медицинские аспекты применения хитозана. Например, на здравоохранение в денежном выражении расходуется 65% от общего сбыта хитозана на мировом рынке [14].
Обладая хорошей биодеградируемостью и низкой токсичностью [37, 41, 45, 119], хитин и хитозан являются весьма ценными перспективными веществами в решении ряда задач ведения животноводства в условиях техногенно - загрязнённой среды обитания сельскохозяйственных животных [114].
Теоретическое обоснование стадий технологии получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчёл
Анализ имеющихся исследований в области хитозана выявил, что в природных веществах, содержащих хитин и меланин одновременно, эти вещества тесно связаны между собой. Поэтому при получении хитозана из таких природных веществ, а ими могут быть, напримерстенки грибов, речь обычно идёт о получении хитозан-меланинового комплекса (ХМК).
Для получения чистого хитозана, если в этом есть необходимость, ХМК можно подвергнуть окислению с помощью перекиси водорода Н2С 2, или электролизу [24, 52]. Поэтому в данной работе речь идёт о получении хитозан-меланинового комплекса.
На основании выше изложенных и проанализированных технологий получения хитозана из различных видов природного сырья можно заключить, что для более полного выхода конечного продукта при получении ХМК из подмора пчёл и максимально возможного сохранения меланинов первой стадией обработки исходного сырья должна быть сушка пчелиного подмора. Изначально было учтено, что подмор имеет собственную первоначальную влажность, величина которой не ниже равновесной, и которая препятствует подготовительной обработке сырья, а именно его перетиранию до порошкообразного состояния, необходимого для проведения технологического процесса. Поэтому сушку следует проводить до достижения сырьём равновесной влажности, которая смогла бы обеспечить возможность лёгкого крошения исходного материала. Эта подготовительная стадия может быть качественно выполнена одним из двух способов: при кон-дуктивной сушке в течение 2-4 часов или при конвективной сушке горячим воздухом в течение 15-20 минут. Способ высушивания выбирается исходя из количества сырья и общих рациональных возможностей технологической линии.
Для решения поставленной задачи следующей стадией подготовки пчелиного подмора к проведению химических реакций следует провести максимальное измельчение высушенного сырья. Такая необходимость вызвана тем, что наиболее эффективное и полное взаимодействие реагентов в гетерогенной реакции (в данном случае — исходного сырья с раствором щёлочи) может быть достигнуто в том случае, если реагент твёрдой фазы имеет развитую активную поверхность контакта с жидкой фазой. Увеличе высушенного пчелиного подмора может быть достигнуто его измельчением до порошкообразного состояния с величиной частиц не более 0,2-0,3 мм.
Учитывая, что плотность исходной массы очень мала, из-за чего она не измельчается под воздействием ударных усилий ножей лабораторных мельниц, рационально получить требуемую степень измельчения путём перетирания. Таким образом, второй стадией обработки исходного сырья является измельчение путём перетирания. В лабораторных условиях это возможно сделать в ступке, в промышленных или полупромышленных масштабах - с помощью вальцевых или барабанных мельниц. Измельчённая таким способом порошкообразная масса не содержит различимых частей пчёл, имеет большую активную поверхность контакта с реагентами и не требует применения ультразвука, как это было необходимо в известных технологиях.
Таким образом, технология подготовки пчелиного подмора к воздействию на него химическими реагентами значительно упрощается, а качество проведения последующих стадий обработки улучшается, что способствует более высокому выходу из исходного сырья как ХМК, так и меланина.
Следует отметить, что за основу технологической схемы получения ХМК изначально были взяты известные методики: «Способ получения хитина и способ получения хитозана из синантропных мух, культивируемых на твёрдых органических отходах, а также из форм их постадийного развития» [73], а также «Технология получения хитина / хитозана из сушеного рачка гаммаруса с применением автоферментолиза» [103]. Описанные ранее способы были существенно изменены и дополнены в соответствии с требованиями, предъявленными нами к исходному пчелиному подмору и к получаемым веществам.
Одним из важных моментов для оптимизации этапов получения конечного продукта является определение параметров исходного сырья.
Подготовка и исследование рабочей массы из исходного сырья - пчелиного подмора
Подготовка пчелиного подмора к эффективному извлечению из него биологически-активных веществ предусматривает определение параметров исходного сырья, то есть количественного содержания в нём белка, липи-дов, хитина, меланинов, минеральных веществ и влажности, определяющей его влажность. Опыты по определению состава после предварительного высушивания проводились в трёх параллельных определениях на трёх видах пчелиного подмора, полученных в разное время с различных пасек Ставропольского края. Сравнивались образцы подмора (рис. 9), взятые после весенней ревизии ульев 2006 г (I), 2007 г. (II) и летней профилактической чистки 2007 г. (III) (табл. 2).
В результате проведенных исследований установлено, что количество белка и минеральных веществ в исследованных образцах подмора не зависело от места происхождения, времени и года сбора. Стабильность состава пчелиного подмора позволила разработать общую технологию получения из него биологически активных веществ. Отсутствие липидов в исходном сырье дало возможность не проводить процесс обезжиривания, обычно присутствующий при переработке содержащего хитин сырья [18, 82, 111].
Для подготовки исходного пчелиного подмора к эффективному измельчению необходимо определить влажность, при которой данный материал легко крошится и его возможно легко измельчить до порошкообразного состояния. Для чего исходная масса пчелиного подмора распределялась на противне и помещалась в сушильный шкаф с температурой 80 С и с периодичностью в 30 мин определялась степень крошимости органолеп-тическим методом. Подобная подготовка подмора обеспечит увеличение активной поверхности, контактирующей с реагентами и, соответственно, более интенсивное и глубокое протекание реакций. Установлено, что способность пчелиного подмора крошиться до порошкообразного состояния обеспечивается при влажности 4—6%.
Измельчение пчелиного подмора проводилось в лабораторных условиях. Подсушивание подмора до влажности крошимости позволило осуществлять его измельчение до порошкообразного состояния в фарфоровой ступке. При больших объемах рационально использование барабанной или конусной мельницы.
Похожие диссертации на Разработка технологии получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел и его применение для молодняка сельскохозяйственных животных
