Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Бета-каротин и каротиноиды: распространение в природе и физико-химические свойства 11
1.2. Биологическая роль в организме и пути метаболизма
бета-каротина 21
1.3. Применение препаратов бета-каротина в ветеринарии и животноводстве 40
1.4. Способы производства бета-каротина 57
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 69
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Получение каротинсодержащей мицелиальнои массы культуры Blakeslea trispora 77
3.2. Качественный состав мицелиальнои массы 83
3.3. Получение субстанции бета-каротина 86
3.3.1. Состояние бета-каротина в клетке мицелиальнои массы и способы подготовки ее к экстракции 87
3.3.2. Экстракция бета-каротина из мицелиальнои массы 94
3.3.3. Кристаллизация бета-каротина из масляного экстракта и очистка выделенных кристаллов 107
3.3.4. Разработка технологии рафинации масляного экстракта бета-каротина 114
3.3.5. Разработка технологической схемы и оборудования для промышленного производства субстанции бета-каротина 128
3.3.6. Стандартизация субстанции бета-каротина 139
3.4. Разработка технологии производства препарата каролин 149
3.4.1. Изучение физико-химических свойств бета-каротина 149
3.4.2. Стандартизация лекарственного препарата каролин 166
3.4.3. Физико-химические свойства и контроль качества ветеринарного препарата каролин 173
3.5. Оценка токсикологических свойств каролина
3.5.1. Острая токсичность каролина 175
3.5.2. Субхроническая токсичность каролина 176
3.5.3. Исследование аллергенных и иммунотоксичных свойств бета-каротина 192
3.5.4. Влияние каролина на функцию почек, пищеварительного тракта и кровь 200
3.5.5. Влияние каролина на функцию печени 202
3.5.6. Местнораздражающее действие каролина 202
3.5.7. Ветеринарно-санитарная оценка мяса после применения каролина 204
3.6. Разработка показаний к применению и эффективность каролина в медицине 205
3.7. Разработка показаний к применению и эффективность каролина в ветеринарии 231
3.8. Разработка показаний к применению и эффективность каролина в животноводстве и птицеводстве 240
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 257
5. ВЫВОДЫ 273
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 278
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 280
8. ПРИЛОЖЕНИЯ 319
- Бета-каротин и каротиноиды: распространение в природе и физико-химические свойства
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
- Получение каротинсодержащей мицелиальнои массы культуры Blakeslea trispora
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из задач, стоящих перед фармакологической наукой и практикой, является поиск средств, повышающих сопротивляемость организма человека и животных вредным воздействиям окружающей среды. На организм человека и животных действуют новые антропогенно-экологические факторы, которые приводят к ослаблению сопротивляемости организма, нарушению обмена веществ, возникновению различных заболеваний, в том числе онкологических. В связи с этим в мире растет спрос на натуральные природные средства профилактики и лечения заболеваний человека и животных.
Важной задачей науки является создание технологий производства и применения биологически активных веществ. Одним из таких веществ является природный бета-каротин. Дефицит бета-каротина в организме человека и животных до сего времени, в основном, восполняется за счет использования овощей, фруктов, зеленых частей растений, в которых он содержится.
Интерес к всестороннему изучению бета-каротина возник после того, как было обнаружено, что кроме провитаминной активности он участвует в ряде сложных биохимических процессов в организме (Bendich Л., 1988). Он обладает антиоксидантными, антиканцерогенными, антимутагенными и иммуностимулирующими свойствами (Плесцитый К.Д., 1978, 1981; Сергеев А.Г., 1986; Букин Ю.В., 1986, 1995; Peto R., ct al., 1981, Krinski N.I., 1989, 1994, 1998; Mayer H., Bollag W., Hanni R. et al., 1978, Bendich A., Olson J.A., 1988, Zhang Z.W. et al., 2000). Поэтому препараты бета-каротина находят широкое применение в медицине, ветеринарии и животноводстве при профилактике и лечении болезней, связанных с нарушением обмена веществ (Сергеев А.Г., 1983, Зернов В.Г., 1979; Славянская Т.А., Сепиашвили Р.И., 1999; Букин Ю.В., 1992, Дорогокупля А.Г., Троицкой Е.Г., Адильгиреева Л.Х. и др., 1979; Буюклинская О.В., 1992; Mathews-Roth М.М., 1982; Riegger СВ.,
1990; Alexander M., Newmark H., Miller R.G., 1985; Duthie G.G., 1990; Singkh Vishwan, 1994; Hennekens Charles H., 1997, 1999).
В условиях растущей потребности в препаратах бета-каротина важным является вопрос изыскания его источников. Недостатком получения бета-каротина из растительного сырья является его дефицит, низкое содержание бета-каротина в нем, зависимость его накопления от природно-климатических условий, сложность регулирования этого процесса. Очевидными преимуществами обладает метод получения бета-каротина микробиологическим синтезом из культуры гриба Blakeslea trispora.
Исследования по получению бета-каротина из этой культуры были проведены Казаряном Р.В. (1978, 1990) и направлены на улучшение качества получаемого масляного экстракта и совершенствование метода извлечения бета-каротина из мицелиальной массы с целью получения кристаллического бета-каротина. Настоящая работа выполнена в развитие этих исследований и посвящена разработке технологии производства фармакопейной субстанции бета-каротина из мицелиальной массы культуры Blakeslea trispora и использование ее при разработке лекарственного и ветеринарного препратов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка технологии производства субстанции природного бета-каротина из мицелиальной массы культуры гриба Blakeslea trispora. Разработка на ее основе лекарственного и ветеринарного препаратов, исследование их фармако-токсикологических свойств и лечебно-профилактической эффективности в медицине, ветеринарии и животноводстве.
Для достижения поставленной цели решали следующие задачи: - разработать способы, позволяющие получить каротинсодержащую мицелиальную массу с высоким содержанием бета-каротина; - изучить состояние бета-каротина в клетке мицелиальной массы в процессе ферментации, изучить качество мицелиальной массы и выделенно го из нее липидно-каротинового комплекса; изучить условия получения высококонцентрированных растворов бета-каротина в растительном масле, состав и распределение компонентов липидной системы при кристаллизации бета-каротина, и разработать способы очистки кристаллов и масляного экстракта; разработать технологию получения субстанции кристаллического бета-каротина и стандартизировать показатели качества; разработать технологию производства препарата каролин лекарственного и ветеринарного назначения и методы контроля их качественных показателей; -дать характеристику основных фармако-токсикологических свойств препаратов; - разработать основные показания к применению препарата каролин в медицине, ветеринарии и животноводстве.
Научная новизна работы. Получен новый штамм гриба Blakeslea tris-рога КР 76+ КР 86' и разработан состав питательной среды, в которой в качестве источников белков, жиров, углеводов, антиоксиданта и стимулятора ка-ротиногенеза используются отходы масложировой и крахмалопаточной промышленности, а также отходы, полученные при производстве кристалличе-с ко го бета-каротина.
Изучено состояние бета-каротина в клетке Blakeslea trispora в процессе ферментации и разработан способ извлечения из мицелиальной массы бета-каротина, растворенного в клеточных липидах.
Ыа основе результатов исследований состава липидов промышленных образцов мицелиальной массы и свойств кристаллического бета-каротина, разработан способ извлечения его противоточной многоступенчатой экстракций, в системе твердое тело-жидкость, растительным маслом. Определены основные параметры экстракции.
Изучен процесс кристаллизации бета-каротина из масляных экстрактов и состав образующихся осадков. На основе этих данных, разработаны спосо- бы очистки кристаллов бета-каротина и масляных экстрактов от сопутствующих веществ.
Стандартизированы показатели качества субстанции кристаллического бета-каротина, разработаны методы контроля.
Выявлено влияние размеров и формы кристаллов на скорость растворения бета-каротина в растительном масле. Изучена кинетика окисления бета-каротина в растительном масле, в растворе органического растворителя и в кристаллическом виде.
Дана характеристика физико-химических свойств препарата каролин лекарственного и ветеринарного качества и определены методы контроля.
В опытах, проведенных на животных, изучены изменения клинических, гематологических, биохимических, патоморфологических показателей, дана оценка острой и субхронической токсичности, аллергенных и иммуноток-сичных свойств, местно-раздражающего действия, объективно отражающих безвредность каролина.
Выявлена профилактическая и терапевтическая эффективность лекарственного препарата каролин, при заболеваниях, связанных с усилением сво-боднорадикальных реакций.
По результатам выполненной работы получено 3 авторских свидетельства и 14 патентов Российской Федерации.
Практическая значимость. На основе проведенных исследований, разработана технология промышленного производства субстанции кристаллического бета-каротина и рафинированных масляных экстрактов его, а также технология получения каролина лекарственного и ветеринарного качества.
Как лечебно-профилактическое средство, каролин медицинского качества, рекомендуется применять, при состояниях, характеризующихся усилением свободнорадикальных реакций (воздействие малых доз радиации, рентгенологическое обследование, лучевая и химиотерапия, при опухолевых заболеваниях, лазерная терапия, контакт с ядохимикатами, иммунодефицитные состоянии). В качестве лечебного средства каролин применяют в комплексной терапии, связанной с нарушением регенерации эпителия (язвенной болезни желудка, и 12-перстной кишки, эрозивного гастрита, дуоденита, гепатита, холецистита, неспецифического язвенного колита, дисбактериоза, при острых респираторных заболеваниях). При хронических бронхолегочных и гинекологических заболеваниях, заболеваниях кожи (раны, ожоги, отморо-жения, трофические язвы, кератозы, псориаз, экзема и другие дерматозы). (Инструкция по применению препарата каролин, регистрационный номер 95/292/6, утвержденная Фармакологическим государственным комитетом Минздрава РФ).
В качестве лечебно-профилактического средства, каролин ветеринарного качества рекомендуется применять для нормализации обмена веществ, при профилактике задержания последа, послеродовых эндометритов и нарушений воспроизводительной функции у коров и свиноматок, повышения молочности свиноматок и сохранности поросят, повышения выводимости и сохранности цыплят, улучшения качества яиц. (Наставление по применению препарата каролин в ветеринарии, регистрационный номер ПВР-2-4.0/00541, і утвержденное Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации).
Результаты исследований могут быть использованы, при составлении руководств и справочников по фармакологии, терапии и профилактике заболеваний человека и животных.
Внедрение результатов исследований. Результаты исследований нашли отражение в документах, утвержденных (согласованных) Департаментом Государственного контроля качества, эффективности и безопасности лекарственных средств и медицинской техники и Фармакопейным государственным комитетом: Бета-каротин - Фармакопейная статья ФС 42-3687-99 от 03.02.2000; Каролин - Фармакопейная статья 42-3868-99 от 03.02.2000 г.; Инструкция по применению препарата 'каролин, регистрационный номер
95/292/6 от 12.09.1995 г.; промышленный регламент на производство субстанции бета-каротина; промышленный регламент на производство препарата каролин, рекомендованные к утверждению технологической комиссией НПО «Витамины» (г. Москва).
Результаты исследований нашли отражение в документах, утвержденных (согласованных) Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации: Каролин - Технические условия ТУ 9141-003-41341380-01; Наставление по применению препарата каролин в ветеринарии, регистрационный номер ПВР-2-4.0/00541.
Препарат каролин медицинского качества выпускается ЗАО «Роскар- фарм» по лицензии Минздрава РФ с 1996 года и реализуется через аптечную і сеть.
Препарат каролин ветеринарного качества выпускается ЗАО «Роскар-фарм» с 1997 года и реализуется в ряде регионов РФ.
Апробация работы. Основные научные результаты работы были доложены на Всесоюзной конференции «Фосфолипиды растительных и микробных липидов - современный уровень технологии и исследований», г. Краснодар, 1979 г.; на конференции «Использование биомассы микроорганизмов для пищевых целей», г. Пушино, 1984 г.; на международной научно-технической конференции «Улучшение качества и расширение ассортимента при маслодобывании и маслопереработке», г. Пловдив, НРБ, 1985 г.; на международной научно-технической конференции «Новые тенденции в развитии мало-жировой промышленности», НРБ,'1987 г.; на Всесоюзном совещании «Реализация научно-технической программы «Витаминизация пищи», г. Углич, 1990 г.; на У1 Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», г. Москва, 1999 г.; на научно-практической конференции посвященной 55-летию ГУ Краснодарской НИВС, г. Краснодар, 2001 г.; на 5 Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», г. Санкт-Петербург 2001 г.; на междуна- родной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях», г. Воронеж, 2002 г.; на Всероссийской научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии, г. Казань, 2002 г.
На защиту выносятся следующие положения: исследования по разработке технологии получения фармакопейной субстанции кристаллического бета-каротина из мицелиальиой массы гриба Blakeslea trispora; физико-химические характеристики и контроль субстанции бета-каротина; исследование физико-химических свойств субстанции бета-каротина и разработка на ее основе технологии производства препарата каролин лекарственного и ветеринарного назначения; физико-химические свойства и контроль препарата каролин медицинского и ветеринарного качества; * - исследования острой и субхронической токсичности каролина, аллер- генных и иммунотоксичных свойств; исследования по применению препарата каролин в качестве лечебно-профилактического средства в медицине, ветеринарии и животноводстве; результаты внедрения препарата каролин в промышленное, фармацевтическое и сельскохозяйственное производство.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 45 научных работ в . том числе: 1 монография, 14 патентов и 3 авторских свидетельства.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Бета-каротин и каротиноиды: распространение в природе и физико-химические свойства
Бета-каротин - биологически активное вещество природного происхождения, относящееся к каротиноидам, представляющим собой многочисленную группу желто-оранжевых пигментов, синтезируемых высшими растениями, водорослями, грибами и бактериями.
У высших растений и водорослей бета-каротин локализован в хромопластах. У грибов каротиноиды встречаются только у некоторых видов, например, Blakeslea trispora синтезирует бета-каротин в мицелии. У бактерий каротиноиды локализованы в клеточных мембранах.
Человек и животные не способны синтезировать каротиноиды и получают их с растительной пищей, в которых на долю бета-каротина приходится до 30% (Карнаухов В.Н., 1988).
С начала XIX века каротиноиды привлекают внимание ученых. В 1831 г. Вакенродер сообщил о выделении из моркови ярко-красного пигмента, названного им каротином, а позднее в 1837 г. Берцелиус из осенних листьев извлек желтые пигменты, получивших название «ксантофиллы» (кислородные производные каротина).
В настоящее время идентифицировано около 600 каротиноидов. Среди них лишь около 10% обладают активностью витамина A (Olson J.A., 1994). Предшественниками витамина А могут быть каротиноиды, имеющие в молекуле хотя бы одно бета-иононовое кольцо. Большинство распространенных каротиноидов лишены бета-иононового кольца: ликопин, лютеин, кантаксан-тин, неоксантин и др., и не способны превращаться в витамин A (Johnson E.J., Qin J., Krinsky N.I.,. Russell R.M, 1993; Parker R.S., 1997; Desobry S.A., Netto F.M., Labuza T.P., 1998). Каротиноиды, способные к превращению в организме в витамин А, называются провитаминами - предшественниками витамина А. Среди производных каротиноидов, встречающихся в природе, провита минными свойствами обладают каротин, криптоксантин, мутатохром, мик-соксантин, афонии и др. (Душейко Л.Л.,1989; Palan P.R., Mikhail M.S., Goldberg G.L et al., 1996; Margalith P.Z., 1999; Huang C, Tang Y.L., Chen C.Y. et al., 2000).
Еще в 1930-1931 г.г. Kapep обнаружил симметричность молекулы бета-каротина и показал, что она состоит из двух молекул витамина А, поэтому среди других каротиноидов бета-каротин обладает наибольшей биологической активностью (Olson J.А., 1989; Eugster С.Н., 1992). Эта «провитаминная концепция», благодаря своему фундаментальному научному и высокому прикладному значению, оказала существенное влияние на направление изучения функций каротиноидов (Isler О., 1971). И только в начале 80-х годов, благодаря многочисленным исследованиям биохимии каротиноидов, расширяющим понимание роли и важности их для организма животных и человека, было показано, что бета-каротин является не только предшественником витамина А, но и самостоятельным активным участником биохимических про-цессов, протекающих в организме живых существ (Bendich А., 1988).
По химической структуре каротиноиды относятся к ненасыщенным соединениям терпенового ряда, преимущественно с 40 углеродными атомами в молекуле, построенными по единому структурному принципу. По концам полиеновой цепи, состоящей из 4 изопреноидных остатков, расположены циклогексановые кольца или соответствующие им алифатические остатки.
Материалы и методы исследований
Работа выполнялась с 1978 по 2001 год в условиях Кубанского государственного технологического университета, цеха микробиологического каротина Верхнеднепровского крахмалопаточного комбината, Краснодарского научно-исследовательского ветеринарного института, ЗАО «Роскарфарм», в хозяйствах Краснодарского края и Витебской области.
Проведение лабораторных экспериментов осуществляли по схеме, приведенной на рис 1.
Мицелиальную массу, высушенную до остаточной влажности 7 %, подвергали исчерпывающей экстракции гексаном по разработанной нами методике (разд. 3.2.), изучали состав выделенного липидно-каротинового комплекса и его качественные характеристики.
Вторым этапом мицелиальную массу подвергали экстракции растительным маслом. Полученный масляный экстракт подвергали либо кристаллизации, либо рафинации в системе жидкость-жидкость этиловым спиртом. Кристаллы бета-каротина отделяли от раствора и изучали их качественный и количественный состав. Оставшийся масляный раствор также исследовали по составу. В рафинированном масляном экстракте изучали состав экстрактов и состав рафинатов, а затем рафинаты подвергали кристаллизации и изучали состав осадков и состав растворов, оставшихся после отделения кристаллов. Проведенные исследования позволили разработать технологию производства субстанции кристаллического бета-каротина. Полученную субстанцию бета-каротина использовали для изучения кинетики растворения и кинетики окисления в растительном масле. На основе этих исследований, разработали технологию производства каролина. Изучали токсикологические и лечебно-профилактические свойства каролина в медицине, в ветеринарии и животноводстве.
Общетоксические характеристики лекарственного каролина изучали путем определения параметров острой и субхронической токсичности на базе Центра по химии лекарственных средств Всероссийского научно-исследовательского химико-фармацевтического института (ЦХЛС ВНИИХ-ФИ, г. Москва), в соответствии с требованиями Фармакопейного комитета.
Аллергенную активность и иммунотоксические свойства лекарственного средства каролин изучали на базе научно-исследовательского технологического института антибиотиков и ферментов (НИТИАФ, г. Санкт-Петербург) в соответствии с требованиями Фармакологического комитета.
Эффективность применения каролина в медицине изучали на базе Республиканского липидного лечебно-диагностического и консультативного центра под руководством д.м.н., профессора Чиркина А.А. (Республика Беларусь, г. Витебск).
Исследования по накоплению растворенного и кристаллического бета-каротина в процессе ферментации проводили в цехе микробиологического каротина Верхнеднепровского крахмалопаточного комбината.
Получение каротинсодержащей мицелиальнои массы культуры Blakeslea trispora
Наиболее активным продуцентом бета-каротина является гетеротал-личный гриб Blakeslca trispora, относящийся к порядку Mucoralcs. Получение мицелиальной массы, содержащей бета-каротин, осуществляется путем глубинного совместного культивирования пары (+) и (-) штаммов-продуцентов на питательной среде различного состава.
Схема производства мицелиальной массы, представлена на рисунке 2.
Процесс выращивания посевного материала в пробирке, колбе, иноку-ляторе, посевном аппарате и ферментере включают в себя стандартные стадии: приготовление питательной среды, ее стерилизация, засев культуры и выращивание посевного материала. Продолжительность процесса ферментации составляет 96-120 часов, температура процесса- 26-28С. По окончании процесса проводят инактивацию ферментов путем тепловой обработки острым и глухим паром в течение 15 минут. Затем культуральную жидкость подвергают фильтрации. Влажную мицелиальную массу с фильтрпресса направляют на стадию сушки, которую осуществляют в вакуумной сушилке. Процесс сушки продолжается 5-8 часов при температуре в массе 45-60С. Высушенную мицелиальную массу охлаждают до 25-30С. Остаточная влажность не должна превышать 7 %. Готовую мицелиальную массу направляют на стадию производства субстанции бета-каротина.
Основными факторами, влияющими на процесс каротинообразования, является состав питательной среды и качество используемых штаммов. Исследования были направлены на получение новой высокопродуктивной пары штаммов культуры гриба Blakeslca tnspora, а также разработку оптимального состава питательной среды.
При производстве мицелиальной массы культуры Blakeslca trispora используются несколько промышленных штаммов: ±8А; ±К1 и другие.
Для производства мицелиальной массы необходимого качества нами получена новая высокоэффективная пара штаммов КР 74+ и КР 86" гриба Blakeslca trispora путем совместного культивирования штаммов К1+ и КГ.
При этом использовали способ индуцированного последовательного мутоге-неза на реплицирующейся ДНК. Для штамма КР 74+ использовали нитрозо-гуанидин в концентрациях 500 мкг/мл (при выживаемости спор 0,02-0,1%). Для штамма КР 86 использовали комбинированное действие УФ-облучения (при выживаемости спор 5-7%) и нитрозогуанидин в указанной концентрации. В условиях производства указанная пара штаммов обеспечивает удельную продуктивность 40-45 г бета-каротина на 1 кг высушенной мицелиаль-ной массы и обладает способностью утилизировать в качестве субстрата отходы масложировой промышленности и отходы и вторичные продукты производства кристаллического бета-каротина (патент РФ № 2177505 от 27.12.2001).
Морфологические свойства штамма: гифы нитевидные, мощные, часто с перетяжками, образуют клубки. КР 74+ имеет хорошо развитый, воздушный мицелий от серовато-желтого до желтого цвета. Субстратный мицелий — от светло-оранжевого до желто-оранжевого цвета. Отмечается интенсивное спорообразование. Бесполое спроношение, только спорангиалыюе, представленное стилоспорангиями и спорангиями. Стилоспорангии 50-100 мкм в диаметре. Спорангии - эллиптически шаровидные 12x16 - 10x14 мкм, трех-споровые, многочисленные спорангоспоры также эллиптические 14x8, табачного цвета, имеют продольную исчерчешюсть. КР 86 также имеет хорошо развитый воздушный мицелий, оранжево-желтого или ярко-оранжевого цвета, субстратный мицелий - ярко-оранжево-красный и цвет диффундирует в среду.
Похожие диссертации на Разработка технологии получения и фармако-токсикологические исследования бета-каротина
