Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Характеристика зерна и его использование 8
1.1.1 Структура и состав зерна 8
1.1.2. Белоксодержащее сырьё растительного происхождения 10
1.1.3. Обзор современных технологий обработки зерна для микробиологической промышленности
1.2. Гидролиз растительного белка 26
1.3. Основные выводы и постановка задачи исследования 32
Глава 2. Материалы и методы 35
2.1. Характеристика объектов исследования 35
2.2. Ферментные препараты 35
2.3. Микроорганизмы-продуценты 36
2.4. Среды для процессов ферментации 37
2.5. Оборудование 44
2.6. Методы проведения экспериментов 45
2.7. Контрольно-аналитические методы 47
Глава 3. Предварительная обработка и разделение зернового сырья на фракции 52
3.1. Описание способов обработки и разделения зернового сырья на фракции...52
3.2. Сравнительный анализ способов 53
3.3. Выводы по главе 3 56
Глава 4. Оптимизация режимных параметров периодического одноступенчатого процесса ферментолиза 57
4.1. Многофакторные эксперименты
4.2. Проверка в однофакторных зависимостях 59
4.3. Выбор ферментного препарата 64
4.4. Выводы по главе 4 66
Глава 5. Кинетика процессов ферментолиза глютена 67
5.1. Влияние концентрации глютена 61
5.2. Влияние продуктов ферментолиза 71
5.3. Влияние крахмала 81
5.4. Двухступенчатый процесс ферментолиза 84
5.5. Математическая модель кинетики ферментолиза глютена 88
5.6. Предложения по совершенствованию технологии ферментолиза 92
5.7. Выводы по главе 5 92
Глава 6. Испытание ферментолизата глютена и сырого глютена как ростовых факторов в процессах ферментации 94
6.1. Изучение возможности замены традиционных источников азота на ферментолизаты глютена и сырой глютен 94
6.2. Перспективы практического использования процесса ферментолиза глютена в биотехнологических производствах 117
6.3. Выводы по главе 6 119
Основные результаты и выводы 120
Библиографический список
- Обзор современных технологий обработки зерна для микробиологической промышленности
- Микроорганизмы-продуценты
- Сравнительный анализ способов
- Проверка в однофакторных зависимостях
Введение к работе
Актуальность работы. Для проведения процессов биосинтеза различных продуктов необходимы 2 основных компонента сред: источник углерода (углеводы) в качестве энергетического субстрата и источник органического азота в качестве фактора роста. В качестве источника углерода в ферментационных средах довольно часто используют ферментолизаты крахмала, получаемые непосредственно на стадии производства биопродуктов из зерна пшеницы мягких сортов.
В качестве источника органического азота при этом обычно используют специально приобретаемые источники сырья, такие как кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, гидролизаты казеина, соевую муку и др.
В то же время содержащийся в зерне пшеницы белок (глютен) в лучшем случае выделяется и реализуется как кормовой продукт, а чаще является малоценным отходом.
Учитывая, что в таких случаях система переработки зерна существует непосредственно на биотехнологическом производстве, целесообразно включить в технологию переработки зерна дополнительные стадии выделения и ферментолиза глютена, а получаемые ферментолизаты использовать в качестве ростового субстрата.
Это позволит использовать зерно как основной сырьевой ресурс биотехнологических производств. Учитывая доступность и относительно низкую стоимость зерна пшеницы, разработка технологии его дополнительной переработки является актуальной задачей для совершенствования биотехнологических производств.
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлась разработка технологии ферментативного гидролиза глютена для использования в качестве ростового фактора в процессах ферментации. Основные задачи:
- модификация технологии переработки фуражного зерна пшеницы с целью
получения фракции с повышенным содержанием глютена;
- выбор протеазы для ферментолиза глютена;
изучение влияния технологических параметров (концентрации глютена, рН, концентрации фермента) на эффективность ферментолиза и выбор рациональных условий реализации периодического процесса ферментолиза;
изучение влияния концентрации глютена и продуктов ферментолиза на кинетику процесса ферментолиза и степень утилизации белка;
разработка математического описания кинетики процесса ферментолиза глютена;
анализ вариантов реализации технологии ферментолиза глютена и выбор рациональной технологии;
-оценка возможности использования ферментолизатов глютена в качестве источника ростовых факторов в процессах биосинтеза для различных продуцентов. Научная новизна:
показано, что повторная обработка на РПА и дополнительная выдержка суспензии измельченного зерна при рН 4-5 позволяет повысить концентрацию белка в глютеновой фракции на 19-25%;
с использованием планирования эксперимента по схеме ортогональных латинских прямоугольников найдено оптимальное соотношение режимных параметров одноступенчатого периодического процесса ферментолиза;
найдены зависимости скорости ферментолиза глютеновой фракции от концентрации глютена и свободных аминокислот, образующихся в процессе ферментолиза;
- обнаружено ингибирование процесса продуктами ферментолиза;
на основании анализа экспериментальных данных предложена и идентифицирована кинетическая модель процесса ферментолиза, учитывающая влияние концентрации белка по уравнению Миаэлиса-Ментен и концентрации продуктов реакции по уравнению Бергтера;
- показано, что для увеличения глубины ферментолиза целесообразно либо
использовать разбавленную до 40 г/л белка фракцию глютена, либо проводить
дополнительные ступени ферментолиза после отделения осадка от растворимых
продуктов ферментолиза;
- подтверждена возможность использования ферментолизата глютена в
качестве азотсодержащих компонентов ферментационных сред для процессов
биосинтеза лизина, лейцина, валина, астаксантина, нового гликопептидного
антибиотика и пробиотика.
Практическая ценность работы:
- использование ферментолизата глютена, полученного по предложенной
технологии, позволяет использовать зерно в качестве основного сырьевого ресурса в
процессах биосинтеза на продуцентах, не имеющих протеолитической активности;
- использование технологии по месту производства биотехнологического продукта не
требует сушки ферментолизата или других способов его консервирования, что позволяет
снизить затраты на азотсодержащий источник питания;
- разработан лабораторный технологический регламент для предложенной
технологии;
- результаты технологии использованы ООО ПКФ «Бигор» при проектировании
опытно-промышленной установки для производства лизина в Чувашии.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на: VII и VIII Всероссийских выставках научно-технического творчества молодежи НТТМ-2007 и 2008 (работа отмечена золотой медалью); Научных конференциях студентов и молодых ученых МГУИЭ в 2007 и 2008 годах; Международной научной конференции, посвященной 70-летию факультета прикладной химии и экологии РХТУ- 2008 «Современные тенденции развития химии и технологии полимерных материалов»; XXI Международной конференции «Математические методы в технике и технологиях ММТТ- 21»; Международной химической ассамблее «ICA-2008»; 2-й Биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех-2008» (работа отмечена медалью).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 статьи.
Структура и объем работы. Диссертационная работа включает: введение, обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты экспериментов и их обсуждение, выводы, список литературы и приложения.
Обзор современных технологий обработки зерна для микробиологической промышленности
Использование ферментолизованного глютена и белоксодержащих отходов зерна. Имеются сведения о применении глютена, обработанного ферментами протеолитического и ксиланазного действия [Schlichtherle-Cerny Н, 2002], [Kong, 2007], [А.В. Васильев с соавт., 2008], [Римарева Л.В., 2008] Это косметология (использование глутаминовой кислоты глютена для питания волос и ногтей, а также в косметических изделиях, таких как тушь для ресниц); гидролизованная клейковина, подвергнутая экструзии (прессованию), может использоваться при разработке новых продуктов питания - аналогов мяса, крабов и даже искусственной икры; по информации компании VITEN CWS ферментолизат глютена используется также в производстве заменителей молока для детёнышей животных. В отличие от сырого глютена гидролизат имеет отличную усваиваемость, отсутствие антипитательных факторов. Румянцевой Г.Н. и Евсичевой М.Н. [Румянцева Г.Н., 2005] проведены исследования по протеолизу пшеничных отрубей, позволяющему обеспечить максимальный выход белка при сохранении его природных свойств.
Кроме удовлетворения пищевых потребностей за счет белков растительного происхождения разработаны технологии синтеза необходимых продуктов из этих белков с помощью биотехнологии.
Для биотехнологических целей возможно использовать практически любое белковое сырьё. Выбор сырья обусловлен географическими условиями или особенностями технологического процесса, в котором белковое сырье является побочным продуктом. Однако традиционно в качестве источника органического азота в большинстве случаев применяют кукурузный экстракт. Это хороший, достаточно дешевый стимулятор роста. Стимулирующее влияние объясняется наличием в нем белковых веществ -40-50%, аминокислот 10-17-35% по сухим веществам, витаминов, особенно группы В и минеральных веществ, содержащих Са, Р, К, Mg, Fe [Межиня Г.Р., 1978], [Грачёва И.М., 1980], [Мосичев М.С. с соавт., 1982]. Однако различные партии кукурузного экстракта значительно отличаются по содержанию отдельных компонентов. Отдельные партии могут оказаться непригодными для конкретного продуцента [Межиня Г.Р., 1978]. Так как кукурузный экстракт, несмотря на дешевизну, сравнительно дефицитное сырье, актуальным является поиск его заменителей [Межиня Г.Р., 1978]. В качестве источников углерода для питания микроорганизмов традиционно используют ферментолизат крахмала пшеницы. Относительно низкая эффективность использования зернового сырья в традиционной технологии приготовления питательных сред для биосинтеза ценных продуктов предопределена особенностями «однопродуктовых» схем за счет неполного использования получаемых фракций (обычно используется крахмал или его ферментолизаты).
Это позволяет предполагать, что при отработанной технологии фракционирования составляющих зерна пшеничный белок может быть хорошим источником органического азота и ростовых факторов.
Для микробиологических целей используют мягкие, фуражные сорта пшеницы, соответствующие ГОСТ 9353-90 [Жислин ЯМ., 1969], [Жислин A.K., 1990]. Подобно другим организмам, все бактерии для своего роста нуждаются в экзогенных источниках энергии и доступных веществах, поставляющих углерод, азот, серу и неорганические ионы в такой форме, в которой они могут быть использованы для синтеза клеточных компонентов [ГерхардтФ., 1983].
Среди всех элементов, используемых микроорганизмами в качестве питательных веществ, наиболее важное значение имеет углерод, содержание которого в пересчете на сухую массу микроорганизмов составляет примерно 50%. Для развития микроорганизмов, а следовательно, и синтеза белковых веществ и построения протоплазмы живой клетки также необходимы различные источники азота [Бекер М.Е., 1978], [Егоров Н.С.,1976].
Для выращивания микроорганизмов могут использоваться различные виды сырья: отходы сельскохозяйственной и пищевой промышленности, сульфитные щелоки, жидкие и газообразные углеводороды, и т.д. [Грачёва И.М. с соавт., 1980], [Аиба Ш. с соавт., 1975], [Федосеев К.Г., 1977], [Бекер М.Е., 1978].
Высокомолекулярные вещества обычно не могут непосредственно использоваться микроорганизмами в процессе их жизнедеятельности, необходимо их предварительное расщепление до мономеров [Грачёва И.М. с соавт., 1980], [Блинов Н.П., 1989].
Микроорганизмы-продуценты
Выделение фракции глютена. После измельчения водно-зерновой смеси (гидромодуль 1:4) на РПА, суспензию пропускали через сито с размером ячеек 0,5мм. Образовавшийся фильтрат I разделяли на сепараторе с фактором разделения 750, получая при этом крахмальную фракцию. Получаемый фугат дополнительно центрифугировали с фактором разделения 3500, получая глютеновую фракцию I. Зерновые оболочки смешивали с водой в соотношении 1:1, дополнительно пропускали через РПА и образовавшуюся суспензию отстаивали при температуре 20-25С в течение 4-6 часов. Глютеновую фракцию II, локализованную в верхнем слое, отделяли декантированием, а оставшуюся суспензию II крахмала и зерновых оболочек пропускали через сита с размером ячеек 0,1мм для отделения зерновых оболочек. Получаемый фильтрат смешивали с фильтратом I и направляли на сепарирование.
Ферментативный гидролиз протеиновой (глютеновой) фракции.
Глютеновую фракцию I и II с заданными концентрациями глютена, фермента и величиной рН передавали в биореактор, в котором проводили процесс ферментолиза при интенсивном перемешивании и заданной температуре в течение заданного времени экспозиции. Значения режимных параметров задавали с использованием математических методов планирования эксперимента (схема ортогональных латинских прямоугольников с варьированием каждого фактора на 4 уровнях). При изучении влияния технологических параметров (концентрации глютена, рН, концентрации фермента) на эффективность ферментолиза готовили суспензии с заданными свойствами, доводили рН 8,5, вносили фермент Alcalase 2,4FG (9 ME на 100 мл суспензии) и вели гидролиз в течение 4-х часов, отбирая пробы каждые 0,5 часа.
Значения технологических параметров задавали с использованием математических методов многофакторного планирования эксперимента (схема ортогональных латинских прямоугольников с варьированием каждого фактора на 4 уровнях) [Бирюков В.В., 2004]. В результате исследований было получено 58 вариантов ферментолизатов глютена, различающихся между собой условиями приготовления (табл. 2.3.)
Ферментативный гидролиз крахмала проводили в два этапа, с использованием фермента сс-амилазы Термамил СЦ (производство фирмы Novozymes), из расчета 2 ЕА/г крахмала, затем с использованием глюкоамилазы «СанЭкстра Л» (производство фирмы Novozymes) из расчета 6-8 ЕА/г крахмала. Перед приготовлением сред сироп стерилизовали в режиме 111-112С, 30 минут.
Биосинтез продуктов на средах с ферментолизатами глютена. Оценку влияния качества ферментолиза на эффективность биосинтеза проводили в колбах объемом 250 мл для продуцентов лизина, лейцина, валина и астаксантина и объемом 750 мл для продуцентов гликопептидного антибиотика и пробиотика. В качестве контроля использовали среды и режимные параметры, принятые для культивирования соответствующих продуцентов с традиционными компонентами ростовых субстратов (кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, пептон). Среды на основе ферментолизатов глютена варьировали с использованием схемы ортогональных латинских прямоугольников. Для процесса биосинтеза лизина были дополнительно проведены эксперименты в ферментёрах Bioflo
Влажность глютена и содержание сухих веществ в нём определяли согласно ГОСТ 3040-55 «Зерно. Методы определения качества.» (3-я часть).
В работе аминокислотный состав ферментолизата глютена и концентрацию аминокислот в культуральнои жидкости определяли с помощью ТСХ в системе растворителей н-бутанол/уксусная кислота/вода с окрашивающим нингидриновым реактивом [Уильяме Б., 1978]. Общую концентрацию свободных аминокислот определяли, исходя из более легко определяемой концентрации аминокислоты лейцина. Показано, что доля лейцина относительно всех аминокислот постоянна и составляет 12%, что соответствует её содержанию в белке глютена. Концентрацию лейцина определяли методом тонкослойной хроматографии.
Качественный состав Сахаров определяли также с помощью тонкослойной хроматографии (система изопропанол/ этилацетат/ вода) в ферментолизатах глютена и крахмала и культуральнои жидкости микроорганизмов. [Герхардт Ф. с соавт., 1983, С. 191], [Фрайфелдер Д., 1980], [Волынец М.П., 1974]; [БерезкинВ. Г., 1980
Сравнительный анализ способов
Использовали фракцию глютена I. Для гидролиза использовали следующие ферментные препараты производства фирмы Novozymes, Дания:
Alcalase 2,4FG, Neutrase 0,5L, Novozyme и Протосубтилин ПОх (Сиббиофарм, Россия). Изучали влияние режимных параметров процесса ферментолиза: рН, время экспозиции, температуру, концентрацию фермента. Изучение проводили по схеме ортогональных латинских прямоугольников. План экспериментов и полученные результаты представлены в табл. 4.1.
На основании этих результатов выбраны следующие субоптимальные условия проведения процесса: концентрация фермента - 0,5-0,9 МЕ/мл и более, рН - 8,5, время ферментолиза - 1,5 часа и более. При этом достигнута максимальная концентрация растворимых аминокислот 38 г/л. Эти условия реализованы в опыте 2 (табл. 4.1)
При повторных опытах концентрация свободных аминокислот достигала 37-39 г/л, тогда как при рекомендуемых производителем параметрах (рН 6-8, концентрация фермента 0,05-0,08 МЕ/мл) концентрация аминокислот не превышала 7-11 г/л. Таким образом, проделанная работа позволила повысить глубину ферментолиза с 7-11 г/л до 37-39 г/л свободных аминокислот в ферментолизате.
Эффекты влияния уровней факторов на степень ферментолиза глютена препаратом Alcalase 2,4FG Наименование показателя Эффекты уровней факторов, г аминокислот/л Времяэкспозиции,час Экспозиция 0,5 1,0 1,5 2,0 Эффект -8,8 -0,3 3,9 5,1 Концентрация фермента,МЕ/мл суспензии Концентрация, 0,25 0,38 0,5 0,9 Эффект -6,5 -4,6 4,1 7,0 рН РН 6,5 7,5 8,5 9,5 Эффект -4,5 1,3 7,6 -4,4 Доверительный интервал для оценки значимости эффектов факторов при 95%-ной надежности оценки составил ±0,7 г/л. Представлялось интересным в однофакторных экспериментах подтвердить выводы, полученные в опытах по схеме планирования.
Графики однофакторных экспериментов приведены нарис. 4.1,4.2,4.2, и 4.2. Уровень рН Рис 4.1. Содержание аминного азота (1) и свободных аминокислот (2) в ферментолизате глютена в зависимости от величины рН при концентрации фермента 0,38 МЕ/мл после 2 часов ферментолиза.
Из рисунка 4.3 видно, что содержание аминного азота не превышает 26,2 г/л при рН от 6,5 до 7,5. Максимальное содержание аминного азота наблюдается при уровне рН от 8,5 до 8,9. А максимального уровня концентрация свободных аминокислот достигает при рН равной 8,4-8,6. Это соответствует таблице 4.1. го
Зависимость содержания аминного азота(1) и свободных аминокислот (2) от концентрации фермента Alcalase 2,4FG после ферментолиза при постоянных температуре 60 С, времени ферментолиза 2 час ирН 8,5. Рис. 4.2 показывает, что содержание аминного азота достигает уровня 53,5г/л, аминокислот - 33,4 г/л при концентрации 0,38 МЕ/мл суспензии и с увеличением концентрации фермента возрастает. Это соответствует таблице 4.1. Рис 4.3. Динамика накопления аминного азота (1) и свободных аминокислот (2) в ферментолизате глютена в зависимости от времени экспозиции при рН 8,5 и концентрации фермента 0,45 МЕ/мл. Рис. 4.3. свидетельствует о том, что достаточно высокая концентрация свободных аминокислот и аминного азота достигается за первые 2 часа, продолжение процесса ферментолиза не приводит к значительному увеличению концентрации аминокислот.
Рис 4.4. Зависимость содержания свободных аминокислот от величины рН при различных концентрациях фермента Alcalase FG: 1-0,125 МЕ/мл; 2- 0,45 МЕ/мл; 3- 0,9 МЕ/мл. Время экспозиции - 2 часа. На рис. 4.4. представлены кривые зависимости концентрации свободных аминокислот после ферментолиза глютена при различных концентрациях фермента Alcalase FG. При концентрации фермента 0,45 МЕ/мл белка содержание аминокислот около 40 г/л при оптимальном рН, а с увеличением концентрации до 0,9 МЕ/мл прирост аминокислот сравнительно невелик. Это не соответствует таблице 4.1, но все же концентрация фермента 0,9 МЕ/мл дает больший эффект, чем 0,45 МЕ/мл. Аналогичные данные были получены для других ферментов. Результаты обработки данных в результате планирования эксперимента для фермента Neutrase 0,5L и Novozyme представлены в табл. 4.3 и 4.4 соответственно. Таблица 4.3. Эффекты влияния уровней факторов на степень ферментолиза глютена препаратом Neutrase 0,5L Наименование показателя Эффекты уровней факторов, г аминокислот/л
Доверительный интервал для оценки значимости эффектов факторов при 95 %-ной надежности оценки составил ±0,8 г/л. Получены субоптимальные условия проведения процесса для фермента Neutrase 0,5L: концентрация фермента - 0,85 МЕ/мл и более, рН - 6,1-6,7, время ферментолиза — 6 часов и более, температура процесса — 45-49 С (табл. 4.3.). При этом максимальная концентрация аминокислот в среде составила 29 г/л.
Выявлены субоптимальные условия проведения процесса для фермента Novozyme: концентрация фермента - 0,85 МЕ/мл и более, рН — 6,7-7,3, время ферментолиза - от 4 часов, температура процесса - 53-56 С (табл. 4.4.). При этом максимальное содержание аминокислот в среде составило 32 г/л.
После подбора оптимальных параметров для ферментов показано, что для препаратов Neutrase 0,5L и Novozyme оптимальные значения концентрации находятся в пределах 0,85-1,19 МЕ/мл суспензии, время экспозиции — около 4-8 часов. При использовании Alcalase 2,4FG оптимальная концентрация фермента - 0,5-0,9 МЕ/мл, время экспозиции - от 1,5 часов.
Для выбора ферментного препарата проводили процесс ферментолиза на одной и той же суспензии при условиях, специфичных для каждого фермента. Аналогичные опыты были поставлены для обеих фракций глютена. В качестве параметра оптимизации использовали концентрацию свободных аминокислот в ферментолизате через 2 часа экспозиции. Результаты представлены в табл. 4.5. Таблица 4.5.
Концентрация свободных аминокислот в ферментолизатах глютена, полученных при использовании различных ферментных препаратов при оптимальных параметрах через 2 часа экспозиции Ферментный препарат Параметры ферментолиза Концентрация свободныхаминокислот вферментолизате, г/л рН Температура, С Концентрацияфермента,МЕ/мл Фракцияглютена I(160 г/л СВ) Фракцияглютена II(280 г/л СВ) Alcalase 2,4FG 8,5 60 0,5 37 30,4 Neutrase 0,5L 6,7 49 1,19 27 20,8 Novozyme 6,7 49 1Д9 30,1 22,5 Протосубтилин ПОх 6,0 36 53 7Д 5,9 Из табл. 4.5. следует, что наилучшие результаты по концентрации свободных аминокислот имеет ферментный препарат Alcalase 2,4FG. При использовании препаратов Neutrase 0,5L и Novozyme содержание аминокислот 25-30 г/л достигается при более высоких концентрациях препарата (1,19 МЕ/мл) и более длительном времени экспозиции. Поэтому для дальнейших исследований использовали препарат Alcalase 2,4FG.
Общее количество приготовленных ферментолизатов, приготовленных с использованием различных ферментов и режимов ферментолиза составило 59 вариантов. Характеристика ферментолизатов и варианты обработки представлены в табл. 2.3. Доверительный интервал для концентрации аминокислот в ферментолизате при 95% надежности составил ±3,75% или ±1,5 г/л.
Проверка в однофакторных зависимостях
Влияние концентрации свободных аминокислот на скорость ферментолиза. Учитывая очевидный эффект ингибирования процесса ферментолиза аминокислотами, интересно найти зависимость между их концентрацией и скоростью ферментолиза. С этой целью изучали влияние различных концентраций фугата ферментолизата в суспензии на процесс гидролиза при постоянной концентрации субстрата.
На основе суспензии глютена с содержанием СВ 165 г/л, белка- 65 г/л, готовили 5 суспензий с одинаковым содержанием сухих веществ (99 г/л в соотношении глютена с жидкой фазой 3:2). В жидкой фазе воду частично (в суспензии 15 полностью) заменяли эквивалентным количеством источника свободных аминокислот - фугата ферментолизата (табл. 5.5).
Таким образом, количество фугата ферментолизата в суспензиях составляло от 10 до 40% по объему. Использовали фугат с содержанием свободных аминокислот около 38 г/л. Суспензию анализировали по общей схеме. Концентрация свободных аминокислот в ферментолизате в зависимости от времени экспозиции при постоянной концентрации белка в исходной суспензии 39,8 г/л, концентрации свободных аминокислот в исходной суспензии, г/л: 1- 0; 2- 3,78; 3- 7,56; 4- 11,3; 5- 15,1. Сравнивая представленные на рис. 5.10 зависимости, можно констатировать, что замедление процесса при повышении концентрации аминокислот происходит уже в начале процесса, а также что в опытах с фугатом происходит уменьшение конечных концентраций свободных аминокислот.
На рис. 5.11 те же графики перестроены в виде изменения суммарной концентрации аминокислот, внесенных в начале процесса и образовавшихся в процессе ферментолиза.
Концентрация свободных аминокислот в ферментолизате в зависимости от времени экспозиции при постоянной концентрации белка в исходной суспензии 39,8 г/л, концентрации свободных аминокислот в исходной суспензии: 1- 0 г/л; 2- 3,78 г/л; 3- 7,56 г/л; 4- 11,3 г/л; 5- 15,1 г/л ДО
Зависимость концентрации аминокислот и скорости образования аминокислот от времени ферментолиза при добавлении ферментолизата глютена в концентрации, г/л аминокислот: 1- 0; 2- 3,8; 3- 15. Начальная концентрация белка с суспензиях 39,8 г/л.
На рис. 5.12 дана зависимость концентрации аминокислот и скорости образования аминокислот при этих концентрациях от времени ферментолиза Показано, что скорость процесса снижается до нуля в диапазоне 35-40 г/л -как раз тех концентраций, которые при ферментолизе являются критическими. В табл. 5.6. представлены данные о концентрации свободных аминокислот и остаточного белка в конце процесса в опытах этой серии.
Концентрация свободных аминокислот в ферментолизате в зависимости от времени экспозиции при содержании белка 99г/л и содержании крахмала: 1- 0%; 2- 5%; 3- 10%.
Полученные данные свидетельствуют о том, что ингибирования процесса ферментолиза при добавлении крахмала не наблюдается (рис. 5.13.). Отклонения значений при добавлении крахмала находятся в пределах допустимой погрешности.
Представлялось интересным проверить влияние ферментолизованного крахмала на процесс ферментолиза.
Ферментативный гидролиз глютена с повышенным содержанием ферментолизованного крахмала. В каждую колбу, кроме контрольной, вносили ферментолизованный крахмал в количестве 5 и 10 % по массе с содержанием сухих веществ 800 г/л. Содержание моно- и дисахаров в ферментолизате 75%. Суспензию анализировали по общей схеме. Характеристики суспензий для ферментолиза
Концентрация свободных аминокислот в ферментолизате в зависимости от времени экспозиции при содержании белка 99г/л и содержании крахмала ферментолизованного: 1- 0%; 2- 5%; 3- 10%.
Полученные данные на рис 5.14. свидетельствуют о том, что ингибирования процесса ферментолиза при добавлении ферментолизата крахмала не наблюдается. Отклонения значений при добавлении крахмала находятся в пределах допустимой погрешности. 5.4.
Очевидно, что предыдущие опыты подтверждают наличие ингибирования процесса ферментолиза продуктом реакции. Для более полного использования белка необходимо использовать особые способы организации процесса. Для суспензий с содержанием белка более 40 г/л предложено замещать водный раствор с продуктом гидролиза на воду с эквивалентным количеством фермента после 1,5 часов экспозиции (когда прирост аминокислот останавливается, а концентрация белка в суспензии остается достаточно высокой) (рис. 5.15). При этом, конечно, сначала супернатант отделяется от осадка остаточного глютена с помощью центрифуги.
Концентрация свободных аминокислот в ферментолизате в зависимости от времени экспозиции при концентрации белка в исходной суспензии, г/л: 1- 71,5; 2- 59; 3- 44. Характеристика продуктов ферментолиза Таблица 5. № суспензии Состав суспензии глютен : вода PQ Белок, г/л начальный Белок, г/л конечный Концентрация свободных аминокислот 1 ступень .г/л Концентрация свободных аминокислот 2 ступень,г/л Концентрация свободных аминокислот 3 ступень,г/л
Концентрация белка в ферментолизате в зависимости от времени экспозиции при его концентрации в исходной суспензии, г/л: 1- 71,5; 2- 59; 3-44.
После замещения жидкой фазы ферментолизата водным раствором фермента процесс гидролиза продолжился со скоростью, характерной для начала процесса. Данные анализа, представленные на рис. 5.16 и табл. 5.10 показали, что гидролиз остаточного, негидролизованного за первые 1,5 часа глютена прошел полностью во всех трех суспензиях.
Таким образом, подтверждается предположение, что одним из ингибирующих факторов являются конечные продукты гидролиза белка.
Однако, данный опыт также можно интерпретировать и как инактивацию фермента при высоком содержании твердой фазы в суспензии, хотя по классической схеме ферментолиза фермент в ходе реакции не расходуется, а остается в исходной концентрации.
Выявление ингибирующего фактора протеолиза. Мы предположили, что ингибирование ферментолиза может быть связано как с накоплением продукта, так и с инактивацией фермента. Для этого в 3 суспензии глютена с одинаковыми свойствами (166 г/л глютена, 71,5 г/л белка) вносили фермент и проводили процесс ферментолиза в течение 1,5 часов для накопления большой концентрации аминокислот.
Показано, что добавление фермента в суспензию через 1,5 часа не повышает концентрации аминокислот, в то время как отделение супернатанта и замена его раствором фермента (кривая 2) или даже водой (кривая 3) позволяет продлить процесс ферментолиза и увеличить степень гидролиза белка.
