Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14-37
1.1. Компонентный состав и проницаемость клеточных стенок дрожжей 14-20
1.2.Интенсификация роста дрожжевых клеток с использованием биостимуляторов 21-31
1.3.Биологически активные материалы на основе хитина панцирей ракообразных 31-36
1.4.Заключение 37
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 38
Глава 2. Материалы и методы 38 -44
2.1. Объекты исследования (микроорганизмы, условия их культивирования и спиртообразования) 38 -41
2.2.Характеристика зерновых субстратов 41 - 42
2.3.Химико-аналитические и биохимические методы исследования состава и физиологической активности дрожжевых клеток 42-43
2.4.Список сокращений и условных обозначений -. 44
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Глава 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ИЗМЕРЕНИЯ ГЕКСОЗАМИНОВ В ХИТИНОВЫХ ГИДРОЛИЗАТАХ ДЛЯ ХИМИЧЕСКОЙ ХАРАКТЕРИСТИ КИ ИХ КАЧЕСТВА 45-56
3.1. Отработка метода в лабораторных условиях 45 - 50
3.2.Применение метода для анализа препаратов ХОС (хитодекстрина) 50 - 51
3.3.Пропись методики колориметрического анализа гидролизатов хитина для химической характеристики их качества 51 - 56
Глава 4. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЙ ГЛУБОКОЙ ДЕГРАДАЦИИ ХИТИНА КОНЦЕНТРИРОВАННОЙ СЕРНОЙ КИСЛОТОЙ И ПОЛУЧЕНИЯ НОВЫХ ОЛИГОСАХАРИДНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ГИДРОЛИЗАТОВ ХИТИНА 57-66
4.1 .Разработка технологии прямой деполимеризации хитина 57-59
4.2.Разработка технологий получения препаратов хитиновых олигосахаридов: 59-66
- водорастворимого хитодекстрина - 1
- частично растворимого хитодекстрина - 2 (солихита).
Глава 5. ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ ХИТИНОВЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ (ХИТОДЕК СТРИНА) 67-83
5.1.Доклиническая оценка безопасности хитиновых олигосахаридов 67-70
1) Проблема безвредности.
2) Острая токсичность.
3) Хроническая токсичность.
4) Местное раздражающее действие.
5) Местное действие на слизистые глаз и носа.
6) Кожно-раздражающее действие.
7) Аллергенные свойства.
8) Эмбриотоксическое и тератогенное действие.
9) Канцерогенные свойства.
5.2 .Основные области применения хитодекстрина 70-71
5.3 .Медицинские аспекты использования хитодекстрина 71 - 73
1) ХД - источник АГА в организме;
2) ХД-2 - профилактическое средство от остеопороза;
3) Бифидогенная активность, преодоление дисбиоза кишечника и стимуляция иммунитета;
5.4.Хитодекстрин - оздоровительная кормовая добавка в животноводстве и птицеводстве 73 - 5.5. Хитодекстрин - биостимулятор роста растений 77-79
5.6. Механизмы действия биологически активных препаратов на основе хитина ракообразных 79-83
Глава 6. ИНТЕНСИФИКАЦИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМПОЗИЦИОННЫХ БИОСТИМУЛЯТОРОВ РОСТА КЛЕТОК 84-108
6.1. Требования к биостимуляторам, отбираемым при их скрининге 84 -86
6.2. Разработка многокомпонентного биологически активного препарата композиционного биостимулятора (КБС) 86-91
6.3. Интенсификация процесса выращивания дрожжей Saccharomyces cerevisiae на средах с зерноматериалами 91
- Действие солихита на рост дрожжей 91
- Действие композиционных биостимуляторов на рост дрожжей ..92
Испытания в лабораторных условиях 92-96
Испытания и внедрение КБС в промышленных условиях 96-98
6.4.Интенсификация процесса спиртообразования дрожжами Saccharomyces cerevisiae на средах с зерноматериалами 98-99
Интенсификация процесса спиртообразования с использованием хитиновых олигосахаридов 99 - 101
- Интенсификация процесса спиртообразования с использованием композиционных биостимуляторов 101- 104а
6.5. Интенсификация роста растений с использованием в качестве сти
мулятора ХД-2 (солихита) 105-108
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 109-113
ВЫВОДЫ 114-118
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 119-143
ПРИЛОЖЕНИЯ
- Компонентный состав и проницаемость клеточных стенок дрожжей
- Объекты исследования (микроорганизмы, условия их культивирования и спиртообразования)
- Отработка метода в лабораторных условиях
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы во всем мире наблюдается значительный интерес к биотехнологическим процессам, в которых целевые продукты синтезируются в ходе жизнедеятельности клеток микроорганизмов. Клетки при этом растут, развиваются, потребляют питательные вещества и энергию. При решении проблемы удовлетворения потребности населения в полноценном белке мы обратили внимание на то, что многие микроорганизмы обладают высокими скоростями синтеза биомассы и белков. В этом плане значительный интерес представляют дрожжи, поскольку для них характерны достаточно высокие темпы роста, быстрое накопление биомассы и белков, а в связи с достаточно большими размерами их клеток они удобны для использования в промышленных масштабах. Белки дрожжей по аминокислотному составу соответствуют белкам животных. Дрожжи можно также рассматривать как источник для получения ряда очень ценных препаратов медицинского и ветеринарного назначения, а также для получения таких целевых продуктов, как этанол. Основной стадией получения биомассы является стадия выращивания дрожжей, в процессе которой создаются условия для накопления максимального количества биомассы требуемого качества. Одной из предпосылок разработки интенсивных технологических процессов получения биомассы является обеспечение максимальной скорости роста культуры при минимальном содержании субстрата на выходе из ферментера, т.е. максимальная продуктивность ферментера должна коррелировать с полнотой исчерпания субстрата и минимальным накоплением в среде побочных продуктов метаболизма [23], что достигается при точном соответствии скорости подачи субстрата предельной способности клеток утилизировать его в данных условиях культивирования [178].
Питательные среды и источники энергии в крупномасштабном производстве могут оказывать серьезное тормозящее влияние на ход биотехнологических процессов. Интенсификации процесса биосинтеза биомассы и целевых продуктов при использовании дрожжей способствует введение в питательную среду биостимуляторов. При этом интенсификация биотехнологических производств осуществима путем ускорения метаболических процессов, включающих десятки и сотни ферментных реакций, устранения всякого рода «узких мест», приводящих к ингибированию ферментативных реакций, снижению скоростей массопереноса субстратов и продуктов и т.д.
Следует учитывать, что потребность микроорганизмов в биостимуляторах не абсолютна и может меняться в зависимости от состава питательной среды и условий культивирования (рН, температура и др.). В связи с этим выявление стимуляторов и условий их действия на популяцию чрезвычайно важно для достижения максимальной продуктивности, при минимальных затратах.
В процессе их использования, помимо интенсифицирующего рост клеток действия, следует учитывать и другие показатели: качество получаемого продукта и затраты на применение стимулятора. В затраты прежде всего входят стоимость самого стимулятора, стоимость его транспортировки, дозировки и длительность его воздействия на технологический процесс, т.е. необходимо учитывать экономическую эффективность использования тех или иных стимуляторов.
Применение биостимуляторов приводит к более полному потреблению компонентов питательной среды, что позволяет организовать технологический процесс по замкнутому циклу, снизить нагрузки на очистные сооружения и тем самым повысить экологическую чистоту производства. Больше того, они, как правило, повышают качество биомассы, что проявляется в увеличении содержания белка в биомассе и улучшении других показателей, а также позволяют увеличивать выпуск целевых продуктов, образующихся в процессе жизнедеятельности дрожжей, в частности, этанола.
В настоящее время разработка технологий получения и применения высокоэффективных биостимуляторов при культивировании клеток для осуществления биотехнологических процессов синтеза, гидролиза, окисления, перегруппировок и др., чрезвычайно актуальна, главным образом, применительно к крупнотоннажным производствам. Это объясняется тем, что использование их позволяет получать значительный экономический эффект без каких-либо затрат для введения дополнительного оборудования и изменения технологических схем производства. При этом было выявлено, что наиболее эффективно использование композиционных биостимуляторов, включающих ряд биологически активных компонентов, синергически усиливающих действие друг друга. В этом плане оказалась перспективным включение в состав таких композитов водорастворимых хитиновых олигосахаридов (ХОС) со степенью полимеризации 3-8, получаемых прямой деполимеризацией хитина. В связи с этим разработка методов их анализа, оптимизация технологии их получения и использование для интенсификации биотехнологических процессов представляет научный интерес и имеет важное практическое значение.
Следует отметить, что исследования проводились с дрожжами Saccharomyces cerevisiae, выращиваемых на зерновом сусле. Однако как методические подходы, так и полученные нами результаты могут быть использованы при конверсии различных субстратов, т.е. при решении общих вопросов, относящихся к крупнотоннажной биотехнологии, в медицинской и микробиологической промышленности.
Цель и задачи исследования. Целью настоящих исследований является разработка технологии получения хитиновых олигосахаридов, научное обоснование их включения в состав композиционных биостимуляторов для создания высокопроизводительных биотехнологических процессов культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae на гидролизатах зерносырья.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
-разработка новой, упрощенной методики анализа водорастворимых продуктов, образующихся в результате деградации хитина;
-проведение исследований по разработке эффективной технологии получения олигосахаридов хитина (хитодекстринов - ХД) на основе сернокислотной деградации хитина крабов и разработка принципиальных схем получения различных продуктов на основе получаемого гидролизата;
-наработка в камеральных условиях партий хитиновых олигосахаридов и проведение испытаний на их безвредность, безопасность и биологическую активность;
-исследование влияния хитиновых олигосахаридов на процессы генерации дрожжей Saccharomyces cerevisiae и сбраживания зернового сусла, а также на рост овощных культур;
-разработка высокоэффективных композиционных биостимуляторов роста дрожжевых клеток и спиртообразования, включающих биологически активные хитиновые олигосахариды;
-апробация и внедрение основных результатов исследований в промышленных условиях культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Научная новизна работы заключается в создании нового направления в исследованиях, касающихся интенсификации процессов получения биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae повышенной биологической ценности, а также продукта жизнедеятельности дрожжевых клеток - этанола, с использованием композиционных биостимуляторов (КБС). При этом в процессе исследований получены новые научные результаты методического, теоретического и прикладного характера:
1. Разработана новая упрощенная методика оценки содержания водорастворимых хитиновых продуктов, получаемых в результате как кислотного, так и ферментативного гидролиза хитин-хитозанов. В соответствии с этой методикой весь анализ от внесения раствора вещества до колориметрирования прово 9. дят в одной и той же пробирке, благодаря использованию на стадии гидролиза малых объемов (0,2 мл) всех растворов, азеотропной смеси HCL и неполной нейтрализации кислотного гидролизата, что обеспечило значительную точность и воспроизводимость получаемых результатов. Впервые проведено комбинирование двух методов анализа хитиновых продуктов, из которых один позволяет оценивать общее содержание водорастворимых компонентов хитина, а другой его мономер, N - АГА. Это позволило охарактеризовать эффективность кислотного гидролиза хитина и качество гидролизата.
2. Показана принципиальная возможность получения в одну стадию водорастворимых биологически активных олигосахаридов хитина с оптимальной степенью полимеризации (3-8), - хитодекстринов (ХД) с широким спектром биологической активности.
3. Установлено стимулирующее действие ХД на рост дрожжевых клеток, спиртообразование, а также на рост овощных культур и прорастание семян.
4. Научно обоснована необходимость разработки и состав композиционных биостимуляторов ростка клеток на основе отобранных в процессе скрининга биологически активных соединений, способных интенсифицировать метаболизм дрожжевых клеток.
5. Впервые выявлено стимулирующее действие высокоэффективных КБС на процессы дрожжегенерации и спиртового брожения при культивировании дрожжей Saccharomyces cerevisiae на средах с зерновым суслом; показано, что использование КБС в сверхмалых оказывает стимулирующее действие на физиологическую активность, морфофизиологическое состояние, рост и размножение, продуктивность и бродильную способность этих дрожжей. Впервые по казано, что КБС в периодических и непрерывных режимах, в лабораторных и промышленных условиях способны в значительной степени интенсифицировать рост дрожжевых клеток, что проявлялось в улучшении основных технологических показателей производства (увеличение продуктивности культуры,
10. снижение расходных коэффициентов по субстрату) и качества получаемого продукта. В процессах спиртообразования стимулирующее действие высокоэффективных КБС проявлялось в улучшении морфо-физиологического состояния дрожжевых клеток и увеличении их количества [в дрожжегенераторах;] в значительном сокращении времени спиртообразования, в более глубоком и ускоренном потреблении сухих веществ, снижении количества недоброженных углеводов бражки, увеличении выхода спирта от потребленного крахмала зер-носырья при соответствии качества спирта марке «Люкс».
6. Установлено существенное увеличение общей активности КБС по сравнению с суммарной активностью отдельных компонентов при значительном снижении удельного расхода последних за счет их синергического действия.
Практическая ценность работы заключается в разработке и практической реализации высокопроизводительных, энерго- и ресурсосберегающих - биотехнологических процессов получения высококачественной биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae и этанола с использованием композиционных биостимуляторов роста клеток:
1. Разработана эффективная технология прямой деполимеризации хитина панцирей крабов действием на него концентрированной серной кислотой, которая позволяет не только получать в одну стадию биологически активные хитиновые олигосахариды с оптимальной степенью полимеризации (3-8) и выпускать два новых продукта, но и избежать многих экологических проблем, связанных с необходимостью утилизации больших количеств едких отходов, образующихся при получении БАВ на основе хитина в соответствии с другими известными технологиями.
2. Разработаны технологическая схема получения на основе гидролизата хитина водорастворимого биологически активного препарата - хито декстрин-1 (ХД-1) и безотходная технологическая схема, позволяющая создать экологически чистое производство с ресурсосберегающей технологией частично растворимого биологически активного препарата - хитодекстрин-2 (ХД-2, или соли-хит).
3. Выявление значительной биологической активности хитиновых олиго-сахаридов позволило широко рекомендовать их использование в различных об ластях народного хозяйства в качестве активного стимулятора роста и развития растений, молодняка животных и птицы, бифидобактерий, дрожжевых клеток, процессов спиртообразования.
4. Использование КБС в условиях крупнотоннажных производств получения биомассы и этанола позволяет получать значительный экономический эффект без каких-либо затрат для введения дополнительного оборудования и изменения технологических схем производства. Так, внедрение КБС при производстве кормового белкового продукта «Провита» на Новополоцком заводе БВК (Республика Беларусь) позволило существенно улучшить все технологические показатели производства, улучшить качество биомассы дрожжей-сахаромицетов и получить годовой экономический эффект от использования КБС-1 в размере 352 млн. руб./год, а от КБС-2 - 645 млн.руб./год.
Более полное потребление субстрата и продуктов метаболизма в культу-ральной жидкости в присутствии биостимуляторов позволяет значительно снижать сброс загрязнений на очистные сооружения и тем самым достигать существенного улучшения экологической обстановки на заводах по производству БВК на основе зерносырья. Сокращение времени брожения в условиях спиртовых заводов позволяет увеличить коэффициент использования оборудования, так как увеличивает количество технологических циклов каждого бродильного чана, а, следовательно, и общую мощность завода.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на: IV Всероссийской конференции «Производство и применение хитина и хитозана», ВНИРО, Москва, 25-28 апреля, 1995, 57-59; IV съезде общества биотехнологов России, Пущино, 6-7 декабря, 2006; Международной научно-практической
12. конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты», Москва, Россия 11-13 марта 2008.
Публикации. Материалы диссертации отражены в 9. печатных работах, в том числе получен патент РФ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложенной в 5 главах; выводов и списка литературы, включающего 239 работ, в том числе 181 отечественных и 58
зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована_14_ таблицами и 5 ри 143 сунками, изложена на бтраницах машинописного текста.
Основное содержание работы.
Во введении к диссертации отражены актуальность проблемы, цель и задачи исследования, научная новизна и практическая ценность работы, структура и объем работы.
В главе 1. представлен обзор литературы, в котором отражены публикации по компонентному составу и проницаемости клеточных стенок дрожжей; интенсификации роста дрожжевых клеток с использованием биостимуляторов; биологически активным материалам на основе хитина панцирей ракообразных.
В главе 2. «Материалы и методы» представлены объекты исследования (микроорганизмы и условия их культивирования); химико-аналитические и биохимические методы исследования состава биомассы и физиологической активности дрожжевых клеток, а также методы подготовки зерносырья для культивирования с использованием технических ферментных препаратов.
В главе 3 представлены результаты по разработке метода измерения гек-созаминов в хитиновых гидролизатах для химической характеристики их качества.
В главе 4 представлены результаты по разработке технологий глубокой деградации хитина концентрированной серной кислотой и получения новых олигосахаридных препаратов на основе гидролизатов хитина — водо-растворимого хитодекстрина-1 и частично растворимого хитодекстрина-2 (солихита).
Глава 5 посвящена характеристике биологической активности хитиновых олигосахаридов (хитодекстринов) (проблемы безвредности, медицинские аспекты использования, использование в животноводстве, птицеводстве, растениеводстве, биотехнологии).
Глава 6 посвящена разработке многокомпонентного высокоэффективного биологически активного препарата - композиционного биостимулятора роста клеток; представлены результаты по интенсификации биотехнологических процессов получения дрожжевой биомассы повышенного качества и процесса спиртообразования, а также выращивания растений.
Компонентный состав и проницаемость клеточных стенок дрожжей
Клеточные стенки дрожжей (КСД) являются первым барьером для проникновения компонентов питания внутрь клетки. Наше внимание к КСД, её структуре и метаболизму определяется прежде всего тем, что динамизм в их синтезе и распаде имеет решающее значение в технологическом плане, а именно в интенсификации роста биомассы в целом. Рост КС представляет тонко регулируемый процесс, в котором работают два противоположных механизма, один из которых контролирует лизис, а другой синтез стенки [183, 184, 195]. В значительном количестве отечественных и зарубежных публикаций, в том числе обзорных, подчеркивается, что КСД являются не инертными структурами, а фактически очень активными «живыми» клеточными органеллами, выполняющими много важных функций в жизни клеток [20, 165, 173, 174, 183, 184, 196, 197, 198, 199,212,221, 230, 236, 379а, б].
Можно выделить некоторые общие черты в выполняемых функциях, биосинтезе, тонкой структуре и компонентном составе КС дрожжей, отличающихся по родовому и видовому признакам, используемому субстрату, условиям выращивания:
а) на клеточной поверхности локализованы антигены, играющие большую роль в таких феноменах, как агглютинация, взаимодействие с клетками других организмов и взаимодействие с окружающей средой;
б) в КСД локализованы различные ферменты, которые либо включаются в собственно метаболизм КС (например, синтетазы, гидролазы) или ферменты, необходимые для расщепления определенных компонентов питания перед их поступлением в клетку (например, глюканазы, протеазы и др.);
в) КСД служат временной станцией для ферментов, секретируемых клеткой и, следовательно, высвобождаемых в среду;
г) компоненты КСД, такие, как углеводы, аминокислоты, фосфаты, катионы и др., могут в некоторых ситуациях служить метаболическим резервом питания.
Поскольку все эти функции КСД во многих случаях являются жизненно важными, очевидно, что они должны быть взяты во внимание, когда решаются различные биотехнологические проблемы, касающиеся роста клеток и их взаимодействия с окружающей средой. Знания о химическом составе и структуре индивидуальных компонентов КСД важны в таких прикладных областях, как иммунология, медицина, пищевая или фармацевтическая индустрия. Знание о химической природе КС может быть использовано для получения протопластов или для предобработки дрожжевых клеток перед их механическим разрушением, в частности, с помощью ферментных препаратов [199].
Клеточная морфология может значительно влиять на реологические свойства микробных суспензий и, следовательно, на транспорт кислорода и потребление компонентов питания [199], что очень важно принимать во внимание, в частности, для разработки интенсивных методов культивирования дрожжей.
Отмечается большое сходство в архитектуре разных дрожжей. Наружный слой представляет собой липопротеидную гладкую мембрану толщиной 100-300 мм. находящийся под ней слой состоит из маннано-протеинового комплекса, в котором молекулы маннана (М.в. 100000) соединены между собой фосфо-диэфирной связью. Во внутреннем слое расположены аморфные маннан, глю-кан, протеины, ковалентно связанные с сеткой из микрофибрилл, построенных из глюканов, образующих граничащий с плазмалеммой внутренний слой [179,165]. Характерной для КС различных дрожжей является неоднородность их структуры, проявляющаяся в том, что в разрезе они имеют 2-3 слоя. Слоистость КС обеспечивает ее устойчивость к различным воздействиям, например, ферментативному гидролизу. Изучение структуры КС представляет значительные трудности в связи с тем, что их индивидуальные компоненты «удерживаются вместе» при помощи ковалентных связей или слабых нековалентных сил -ионных взаимодействий, водородных связей, гидрофобных взаимодействий и вандерваальсовых сил, в результате чего КС в целом представляет собой своего рода надмолекулярный комплекс [224]. Белки, в основном, находятся в виде комплексов с глюканом и маннаном, образующихся, например, этерификацией карбоксильных групп белков гидроксильными группами полисахаридов (гли-копротеина), а также при помощи дисульфидных мостов между белковыми компонентами маннопротеиновых молекул. Именно гликопротеины, представленные, главным образом, маннопротеинами, играют роль рецепторов, воспринимающих многочисленные сигналы, поступающие в клетку из среды, участвуют в осуществлении контактов между организмами [20].
Объекты исследования (микроорганизмы, условия их культивирования и спиртообразования)
Объектами исследования являлись дрожжевые организмы, относящиеся к роду Saccharomyces.
Для получения дрожжевой биомассы использовали дрожжи Saccharomyces cerevisiae diastaticus ВКПМ-у-1218 [24].
Для спиртообразования использовали различные штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В лабораторных условиях использовали дрожжи S. cerevisiae ОН-1 ВКПМ-у-2492 [25].
Культивирование дрожжей Saccharomyces cerevisiae diastaticus ВКПМ-у-1218 в лабораторных условиях.
Культура хранилась на скошенном минеральном агаре. Выращивание дрожжей начинали с пересева музейной культуры на «косой» агар. Косяк вы-_ держивали в течение 24-48 часов при температуре 30С. Затем культуру переносили в качалочную колбу объемом 750 мл со 100 мл стерильной питательной среды, содержащей необходимые соли и источник углерода. Культуру дрожжей вносили в питательную среду из расчета 60-70 мг по сухому весу на 1 л среды. Инкубирование дрожжей осуществляли на ротационной качалке при 30-34С с числом оборотов 180-200 об/мин. в течение 15-24 часов в зависимости от цели эксперимента.
Культивирование дрожжей в камеральных условиях.
Культивирование дрожжей в камеральных условиях проводили в ферментерах с эжекционной мешалкой объемом 5 и 10 л при аэрации среды воздухом . от 0,3 до 2,00 л/мин. л. среды, при 132-34С, рН 4,0-4,2. Выращивание дрожжей осуществляли при периодическом и непрерывном режимах культивирования в аппаратах интенсивного массообмена, снабженных системами автоматического поддержания и регистрации 02 и СОг, системами автоматического дозирования среды и её подачи, а также системой измерения подачи воздуха. Непрерывную подачу субстрата осуществляли с помощью перистальтического насоса (производство Англия).
Состав лабораторных питательных сред с мелассой, г/л водопроводной воды:
Меласса - 40-50 рН -4,2-4,5 (NH4)2S04 - 3,0 по 100 мл в колбы КН2РО4 1,0 с салфетками
Получение ферментативного гидролизата зернопродуктов в лабораторных условиях и выращивание на нем биомассы.
В качестве исходного субстрата использовали пшеничные отруби, рисовую муку или дердь в соотношении 70 : 30, добавляли водопроводную воду (Гидромодуль 1:7). Суспензию тщательно перемешивали и в течение 1 часа термостатировали на кипящей водяной бане. После охлаждения в суспензии доводили рН до 5,0 добавлением к ней 10%-ной серной кислоты. Добавляли следующие ферментные препараты (по отдельности или в смеси): глюкавамо-рин ГЗХ (ГлА = 1050 ед/г (производитель - Бердский БХЗ); пектофоетидин П 10Х (Рассказовский БХЗ); целловиридин (целлюлаза 100) , а также комплексный ФП Сан-Ультра (Голландия).Общая концентрация в смеси составляла 0,2% к объему среды для первых трех ФП; Сан-Ультра добавляли в количестве 1 10" % к объему среды. Суспензию доводили до 45-60С (в зависимости от взятого ФП). Ферментативный гидролиз проводили при соответствующей температуре в течение 5-7 часов. По окончании ферментолиза проводили корректировку солевого состава, а именно в ферментолизат добавляли 0,3% сульфата аммония (N114)2 SO4 и 0,08% однозамещеннсто фосфорнокислого калия (КН2 Р04).
Этот ферментолизат затем использовали для аэробного культивирования дрожжей для получения белково-витаминной биомассы и для анаэробного культивирования дрожжей для спиртообразования.
Стерилизация при 0,5 атм. В течение 30 мин.
Непрерывный режим выращивания дрожжей осуществляли в режиме хе-мостата.
Выращивание дрожжей в промышленных условиях.
Выращивание проводили в соответствии с регламентом по схеме: про-бирки-«косой» агар, качалочные колбы, лабораторный ферментер, аппараты чистой культуры с рабочим объемом 1,6 м3 и 25 м3, производственный аппарат с рабочим объемом 450 - 500 м3. Выращивание дрожжей проводили при 30-32 С, рН 4,5-5,0, при скорости выращивания 0,1-0,15 час"1.
Изучение спиртообразования в лабораторных условиях.
а) На среде с мелассой.
Дрожжи S. cerevisiae ОН-1 ВКПМ-у-2492 сначала выращивали в кача-лочных колбах на солодовом сусле, 7 бал., объем 200 мл. Биомассу отделяли на воронке Бюхнера. Опыты проводили в колбах на 100 мл, в которые вносили по 50 мл раствора мелассы (45 г/л среды). В каждую колбу добавляя по 450 мг прессованных дрожжей. Процесс вели в течение 6 часов, при 32С.
Отработка метода в лабораторных условиях
В технологии низкотемпературной (до 50С) кислотной деполимеризации хитина можно выделить промежуточные стадии, приводящие к образованию водорастворимых олигомеров, и конечные, когда накапливается мономер - N-ацетил-В-глюкозамин. Кроме этих двух продуктов в реакционной смеси обычно присутствуют также нерастворимые хитиновые продукты, известные под названием коллоидного хитина. Соотношение этих компонентов определяет качество кислотного гидролизата, и оно зависит от времени реакции и от других условий (концентрации, температура и пр.). В качестве первичной характеристики таких гидролизатов могут быть использованы доступные колориметрические методы, позволяющие измерять общее количество водорастворимых ами-носахаров и отдельно мономера. В нашей работе мы использовали колориметрические методы, известные под названием методов Моргана - Элсона и Элсо-. на-Моргана. Первый позволяет определять N - ацетил - D-глюкозамин в смеси, а второй - свободный глюкозамин (его соль). N - ацетапкО-глюкозамин является естественным продуктом гидролиза хитина, и его анализ проводится без дополнительной обработки гидролизата. Свободный глюкозамин в виде соли может возникать только после дополнительного исчерпывающего гидролиза водорастворимых продуктов.
Глубина гидролиза должна, по возможности, приближаться к 100%, но важно получить олигосахариды, а не мономер, который часто не проявляет биологической активности. Процесс гидролиза должен удовлетворять требованиям максимального роста первого показателя при минимальном росте второго. Поэтому мы использовали ещё такие показатели, как выход растворимых аминосахаров и содержание мономера в них, т.е. отношение содержания N-ацетил-D-глюкозамина к общей сумме растворимых аминосахаров.
Выбранные показатели качества олигосахаридных препаратов гидролиза-тов хитина позволяют характеризовать количественные различия препаратов, получаемых по разным технологическим схемам из разных видов биологического сырья.
Для приспособления названных колориметрических методов к решению задач первичной оценки качества кислотного гидролизата хитина потребовалось внести в методики анализа ряд изменений, которые были направлены на упрощение процедуры анализа и на обеспечение надежности результатов.
Метод Моргана - Элсона основан на том, что М-ацетил-В-глюкозамин при нагревании в щелочном растворе образует хромоген, 3 - ацетамидо-5-(1,2-диокси) фуран, который в кислом растворе дает с реактивом Эрлиха окрашенное в фиолетовый цвет соединение с двумя максимумами поглощения при 544 и 585 ЙМІ Присутствие, бората увеличивает интенсивность и воспроизводимость окраски.
Метод Элсона-Моргана использовали для определения общего содержания водорастворимых аминосахаридов после стадии гидролиза олигоаминоса-харов до мономера.
Метод основан на том, что аминосахара при нагревании в щелочной среде с ацетил-ацетоном дают продукт конденсации, который, реагируя с пара-диметиламинобензальдегидом, образует розово-красное окрапшвание, с максимум/поглощения при 530 им окраска устойчива по крайней мере 1 час.
Похожие диссертации на Разработка технологии получения хитиновых олигосахаридов и применения их для интенсификации процессов культивирования дрожжей
