Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15
1.1. СИСТЕМАТИКА, ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДРОЖЖЕЙ РОДА SACCHAROMYCES 15
1.1.1 .История появления и становления дрожжей 15
1.1.2. Систематика дрожжей рода SACCHAROMYCES MEYEN EX REESS 15
1.1.3. Виды-двойники'в комплексе SACCHAROMYCES SENSU STRICTO 18
1.1.4. Генетическая концепция рода дрожжей SACCHAROMYCES 20
1.1.5. Идентификация дрожжевых культур 21
1.2. ХАРАКТЕРИСТИКА ВАЖНЕЙШИХ ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ РАСДРОЖЖЕЙ РОДА SACCHAROMYCES 24
1.2.1. Отечественные расы дрожжей для виноградного виноделия 24
1.2.2. Отечественные шампанские расы дрожжей 29
1.2.3. Дрожжи для плодово-ягодного виноделия : 30
1.2.3.1. Отечественные расы дрожжей для производства яблочных вин 32
1.2.3.2. Дрожжи зарубежной селекции для производства яблочных вин .33
1.2.3.3. Отечественные расы дрожжей для производства вин из других плодов и ягод 35
1.2.3.4. Расы зарубежной селекции для производства вин из других плодов и ягод 36
1.2.3.5. Современные критерии отбора дрожжей для производства плодово-ягодных вин 37
1.2.4. Отечественные спиртовые расы дрожжей 38
1.3. АСД ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ РАС ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE 39
1.3.1. Технология препаратов АСВД 42
1.3.1.1. Исходные культуры дрожжей 43
1.3.1.2. Сырьё для культивирования винных дрожжей 43
1.3.1.3. Культивирование дрожжей 45
1.3.2. Физиология термостойкости дрожжей 48
1.3.3. Морфологические и физиолого-биохимические изменения, происходящие при высушивании дрожжей 51
1.3.3.1. Морфологические изменения 51
1.3.3.2. Биохимические изменения 52
1.3.4. Обезвоживание винных дрожжей 53
1.3.5. Оценка качества препаратов винных АСД 53
1.3.6. Подготовка сухих дрожжей к брожению 54
1.4. ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ВИННЫЕ ДРОЖЖИ : 55
1.4.1. Методы иммобилизации винных дрожжей 56
1.4.2. Использование иммобилизованных дрожжей при производстве шампанских вин '62
1.4.3. Использование иммобилизованных дрожжей при производстве виноградных вин 66
1.4.4. Применение иммобилизованных дрожжевых клеток для биологического кислотопонижения вин 69
1.4.5. Применение иммобилизованных клеток дрожжей для возобновления вялотекущего или остановившегося брожения и устранения недобродов 71
1.4.6. Иммобилизованные дрожжи в плодово-ягодном виноделии 72
1.4.7. Стабильность препаратов иммобилизованных клеток дрожжей при хранении 73
1.4.8. Криогель поливинилового спирта - носитель для иммобилизации клеток 74
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 76
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 76
2.1. МАТЕРИАЛЫ 76
2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 76
2.2.1.Хранение культур дрожжей 76
2.2.2. Культивирование клеток дрожжей и накопление биомассы 77
2.2.3. Видовая идентификация дрожжей Saccharomyces 77
2.2.4. Молекулярно-биологические методы исследования дрожжей Saccharomyces 78
2.2.4.1. ПЦР и анализ продуктов 78
2.2.4.2. Пульс-электрофорез 79
2.2.4.3. Молекулярное кариотипирование и Саузерн-гибридизация 79
2.2.4.4. Определение родства между штаммами 79
2.2.4.5. Определение множественной ПЦР 80
2.2.4.6. Молекулярный анализ штаммов S. cerevisiae с помощью микросателлитного праймера (GTG) 80
2.2.4.7. Секвенирование и филогенетический анализ 80
2.2.4.8. ПДРФ-анализ амплифицированного фрагмента митохондриального гена СОХ2 80
2.2.5. Оптимизация режимов культивирования 81
2.2.6. Культивирование дрожжей в промышленных условиях 81
2.2.7. Определение качества сухих дрожжей 83
2.2.8. Определение биохимических характеристик дрожжевых клеток 84
2.2.9. Постановка процесса брожения при исследовании биохимических и технологических свойств различных рас винных дрожжей, а также препаратов винных АСД и ИД 85
2.2.10. Аналитические и микробиологические исследования во время брожения, а также методы исследования готовых вин и виноматериалов 88
2.2.11. Электронная, флуоресцентная и световая микроскопия клеток дрожжей и образцов биокатализаторов, созданных на основе ИД 90
2.2.12. Иммобилизация клеток дрожжей в криогель ПВС 91
2.2.13. Определение кинетических параметров роста свободных клетоки брожения, катализируемого свободными и иммобилизованными клетками...93
2.2.14. Определение периодов полуинактивации биокатализатора 94
2.2.15. Обработка гранул биокатализатора с целью подавления функции размножения у иммобилизованных клеток дрожжей 94
2.2.16. Определение сухого веса биомассы дрожжей и биокатализатора 95
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 96
ГЛАВА 3. СЕЛЕКЦИЯ НОВЫХ РАС ДРОЖЖЕЙ- САХАРОМИЦЕТОВ 96
3.1.СЕЛЕКЦИЯ ДРОЖЖЕЙ ДЛЯ ПЛОДОВО-ЯГОДНОГО ВИНОДЕЛИЯ..96
3.1.1. Скрининг и выделение новых рас дрожжей 96
3.1.2. Изучение бродильной активности наиболее активных штаммов дрожжей, выделенных с ягодных субстратов 106
3.1.2.1.Определение скорости и глубины сбраживания плодово-ягодных субстратов 107
3.1.2. 2. Накопление этанола 117
3.1.2. 3. Накопление ароматических веществ в готовых виноматериалах 121
3.2. СЕЛЕКЦИЯ НОВЫХ РАС ДРОЖЖЕЙ ДЛЯ СПИРТОВОГО ПРОИЗВОДСТВА 129
ГЛАВА 4. ВИДОВАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВАЖНЕЙШИХ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ РАС ДРОЖЖЕЙ РОДА SACCHAROMYCES 131
4.1. ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ РАС ДРОЖЖЕЙ 132
4.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАКСИМАЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУР РОСТА ДРОЖЖЕЙ 143
4.3. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РАС ДРОЖЖЕЙ 148
4.3.1. ПДРФ-анализ некодирующих участков рДНК 150
4.3.1.1. ЦДРФ-анализ амплифицированных 5.8S-ITS фрагментов рДНК 150
4.3.1.2. ПДРФ-анализ амплифицированных IGS2 фрагментов рДНК 151
4.3.2. Молекулярное кариотипирование 153
4.3.3. ПЦР с микросателлитным праймером (GTG)5 155
4.3.4. Молекулярно-биологический анализ дрожжей, выделенных с
поверхности ягод и из ферментационных процессов России, Белоруссии и Украины 159
4.3.4.1. Видовая идентификация штаммов 161
4.3.4.2. Внутривидовой полиморфизм дрожжей S. cerevisiae 163
4.3.4.3. Генетическая конституция гибридов S. cerevisiae х S. bayanus var. avarum 164
4.3.4.4. ПДРФ-анализ и секвенирование ядерного гена МЕТ2 165
4.3.4.5. Митохондриальный геном гибридных штаммов 167
4.4. ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ВИННЫХ ДРОЖЖЕЙ РОДА SACCHAROMYCES И ИХ СЕЛЕКЦИЯ 169
4.4.1. Дрожжи для получения красных виноградных вин 170
4.4.1.1. Бродильная активность дрожжей 170
4.4.1.2. Синтез ароматических веществ 173
4.4.1.3. Влияние на качественный и количественный состав органических кислот 180
4.4.1.4. Влияние дрожжей на накопление фенольных соединений при сбраживании сусла по красному способу 187
4.4.2. Дрожжи для получения белых виноградных вин 194
4.4.2Л. Бродильная активность дрожжей 194
4.4.2.2. Синтез ароматических веществ 197
4.4.2.3. Влияние на качественный и количественный состав органических кислот 203
4.4.2.4. Влияние на качественный и количественный состав фенольных соединений 208
4.4.3. Дрожжи для получения шампанских вин 211
4.4.4. Дрожжи для плодово-ягодного виноделия 213
4.4.4.1. Дрожжи для получения яблочных виноматериалов 213
4.4.4.2. Дрожжи для получения грушевых виноматериалов 227
4.4.4.3. Дрожжи для получения вишневых виноматериалов 237
4.4.4.4. Дрожжи для получения черничных виноматериалов 244
4.4.4.5. Дрожжи для получения голубичных виноматериалов 251
4.4.4.6. Дрожжи для получения черноплоднорябиновых виноматериалов 259
4.4.4.7. Дрожжи для получения черносмородиновых виноматериалов 266
4.4.4.8. Дрожжи для получения красносмородиновых виноматериалов 275
4.4.4.9. Дрожжи для получения брусничных виноматериалов.' 283
4.4.4.10. Дрожжи для получения клюквенных виноматериалов 291
4.4.4.11. Дрожжи для получения малиновых виноматериалов 298
4.4.4.12. Дрожжи для получения клубничных виноматериалов.. .. 306
ГЛАВА 5. ТЕХНОЛОГИЯ ПРЕПАРАТОВ ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ АЄД .314
5.1. ОПТИМАЛЬНЫЕ УСЛОВИЯ РОСТА ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ НА МЕЛАССЕ. 314
5.2. ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ПИТАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ В СРЕДЕ НА РОСТ ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ.. 315
5.3: ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА РОСТ ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ... ...317
5:4. ВЛИЯНИЕ рН СРЕДЫ НА НАКОПЛЕНИЕ БИОМАССЫ ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ РАС ДРОЖЖЕ 318
5:5: ПОЛУЧЕНИЕ ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ АСД ПРИ. КУЛЬТИВИРОВАНИИ ПЕРИОДИЧЕСКИМ СПОСОБОМ 319
5.5.1. Культивирование дрожжей; предназначенных для сушки: .319
5.5.2. Сушка шампанских дрожжей. 324
5.5.3. Результаты испытаний полученных препаратов. 326
5.6. ПОЛУЧЕНИЕ ШАМПАНСКИХ, ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ АСД ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ПРИТОЧНЫМ СПОСОБОМ. 328 .
5.6.1. Культивирование дрожжей приточным способом. 328
5.6.2. Сушка дрожжей, выращенных приточным способом. 333
5.6.3. Культивирование дрожжей при,непрерывной подаче азотистого и фосфорного питания. .342
5.6.4. Результаты промышленных испытаний. ..347
5.7. ИССЛЕДОВАНИЕ КАЧЕСТВА СУХИХ ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ 353
5.7.1. Исследование методов оценки жизнеспособности клеток в препаратах винных и спиртовых АСД 353
5.8. ПРИМЕНЕНИЕ СУХИХ ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ И ИХ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ 361
5.8.1. Разработка.методов высокоэффективной подготовки винных и спиртовых АСД. .3 61
5.8.1.1. Реактивация сухих винныхи спиртовых дрожжей: .361
5.8.1.2. Особенности реактивации сухих спиртовых дрожжей 364
5.8.1.3. Особенности подготовки шампанских АСД 372
5.8.2. Физиолого-биохимические особенности сухих винных и спиртовых дрожжей 381
ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ДРОЖЖЕЙ В ВИНОДЕЛИИ 385
6.1. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОГО
БИОКАТАЛИЗАТОРА НА ОСНОВЕ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В КРИОГЕЛЬ ПВС И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ХАРАКТЕРИСТИК 385
6.1.1. Выбор условий подготовки клеток дрожжей к иммобилизации 385
6.1.2. Разработка подходов к созданию, высокоэффективного биокатализатора на основе иммобилизованных клеток дрожжей 397
6.1.3. Исследование различных способов подавления роста клеток в процессе шампанизации вина при использовании иммобилизованных дрожжей 399
6.1.3.1. Оптимизация процесса формирования биокатализатора 402
6.1.4. Применение разработанного биокатализатора в процессе шампанизации вина и исследование свойств биокатализатора 410
6.1.4.1. Получение игристых вин бутылочным способом 410
6.1.4.2. Исследование возможности многократного использования биокатализатора на основе иммобилизованных клеток дрожжей в процессе бутылочной шампанизации вина 415
6.1.4.3. Получение шампанского резервуарным периодическим и непрерывным способом 416
6.1.5. Исследование свойств разработанного биокатализатора 420
6.1.5.1. Стабильность биокатализатора при хранении 420
6.1.5.2. Влияние формы биокатализатора на его метаболическую активность 424
6.1.6. Применение разработанного биокатализатора в технологии получения различных видов вин 425
6.1.6.1. Получение белых столовых вин при использовании свободных и иммобилизованных клеток дрожжей 425
6.1.6.2. Применение разработанного биокатализатора в технологии приготовления красных столовых вин 431
6.1.6.3. Применение иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей для устранения недобродов 435
6.1.6.4. Применение иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей для биологического кислотопонижения вин 436
ВЫВОДЫ 439
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 441
ПРИЛОЖЕНИЕ 468
- Систематика дрожжей рода SACCHAROMYCES MEYEN EX REESS
- Культивирование дрожжей в промышленных условиях
- Скрининг и выделение новых рас дрожжей
Введение к работе
Актуальность проблемы В условиях современного технически развитого общества, характеризующегося неблагоприятной экологической обстановкой, потребителей всё больше интересует, как питание может отразиться на их здоровье. Анализ информации о состоянии окружающей среды свидетельствует о том, что её загрязнение стало актуальной и очень сложной проблемой.
Несовершенство технологических процессов, отрицательное воздействие на окружающую среду привело к нерациональному использованию огромного количества сырья, изымаемого из природной среды и повышению себестоимости выпускаемой продукции в перерабатывающих отраслях АПК.
Разработка новых ресурсосберегающих технологий при использовании инновационных подходов, позволяющих увеличить объём производимой продукции при сохранении её высокого качества является актуальным решением современных задач всех отраслей пищевой промышленности, включая и винодельческое производство.
Повышение рентабельности производства и улучшение качества готовой продукции может быть обеспечено совершенствованием технологии использования дрожжей-сахаромицетов, играющих важнейшую роль в обеспечении ключевых биотехнологических процессов. В связи с этим огромный практический интерес представляет возможность создания новых активных препаративных форм сухих и иммобилизованных дрожжей, используемых уже за рубежом в ряде технологий. Эти формы дрожжей отличаются от традиционной дрожжевой разводки легкостью и удобством использования, максимальным проявлением всех положительных качеств, новыми ценными свойствами.
Промышленная технология получения таких новых форм дрожжей в России ещё не разработана, поэтому исследования, проводимые в этом направлении, важны, актуальны и представляют несомненный интерес для усовершенствования отечественных биотехнологий, например, в винодельческом и спиртовом производствах.
Создание активных сухих дрожжей (АСД), использование которых дает возможность в любой момент времени получать необходимое количество активно бродящих дрожжей является особенно актуальным, так как значительно облегчит работу заводов, как в сезон, так и в период их запуска. С другой стороны, использование сухих дрожжей ускорит процесс брожения, увеличит выход продукта и улучшит его качество.
В плодово-ягодном виноделии за рубежом практически отсутствуют технологии АСД, а рекомендуемые для этой цели универсальные препараты не пригодны. В России за последние 20-30 лет вообще не проводились работы по выделению и изучению рас дрожжей для производства плодовых вин.
Создание и организация производства высокоэффективных препаратов сухих дрожжей на основе отбора лучших отечественных рас дрожжей по их важнейшим физиологическим и биохимическим признакам, приспособленных к местным условиям и формирующим привычный вкус и аромат готового вина, является важной, актуальной и своевременной проблемой, выходом из создавшегося положения.
Помимо препаратов АСД немаловажное значение имеет и использование иммобилизованных дрожжей (ИД). Сейчас их применение пока ограничено, но создание и использование ИД позволяет решать серьёзные и уникальные задачи, такие, как ликвидация процесса ремюажа в шампанском производстве, интенсификация брожения за счёт создания сверхвысоких концентраций дрожжей в сусле или виноматериале, биологическое кислотопонижение вин, устранение недобродов, значительное улучшение органолептических показателей готовых вин.
Эффективных решений по использованию ИД в виноделии пока нет, хотя и встречаются некоторые данные по этому вопросу в зарубежной и отечественной литературе, поэтому актуальным является поиск такого носителя, для иммобилизации, который был прочным, обладал хорошими массообменными характеристиками, был бы инертен для вина и исключал бы выход дрожжей в вино в период брожения.
Использование АСД и ИД, безусловно, даёт возможность получения большого экономического эффекта для многих производств, основанных на биотехнологии дрожжей рода Sacharomyces. Научное обоснование биотехнологических процессов получения ИД и АСД позволит не только повысить эффективность бродильных производств, но и внести весомый научный вклад в развитие биотехнологической промышленности.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в разработке теоретических и экспериментальных основ создания высокоэффективных препаратов активных сухих и иммобилизованных форм отечественных винных и спиртовых рас дрожжей рода Saccharomyces. В задачи исследования входило:
- на основе селекционных работ осуществление скрининга активных рас винных
дрожжей по их бродильной активности, ароматическим и другим технологически
важным физиолого-биохимическим особенностям;
изучение основных культуральных, морфологических, физиолого-биохимических, биохимических и технологических свойств отобранных штаммов;
улучшение морфолого-физиологических, молекулярно-биологических, биохимических и технологических свойств селекционированных рас дрожжей;
отбор рас дрожжей, наиболее устойчивых к сохранению бродильной активности, на основе которых возможно создание наиболее эффективных препаратов АСД и ИД для производства спирта, шампанских вин, белых и красных виноградных вин, сортовых плодовых вин повышенного качества, устранения недобродов;
создание биотехнологии винных и спиртовых АСД и ИД;
разработка способов подавления выхода иммобилизованных клеток дрожжей во время брожения из матрицы носителя для повышения эффективности их действия;
разработка научных основ и технологии применения АСД и ИД в виноделии и спиртовом производстве;
разработка эффективных способов реактивации и подготовки к брожению препаратов АСД и ИД;
проведение промышленных испытаний созданных препаратов АСД и ИД на заводах отечественной винодельческой и спиртовой промышленностей; Рассматриваемые проблемы решались в соответствии с программой «Биотехнология» УНЦ РХТУ им. Менделеева «Влияние экологических факторов на качество пищевых продуктов и пищевых добавок на основе микробного синтеза и разработка более совершенных стандартов контроля качества этих продуктов»; с
Межведомственной инновационной программой «Биотехнология для медицины и агропромышленного комплекса»; программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники»; проекта «Новые эффективные биотехнологические процессы микробного синтеза ферментов, антибиотиков, белково-жировых кормовых компонентов и других биологически активных соединений» предложенного ВНИИ Биотехнологии; программы Министерства образования РФ «Университеты России»; Федеральной целевой программы «Интеграция науки и высшего образования России».
Научная новизна работы. В представленной диссертационной работе разработаны биотехнологические основы высокоэффективных препаративных форм дрожжей рода Sacharomyces, при этом теоретически обосновано и экспериментально установлено и доказано:
на основе многоступенчатой селекции и новых экспериментальных данных по результатам сравнительных исследований выделенных штаммов дрожжей S. cerevisiae показана перспективность 13 рас дрожжей, из которых 5 физиологически активных рас обладают высокой биосинтетической способностью по отношению к этанолу и наиболее важным метаболитам, характериным для плодово-ягодного виноделия;
с использованием современных методов анализа изучены морфологические, физиологические, биохимические и молекулярно-биологические особенности 62 важнейших отечественных селекционированных рас винных и спиртовых дрожжей, установлена их принадлежность к одному биологическому виду S. cerevisiae, различающихся между собой по ряду признаков, обозначенных в определителе как вариабельные;
впервые обнаружено 5 межвидовых гибридов дрожжей S.cerevisiae х S. bay anus var.uvarum, построено генеалогическое древо штаммов изученных дрожжей;
получены новые экспериментальные данные и подобраны условия сепарации и обезвоживания дрожжей на сушилке кипящего слоя, позволяющие сохранить до 90% живых клеток, подобрана оптимальная композиция стабилизаторов для обезвоживания дрожжей;
на основе установленных закономерностей впервые научно обоснована и разработана биотехнология подготовки сухих дрожжей к брожению, позволяющая сократить лаг-фазу развития дрожжевых клеток, интенсифицировать процесс брожения при одновременном улучшении качества продукта;
исследованы культуральные и технологические свойства сухих винных и спиртовых дрожжей, определены их физиолого-биохимические параметры, используя различные методы оценки качества и хранения препаратов АСД;
- разработаны методы подготовки и хранения биокатализаторов к брожению для
ИД;
иследованы способы иммобилизации дрожжей, свойства и характеристики возможных носителей, свойства иммобилизованных дрожжей;
впервые разработаны способы подавления выхода клеток иммобилизованных дрожжей в вино во время брожения.
Практическая значимость работы. Проведенные исследования явились основой для создания биотехнологии новых высокоэффективных препаратов активных сухих и иммобилизованных форм отечественных винных и спиртовых рас дролокей рода Saccharomyces, усовершенствования отечественной технологии винодельческого и спиртового производства. Использование сухих и
иммобилизованных дрожжей позволяет ускорить процесс брожения, увеличить выход и улучшить качество готового продукта. Наряду с получением ценных продуктов, автором решены следующие ключевые вопросы:
селекционированы и запатентованы две новые высокоэффективные расы дрожжей-сахаромицетов для производства спирта и направлены на патентование 5 рас для производства плодовых вин;
разработана и запатентована новая высокопроизводительная и экономичная технология винных и спиртовых АСД, обеспечивающая получение продукции высокого качества;
составлены ТИ и ТУ технологии винных и спиртовых дрожжей;
разработана технология применения винных и спиртовых АСД, позволяющая значительно повысить эффективность данных препаратов;
представленная технология успешно апробирована на Московском дрожжевом заводе, наработаны опытные партии перспективных рас дрожжей;
подобраны условия реактивации АСД, позволяющие сохранить лаг-фазу развития сухих дрожжей, увеличить процент реактивируемых клеток на 10-15 % даже в неблагоприятных условиях, сократить время подготовки к брожению для шампанских АСД до 2-3 часов;
определены факторы ингибирования АСД во время их хранения, а также реактивации и брожения, и изучен механизм их действия;
подобраны наиболее перспективные флуорохромные красители для экспресс-контроля качества АСД с помощью люминисцентной микроскопии, сопряженной с компьютерным анализом изображений;
разработана и запатентована технология ИД для виноделия на основе криогеля ПВС;
- проведены заводские испытания препаратов АСД и ИД и получены
положительные результаты при использовании на винзаводах: ОАО Агрофирма
«Южная» (Краснодарский край), ОАО АПФ «Фанагория» (Краснодарский край),
ОАО «Миллеровский винзавод» (Ростовская обл.), ОАО «Игристые Вина» (г.
Санкт-Петербург), и спиртзаводе ЗАО «Алтайросспиртпром» (г. Бийск, Алтайский
край);
- проведены заводские испытания препаратов ИД при получении шампанских вин
бутылочным способом на ОАО АПФ «Фанагория» (Краснодарский край).
Разработанные в результате исследований технологии винных и спиртовых АСД и ИД способствуют созданию высокоэффективной технологии шампанских, белых и красных виноградных вин, плодовых вин и технологии спирта.
Результаты исследований по селекции при отборе наиболее продуктивных рас дрожжей, обладающих более ценными свойствами, и изучению ключевых физиолого-биохимических, технологических и молекулярно-биологических особенностей важнейших рас дрожжей рода Saccharomyces, будут востребованы при использовании последних в отечественной винодельческой и спиртовой промышленностях.
Разработанные в результате исследования технологии новых высокоэффективных препаратов сухих и иммобилизованных дрожжей позволят значительно упростить технологию дрожжей на заводах, облегчая и ускоряя работу заводов, как в сезон, так и в период запуска, интенсифицировать процесс брожения, увеличат выход продукта и улучшат его качество.
Теоретические и прикладные положения работы нашли конкретное воплощение при формировании курса лекций и проведении практических занятий в Московском Государственном Университете пищевых производств, изложены в методических указаниях для студентов высших учебных заведений по специальности «Биотехнология» и «Технология виноделия», в монографии «Современные препаративные формы дрожжей для виноделия», курсовых и дипломных проектах и работах, а также на многих предприятиях винодельческого и спиртового производства.
Значимость работы подтверждена проведением заводских испытаний новых препаратов АСД и ИД на винодельческих и спиртовых заводах России, дипломами 1-ой степени по номинации «Биопрепараты и биологически активные добавки» на выставке-конкурсе Министерства образования РФ, Министерства промышленности, науки и технологий РФ, МГУПП, Золотой медалью агропромышленной выставки «Золотая осень-2008».
Основные положения, выносимые на защиту: теоретические положения систематики, генетических особенностей и идентификации дрожжей рода Saccharomyces, критерии отбора важнейших винных и спиртовых дрожжей для получения препаратов АСД и ИД;
- селекционированные расы винных и спиртовых дрожжей, их морфолого-
физиологические, молекулярно-биологические, биохимические и технологические
особенности;
теоретическое и экспериментальное обоснование биотехнологии препаративных форм винных и спиртовых АСД и ИД;
способ подавления выхода клеток иммобилизованных дрожжей в вино во время брожения;
технологии применения АСД и ИД в виноделии и спиртовом производстве;
эффективные способы реактивации и подготовки к брожению АСД и ИД;
- промышленные испытания новых препаратов АСД и ИД на заводах
отечественной винодельческой и спиртовой промышленностей.
Личный вклад автора. Автором на основе анализа научно-технической и патентной литературы теоретически обосновано направление исследований, сформулированы цель и задачи, разработана методология проведения исследований.
Автор лично планировал, организовывал проведение всех испытаний и внедрений, а также обобщал полученные результаты.
Под его руководством и при непосредственном участии определены критерии отбора важнейших винных и спиртовых дрожжей-сахаромицетов, получения препаратов АСД и ИД для винодельческого и спиртового производств; исследованы и определены расы дрожжей для создания новых наиболее эффективных препаратов АСД и ИД для шампанских вин, белых и красных виноградных вин, производства спирта и сортовых плодовых вин; установлены морфолого-физиологические, молекулярно-биологические, биохимические и технологические особенности селекционированных дрожжей.
Автором теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены биотехнологии винных и спиртовых АСД и ИД; под его непосредственным руководством и участии разработаны способы подавления выхода клеток иммобилизованных дрожжей во время брожения; технологии применения АСД и
ИД в виноделии и спиртовом производстве, а также эффективные способы реактивации и подготовки к брожению АСД и ИД.
С участием автора и специалистов заводов проведены промышленные испытания новых препаратов АСД и ИД на заводах отечественной винодельческой и спиртовой промышленностей.
Личное участие автора подтверждается научно-технической и патентной документацией, актами промышленных испытаний.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на российских и международных научно-технических конференциях и симпозиумах: «Пища. Экология. Человек» (МГУ 1111, май, 1999); «Молодые ученые - пищевым и перерабатывающим отраслям АПК (технологические аспекты производства)» (МГУПП, декабрь, 1999; декабрь 2000); «Biocatalysis-2000: Fundamentals and applications» (Moscow, MSU, 10-15 June, 2000); «Химия и биотехнология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых ресурсов» (Москва, РХТУ, сентябрь, 2000); «Bioencapsulation in Biomedical, Biotechnological and Industrial Applications» (Warsaw, 11-13 May, 2001); «Качество, безопасность и экология пищевых продуктов и производств. Прогресс в агроиндустрии» (Ялта, 21-25 мая 2001 г.); «Научно-технический прогресс в спиртовой и ликеро-водочной отрасли промышленности» (Москва, 19-20 апреля 2001 г); «Катализ в биотехнологии, химии и химических технологиях» (Тверь, 2002 г); «Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Тверь, 2002 г.); «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003 г); «Высокоэффективные пищевые технологии и технические средства для их реализации» (Москва, 2003); «Прогрессивные технологии и современное оборудование - важнейшие составляющие успеха экономического развития предприятий спиртовой и ликеро-водочной промышленности» (Москва, 23-24 апреля 2003 г); «Экологической науке - творчество молодых» (Гомель, 2003); «Биотехнология: состояние и перспективы развития», (Москва, 14-18 марта, 2005); «9-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых» (Пущино, 18-22 апреля, 2005); XXII International Conference on Yeast Genetic and Molecular Biology (Bratislava, 7-12 August 2005); «10-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых» (Пущино, 18-22 апреля, 2006); XXV International Specialized Symposium on Yeasts ISSY-25 (Helsinki, 2006); International Congress on Bioprocessing in Food Production (18-21 June 2006, Patras, Greece, 2006), международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты». Минск. 2008.
По материалам выполненных исследований опубликовано 66 работ, общим объёмом 54 печатных листов, в том числе 38 - в центральных изданиях, получено 6 патентов РФ, опубликована 1 монография.
Объем и структура работы. Диссертация* изложена на 485 страницах, включающих 138 таблиц, 134 рисунка и состоит из введения, обзора, литературы, объектов и методов исследований, 4 глав собственных исследований, выводов, списка литературы, включающего 435 источников, в том числе 267 иностранных, и приложения.
Систематика дрожжей рода SACCHAROMYCES MEYEN EX REESS
Наибольшее практическое значение в виноделии и спиртовом производстве, имеют дрожжи рода Saccharomyces. К ним относят дрожжи с различной формой клеток, чаще круглой, овальной или удлиненной. Они располагаются поодиночке, парами или короткими цепочками, размеры клеток сильно варьируют: от (1.5-2.5) (3.0-10.0) до (5.5-10.0) (10.0-20.0) мкм, может быть примитивный псевдомицелий, истинного мицелия нет, колонии обычно пастообразные, на жидких средах при продолжительном культивировании может образовываться пленка. Морфология может меняться в зависимости от состава питательного субстрата, с возрастом и под влиянием ингибирующих факторов. Размножаются дрожжи как вегетативным (многостороннее почкование), так и половым путем. Аски образуются преимущественно из вегетативных диплоидных клеток без непосредственно предшествующей конъюгации. При созревании спор сумки не вскрываются. Аскоспоры круглые или слабоовальные, бесцветные, гладкие, 1-4 в аске. Для всех видов дрожжей Saccharomyces характерно активное сбраживание Сахаров с образованием этанола. Они не ассимилируют нитраты, лактозу и высшие парафины [Vaughan-Martini, 1998, Бабьева И., Чернов И., 2000]
Систематика дрожжей Saccharomyces многократно пересматривалась, и в разных определителях число видов, входящих в род Saccharomyces сильно варьирует. Хотя характерная почкующаяся форма дрожжей была зафиксирована еще Ван Левенгуком в 1680 году, более детальное описание и идентификация дрожжей продолжали оставаться сложной задачей, поскольку у вегетативных форм большинства дрожжей нет каких-либо характерных морфологических особенностей и их нелегко идентифицировать путем обычного визуального наблюдения.
Половые споры у дрожжей были обнаружены в 1837 году Шванном, но только в 1870 году, после того как Reess описал образование дрожжами спор, к роду Saccharomyces стали причислять исключительно те дрожжи, которые образуют споры. В род этих дрожжей Reess включил все аскомицетовые дрожжи, не образующие истинный мицелий, размножающиеся почкованием и образующие аски с 1-4 аскоспорами [Barnett, 1992]. Согласно его классификации, пивные дрожжи по-прежнему назывались S.cerevisiae, а дрожжи, сбраживающие фруктовые соки, получили название S.ellipsoideus.
Позднее Hansen, придерживаясь этой классификации сахаромицетов, отнес к виду S.cerevisiae все пивные дрожжи верхового брожения, а дрожжи низового брожения назвал S.carlsbergensis.
Позже Stelling-Dekker [Stelling-Dekker, 1931], исследуя аспорогенные дрожжи, в своей монографии к роду Saccharomyces относит 23 вида, включая и вид S.fragilis, отличительной особенностью которого является образование бобововидных аскоспор. В этой работе вид S.ellipsoideus рассматривается как разновидность или синоним вида S.cerevisiae, т.к. разница между ними заключается в небольшом отличии по форме и размерам вегетативных клеток. По Stelling-Dekker дрожжи рода Saccharomyces отличают круглые, овальные, иногда удлиненные клетки, часто объединенные в короткие цепочки, размножающиеся вегетативно многосторонним почкованием. Аски, образующиеся после конъюгации, содержат круглые или овальные аскоспоры, которые обычно прорастают после предварительной конъюгации. Все виды активно сбраживают D-глюкозу, D-фруктозу, D-маннозу и другие сахара, не утилизируют нитраты. Род Saccharomyces был разделен на два подрода: Saccharomyces и Zygosaccharomyces. Отличительной особенностью зигосахаромицетов была непременная конъюгация, предшествовавшая образованию аскоспор.
В связи с выходом первого определителя дрожжей под редакцией Lodder в 1952 году произошли изменения в систематике дрожжей рода Saccharomyces. Автор совместно с Kreger-van-Rij объединил в род Saccharomyces не только около 20 представителей Zygosaccharomyces по классификации Stelling-Dekker, но и ещё 3 вида Torulaspora binder и типовые культуры рода Debaryomyces klocker. Теперь численность сахаромицетов возросла до 30 биологических видов.
Однако не все таксономисты согласились с предложенной Lodder классификацией. Кудрявцев В.И. [Кудрявцев В., 1954], например, включает в род Saccharomyces только диплоидные дрожжи, выделяя гаплоидные виды в Zygosaccharomyces, а виды с автогамным половым процессом в род Debaryomyces. Кроме того, дрожжи, сбраживающие лактозу, местообитанием которых являются молочные продукты, автор выделяет в отдельный род - Fabospora.
В 1970 году Lodder [Lodder, 1970] опубликовал второе издание своего определителя. Ван дер Вальт [Van der Walt, 1970] увеличил количество видов Saccharomyces до 41, среди которых есть диплоидные, гаплоидные и виды с соматогамной автогамией. Так в определителе к синонимам S.cerevisiae теперь относят вид S.willianus; S.carlsbergensis и S.logos и считаются синонимами вида S.uvarum, а вид S.oviformis Osterwalder рассматривается как синоним вида S.bayanus.
Красильников Н.А. [Красильников Н., 1954] рассматривает виды, объединенные у Ван дер Вальта в род Saccharomyces, как и рода Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Torulaspora. Такое деление на роды с изменением в составе видов было поддержано в дальнейших исследованиях [Агх, 1977].
Согласно Yarrow [Yarrow, 1984] в роде Saccharomyces оставлено 5 видов с преимущественно диплоидной вегетативной фазой: S.cerevisiae, S.kluyven, S.exiguous, S.dairensis, S.servazii, а описанный вид Kazachstania viticjla Zub рассматривался Зубковой [Зубкова, 1971], как синоним S.dairensis Naganishi [Arx, 1977].
Культивирование дрожжей в промышленных условиях
В процессе культивирования непрерывно регистрировались температура и рН среды культивирования, подача воздуха и источника углерода (меласса). Каждый час измерялись методами, принятыми в дрожжевом производстве, следующие параметры [Меледина, 2002]:
- концентрация (накопление) дрожжей в культуральной жидкости весовым методом (выделением на фильтрах до влажности 70-75% под вакуумом);
- формольное число - формольным титрованием;
- количество почкующихся клеток дрожжей - визуально микроскопированием; количество клеток посторонних микроорганизмов - визуально микроскопированием.
Анализ мелассы проводили методами, изложенными в [Новаковская С, 1990; Никифорова Т., 1995; Сапронова Л., 2000; Мушникова Л., 2001]. Определение концентрации сухих веществ - рефрактометрическим методом. Определение содержания сахарозы - методом прямой поляризации. Определение активной кислотности (рН) - рН-метром. Определение содержания азота в мелассе - методом Кьельдаля.
Расчет показателей роста культуры и потребления субстрата проводили по методикам, описанным в книгах Новаковской и Reed [Новаковская, 1990; Reed, 1991]. Наиболее важной характеристикой процессов культивирования является параметр, определяющий скорость роста биомассы. В дрожжевом производстве, в качестве подобного параметра, наиболее часто используют удельную скорость роста (ц.) . Она рассчитывается по уравнению: где А - содержание дрожжей в конце цикла, кг; Р - начальное содержание (засев), кг; т - длительность процесса, ч.
Существенным показателем физиологического состояния культуры является экономический коэффициент. Он показывает, какая доля использованного субстрата превращается в биомассу дрожжей. В практике производства дрожжей в качестве экономического коэффициента используют так называемый выход дрожжей (В) [Тулякова Т.,1985 1986; Mallouchous А.,2003], который рассчитывают по уравнению:
В = Д-]00/М, где Д - количество полученных дрожжей, кг; М - израсходованное количество мелассы за вычетом остатка в незавершенном производстве, пересчитанное на содержание сахара 46% (М4е), кг.
В расчете в соответствии со стандартом предусматривали содержание СВ в дрожжах 25%.
Отделение дрожжевой биомассы от среды культивирования проводили центрифугированием, число оборотов не превышало 2000 об/мин, время центрифугирования 7-10 мин. Полученную биомассу дважды промывали стерильной водопроводной водой и концентрировали фильтрованием до влажности 70-75% под вакуумом, а затем гранулировали (размер гранул 0,8-1 мм) и отправляли на сушку, Сушку проводили на сушилке с кипящим слоем, марки Aeromatik (Германия).
Скрининг и выделение новых рас дрожжей
В настоящее время большое промышленное значение приобретает развитие плодово-ягодного виноделия, которое практически перестало существовать в период перестройки и в первые годы после неё.
Известно, что плодово-ягодные вина, пищевая ценность которых обусловлена содержанием в них углеводов, органических кислот, полифенолов, минеральных веществ и витаминов, представляют собой богатые витаминами и легко усвояемые продукты питания и имеют большое значение как в России,, так и за рубежом.
Важнейшими факторами, определяющими качество готового вина, являются плодово-ягодное сырье, которое различается по химическому составу и технологическим особенностям и содержит различное количество Сахаров, кислот, фенольных соединений, пектинов и других, важных в технологическом отношении, компонентов, а также дрожжи, их бродильные, ароматические и другие физиолого-биохимические свойства, определяющие эффективность процесса брожения.
Систематика дрожжей, поиск их места в общей системе продолжают активно развиваться, и в этой области ещё не выработано устоявшихся, стабильных представлений. Со временем первых описаний сахаромицетов пройден большой путь, основные этапы которого отражены в серии определителей голландской зимологической школы, которые выходят через каждые 10-20 лет Поиск и выделение новых высокоактивных штаммов дрожжей, относящихся к роду Saccharomyces, необходимы для обеспечения чистоты процесса брожения, полного сбраживания Сахаров сусла и возможности управления качеством вина.
Целью данного исследования является создание новых форм дрожжей для плодово-ягодного виноделия, отличающихся легкостью и удобством применения, возможностью максимального проявления всех их положительных качеств, придание им новых ценных свойств, используемых в производстве. 3.1.1. Скрининг и выделение новых рас дрожжей
С целью создания новых форм дрожжей для плодово-ягодного виноделия был проведен скрининг 481 штамма дрожжей, относящихся к роду Saccharomyces, выделенных при исследовании дрожжевой микрофлоры плодов и ягод в Западной Белоруссии. Критерием бродильной активности дрожжей было выделение углекислого газа при сбраживании яблочного сока с РВ равным 6%, определяемого по окончании брожения весовым методом.
Похожие диссертации на Разработка технологии получения хитиновых олигосахаридов и применения их для интенсификации процессов культивирования дрожжей
