Содержание к диссертации
Введение
I. Литературный обзор 8
1.1 Способы получения аденозинфосфатов 8
1.2 Биотрансформация аденозина до аденозинфосфатов 11
1.3 Механизмы биотрансформации аденозина до аденозинфосфатов. 13
1.4 Факторы, определяющие характер и степень биотрансформации аденозина в аденозинфосфаты. 17
1.5 Состав и структура клеточных мембран 18
1.6 Примеры использования микроорганизмов с измененной клеточной проницаемостью. 20
1.7 Механизм воздействия толуола на клеточные мембраны 21
1.8 Степень воздействия толуола на микроорганизмы. 22
1.9 Практическое применение биотрансформации аденозина до аденозинфосфатов 26
1.9.1 Использование иммобилизованных клеток для проведения биотрансформаций. 32
II. Материалы и методы 42
III. Экспериментальная часть 50
3.1 Методы повышения проницаемости клеточных мембран 50
3.2 Фосфорилирование на уровне субстрата 52
3.3 Определение оптимального времени воздействия толуола на клетки дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae при иотрансформации аденозина до аденозинфосфатов. 54
3.4 Оценка жизнеспособности клеток дрожжей, обработанных толуолом. 56
3.5 Изучение кинетики роста клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, обработанных различными концентрациями толуола. 58
3.5.1 Кинетические характеристики роста клеток дрожжей, подвергнутых воздействию толуола на начальной стадии роста . 59
3.5.2 Кинетические характеристики роста клеток дрожжей, подвергнутых воздействию толуола в активной фазе роста. 65
3.6 Изучение ферментативной активности клеток дрожжей, обработанных различными концентрациями толуола. 69
3.7 Определение степени влияния воздействия толуола на ферментные системы дрожжей. 75
3.8 Оценка способности к самовоспроизводству клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, после воздействия на них толуола. 78
3.9 Биотрансформация аденозина в АТФ, АДФ и АМФ дрожжами Saccharomyces cerevisiae SL-100 в процессе их роста. 80
3.9.1 Биотрансформация аденозина в АТФ, АДФ и АМФ клетками дрожжей без внесения толуола. 81
3.92 Кинетика накопления АТФ в культуральной жидкости 83
3.93 Кинетика накопления АДФ в культуральной жидкости 84
3.94 Кинетика накопления АМФ в культуральной жидкости 85
4. Использование иммобилизованных клеток дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae для процесса биотрансформации аденозина до аденозинфосфатов 91
4.1 Определение метаболической активности иммобилизованных клеток дрожжей 92
4.2 Влияние количества клеток внутри гранул геля на метаболическую активность. 94
4.3 Определение метаболической активности иммобилизованных клеток дрожжей в трех циклах. 95
4.31 Метаболическая активность иммобилизованных клеток в первом цикле. 96
4.32 Метаболическая активность иммобилизованных клеток во втором цикле. 97
4.33 Метаболическая активность иммобилизованных клеток в третьем цикле . 99
4.4 Изучение влияния концентрации субстрата на метаболическую активность иммобилизованных клеток дрожжей. 104
4.5 Изучение влияния толуола на метаболическую активность иммобилизованных клеток дрожжей. 106
5. Биосинтез аденозинфосфатов из аденозина иммобилизованными клетками дрожжей 109
5.1 Использование иммобилизованных клеток дрожжей для многократного применения в процессе биотрансформации аденозина до аденозинфосфатов. 110
5.2 Три серии биотрансформации аденозина в аденозинфосфаты. 111
5.3 Трехцикловая биотрансформация аденозина в аденозинфосфаты с подращиванием иммобилизованных клеток после каждого цикла 113
5.4 Трехцикловая биотрансформация аденозина в аденозинфосфаты с подращиванием и обработкой толуолом иммобилизованных клеток после каждого цикла . 114
IV. Выводы 117
V. Список литературы 119
Приложение №1 129
- Практическое применение биотрансформации аденозина до аденозинфосфатов
- Кинетические характеристики роста клеток дрожжей, подвергнутых воздействию толуола на начальной стадии роста
- Метаболическая активность иммобилизованных клеток в третьем цикле
- Трехцикловая биотрансформация аденозина в аденозинфосфаты с подращиванием и обработкой толуолом иммобилизованных клеток после каждого цикла
Практическое применение биотрансформации аденозина до аденозинфосфатов
Большое внимание изучению процесса биотрансформации проявили ученые из Латвии. Так авторы [47] установили, что при массовом соотношении сахарозы к аденозину в 2:1 степень фосфорилирования достигает 97%. Увеличение этого соотношения ведет к снижению выхода АТФ до 69% за счет расхода его на фосфорилирование глюкозы и фруктозы, образующихся при гидролизе сахарозы. При изучении этими же авторами [48] степени фосфорилирования от рН среды было установлено, что оптимальное значение данного параметра находится в интервале 6.9 - 7.0, при котором выход оказывается 90%) и выше. При рН более 7.0 отмечено значительное увеличение выхода АДФ (до 30% ) за счет сдвига в оптимум действия Mg-зависимой АТФ-азы (рН 7.5). В ходе фосфорилирования аденозина наблюдали изменение рН до 6.1 - 6.3, затем 6.5 - 6.85, что вело к увеличению выхода АТФ. Авторы объясняют снижение рН в начале процесса образованием кислых продуктов в среде за реакций гликолиза, окисления на уровне субстрата и реакций трансфосфорилирования, протекающих под действием ферментов дрожжей. Авторами предложено использовать изменение рН в качестве метода контроля за процессом в работе полупромышленной установки [49]. По мнению тех же авторов, не требуется поддерживать значение рН среды постоянным. Это не имеет решающего значения для выхода АТФ, поскольку в ходе фосфорилирования значение рН устанавливается близким к оптимальному для синтеза данного продукта.
Авторы [50] создали опытную установку по промышленному получению АТФ. В реактор вносили 18 литров деминерализованной воды и 500 граммов аденозина. К раствору добавляли 2170 г Na2HP04xl2H20, 504 г КН2Р04, 36 г КС1, 1 кг сахарозы, 56 г , MgCl2x6H20, 36 литров пивных дрожжей и 750 мл толуола. рН был установлен в значении 7.0. Температура была определена 37 градусов по Цельсию. За ходом реакции следили по изменению рН. Общее время фосфорилирования составило 3 часа. Процесс был остановлен добавлением ледяной уксусной кислоты до значения рН 4.5 и охлаждением до температуры 4 градуса по Цельсию. После фильтрации дрожжевого шлама фильтрата разбавляли 4-5 кратным объемом деминерализованной воды. Полученный раствор с рН 4.6 направляли в колонну с соотношением диаметра к высоте 1:4, содержащую 2.8 кг анионита АРА-5П, на котором проводили сорбцию аденозинфосфатов. После сорбции колонну промывали 50 литрами воды и 0.004н раствором соляной кислоты, затем элюировали АДФ в смеси с АМФ 0.02н раствором NaCl в 0.01н растворе НС1. АТФ десорбировали 0.5н раствором NaCl в 0.02н растворе НС1 и осаждали, смешивая элюат с 10-ти кратным объемом этилового спирта. Осадок фильтровали, растворяли в 7 литрах деминерализованной воды, добавляли 65 г NaCl, устанавливали рН 1.8 добавлением раствора соляной кислоты и затем смешивали с 7л этилового спирта. Образовавшийся осадок представлял собой динатривую соль АТФ. Выход продукта составил 680 г, чистота 98%.
С целью повышения выхода целевого продукта (АТФ или 1,6-дифосфата фруктозы) и облегчения управления направленным синтезом, в процессе фосфорилирования аденозина в тех же условиях, что рассмотрены выше, при достижении значения рН 6.50 - 6.55, авторы [49] предложили дополнительно вносить пивные дрожжи в количестве 1/6 объема среды. При этом удается увеличить степень фосфорилирования с 72 до 98%.
Недостатком вышеописанного способа авторы [51] считают высокий расход исходного сырья, так как АМФ и АДФ считаются отходами сырья. Для преодоления этого недостатка было предложено следующее решение: из подкисленного до рН 4.5 - 4.8 ферментализата, свободного от дрожжевого шлама, АМФ и АДФ сначала адсорбируют на сильноосновном анионите АРА-5П, затем элюируют с сорбента 0.02н раствором NaCl в 0.01 НС1, повторно адсорбируют на вышеуказанном анионите, концентрируют аденозинфосфаты до 2 - 3% в процессе десорбции раствором, содержащем 0.14 - 0.16н КС1, 0.04 - О.Обн MgCl2 в 0.05 - 0.1н растворе НС1. Полученный концентрат используют [52] как источник аденозина, ионов калия и магния.
При подготовке среды фосфорилирования недостаток этого способа состоит в том, что процесс фосфорилирования аденозина возможно проводить только клетками пивных дрожжей лишь определенных генераций. Например, авторы [53] указывают, что высокие выходы АДФ и АМФ наблюдали только при использовании дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae 4-6 генерации роста в течение летнего сезона работы Рижского пивного завода "Varpa". В таких клетках отмечали наиболее высокую активность ферментов: Mg-зависимых АТФ-азы, гексокиназы и кислой фосфатазы.
Авторы [54] заостряют внимание на активности АТФ-азы. Чем меньше в клетках свободной глюкозы, тем ниже скорость гликолиза, а это ведет к выключению ключевого фермента гликолиза фосфофруктокиназы и, следовательно, к снижению выхода фруктозо-1,6-дифосфата, а в дальнейшем и фосфоенолпирувата. Последнее активирует АТФ-азу. Этот вывод подтверждают результаты работы [55], где свежевыделенные митохондрии содержали значительное количество АДФ. После удаление из них АДФ, фософенолпирувата с пируваткиназой, наблюдали увеличение активности АТФ-азы в 4 - 5 раз.
То, что клетки пивных дрожжей, используемые при фосфорилировании аденозина до аденозинфосфатов, являются живыми, где работают ферменты гликолиза и окислительного фосфорилирования, подтверждают авторы [56]. Ими было исследовано образование Ко А пекарскими дрожжами из пантотеновой кислоты и цистеина. Было показано, что КоА накапливается в среде до 200 /мл в присутствии АТФ-генерирующей системы и не образуется в отсутствие фосфорилирования АМФ в АТФ.
Влияние концентрации глюкозы на процесс биотрансформации аденозина до аденозинфосфатов рассматривался многими авторами. Например, в работах [57, 58] утверждается, что в среде, содержащей аденозин, неорганический фосфат, фосфаты Сахаров, сухие дрожжи или дрожжевой автол изат, толуол, Mg+, образуется АТФ и АДФ. Добавление глюкозы в среду приводит к тому, что АТФ превращается в АДФ и АМФ.
Авторы [58] предложили способ получения АДФ фосфорилированием аденозина неорганическим фосфатом в присутствии пивных дрожжей. Реакционную смесь, содержащую в г/л; аденозин - 7.3, ацетальдегид -1.3, дрожжи - 300 и глюкозу - 4.2, а также в (М): КН2Р04 - 0.018, Na2HP04x7H20 - 0.063, и 3% толуола, выдерживали в течение 2 часов при 38 градусов по Цельсию. Затем добавляли глюкозу в концентрации до 10 г/л и через 4 минуты процесс заканчивали. После отделения клеток дрожжей, полученный супернантант концентрировали в 5 раз и добавляли 4 объема метанола. После отделения осадка и растворения его воде при рН 7.3, из полученного раствора с помощью анионообменника получали с высоким выходом очищенный (98.5%) препарат натриевой соли АДФ.
Известно, что на выход АДФ большое влияние оказывает активность миокиназы [59]. Этот фермент ингибируется хлоридами калия, натрия, магния при ионной силе раствора выше 0.6. В то же время присутствие магния увеличивает скорость диспропорционирования АДФ.
Авторы [60] описывают способ получения АТФ, где в качестве субстрата используется аденозин, АМФ или АДФ. Они вовлекаются в процесс фосфорилирования при внесении непромытых прессованных интактных клеток дрожжей в среду, содержащую все известные компоненты. Через 6 часов ферментолиза все вышеуказанные субстраты превращаются с высоким выходом в АТФ.
Не менее интересен другой способ получения АТФ [61] с использованием пивных дрожжей, содержащих активную аденилаткиназу, превращающую АМФ в АТФ в среде, содержащей 10% глюкозы, 3% КН2Р04, 0.5% MgCl2x6H20 и 36% дрожжей. Степень превращения составила более 80%. При температуре 4 градуса по Цельсию ферментная система сохраняла активность в течение 21 дня. Она могла также использоваться для получения из соответствующих субстратов ЦТФ и ГТФ, однако, выход этих продуктов был намного ниже, чем АТФ.
Кинетические характеристики роста клеток дрожжей, подвергнутых воздействию толуола на начальной стадии роста
График 2 один показывает кривые накопления биомассы в зависимости от времени. Толуол вносился в начальной стадии роста микроорганизмов. Как видно из графика 2 рост микроорганизмов происходил по S - образной кривой, проходя, все фазы роста - лаг фазу, фазу ускоренного роста, экспоненциальную фазу, фазу замедления, стационарную фазу.
График №2 Кинетика роста клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, обработанных толуолом в начальной фазе роста.
Кривые роста микроорганизмов обработанных толуолом находятся практически параллельно горизонтальной оси. Основные кинетические характеристики роста дрожжей в зависимости от концентрации толуола представлены ниже
Удельная скорость роста клеток дрожжей резко снижается и приближается к нулю с увеличением концентрации толуола. Клетки, после внесения толуола, практически не растут. Их конечная концентрация падает с ростом концентрации внесенного толуола.
Морфолого-физиологические характеристики дрожжей S. cerevisiae SL 100, обработанных толуолом в лаг-фазе, наблюдались микроскопическим методом: Форму и размер клеток определяли при микроскопировании препаратов раздавленной капли с помощью окулярной линейки. Измерялись длина и ширина не менее 200 клеток. Количество живых и мертвых клеток определяли на витальных (прижизненных) препаратах с помощью метиленового синего. Основные морофолого-физиологические характеристики сведены в таблицу 4.
Из графиков 2, 3 и таблицы 4 видно, что внесение незначительного количества толуола, привело к резкому снижению скорости роста микроорганизмов и изменению физиологии их развития. На графике 1 видно, что клетки в присутствии толуола длительное время находились в лаг-фазе, где концентрация их снижалась. Увеличение биомассы началось по истечении 6 часов культивирования, и было незначительным.
Доля мертвых клеток возрастала с увеличением концентрации толуола с одновременным уменьшением количества почкующихся клеток. Наблюдалось также увеличение количества клеток более мелкого размера с увеличением концентрации толуола. Однако клетки наблюдались целыми. Сохранение целостности клеток еще раз подтверждает результаты, полученные японскими исследователями [44]. Авторы наблюдали состояние клеток дрожжей подверженных воздействию толуола, с помощью электронного микроскопа и сравнивали с клетками дрожжей необработанных толуолом. На снимках было видно, что клетки обработанные толуолом, имели более тонкую цитоплазматическую мембрану, но при этом не были разрушены. На снимках было видно также, что толуол оказал воздействие и на митохондриальную мембрану, ее стенки имели размытые края. Таким образом, клетки остаются целыми, но не растут.
Параллельно основному эксперименту, проводили измерение расхода субстрата клетками дрожжей. Количество глюкозы в среде определяли с помощью реактива Феллинга.
График 4 показывает потребление субстрата (сахарозы) во времени.
График №4 Потребление сахарозы клетками дрожжей Saccharomyces cerevisiae, обработанными толуолом в начальный момент времени.
Потребление субстрата нормальными клетками дрожжей отражает классическую схему потребления сахарозы клетками дрожжей при идентичных условиях. Экономический коэффициент Y составил в этом случае 0.42.
Потребление субстрата клетками дрожжей, подвергнутых обработке толуолом, существенно ниже, чем клетками необработанными толуолом. Обнаруженный факт потребления субстрата клетками при отсутствии их роста, позволяет предположить, что клетки остаются жизнеспособными и ферментативно-активными. Причем клетки, обработанные толуолом в концентрации 0.5%, потребляют субстрат лучше, чем клетки, обработанные более высокими концентрациями толуола. Это можно объяснить наблюдаемым ростом клеток при данной концентрации толуола. Далее в порядке снижения скорости потребления субстрата, следуют клетки, подвергнутые обработке толуолом в концентрации 2%, 1.5% и 1%. При данных концентрациях скорость роста практически нулевая, что показано в предыдущем эксперименте.
Для получения более достоверной картины потребления субстрата клетками дрожжей под воздействием толуола, было предложено ввести показатель удельного потребления субстрата, показывающего отношение количества сахарозы к единице массы клеток.
Можно предположить, что клетки обработанные толуолом, расходуют субстрат при помощи ферментов в процессе гликолитического пути. Чем выше концентрация толуола, тем более проницаемой становится цитоплазматическая мембрана, и, следовательно, облегчается доступ субстрата до ферментов клетки. Образующаяся в клетках энергия, тратится на поддержание жизнедеятельности клеток. Данное предположение привело к необходимости исследования ферментативной активности клеток дрожжей, в присутствии толуола.
Анализируя результаты эксперимента, можно заключить, что толуол при повышении его концентрации значительно ингибирует рост клеток, но при этом не происходит полного разрушения целостности клеток. Рост клеток остается на уровне лаг-фазы. Возникает вопрос, какое влияние толуол окажет на клетки дрожжей, подвергнутые его воздействию в середине активной фазы роста.
Метаболическая активность иммобилизованных клеток в третьем цикле
Третий цикл полностью повторял собой второй цикл эксперимента, с учетом того, что гранулы с клетками после второго цикла, промывались дистиллированной водой и снова были помещены, в свежую питательную среду. Условия проведения третьего цикла соблюдались идентичными первым двум циклам. График 23 показывает зависимость выделившегося газа от времени.
Вид кривых соответствует виду кривых в первом и втором циклах. Из графика 23 видно, что объем выделившегося газа иммобилизованными клетками с концентрациями С1 и С2 значительно снизились, а скорость выделения газа клетками с концентрацией СЗ продолжает стремительно расти. Диаграмма 4 отражает зависимость скоростей выделения газа иммобилизованными клетками от их концентрации. Диаграмма №4 Зависимость скорости выделения газа иммобилизованными клетками Saccharomyces cerevisiae от исходной концентрации во третьем цикле.
Кроме того, в конце третьего цикла эксперимента было обнаружено, что помимо всплывания гранул, помутнения среды, а также характерного дрожжевого запаха, появились видимые глазу пробоины у гранул с концентрациями иммобилизованных клеток дрожжей рода S. Cerevisiae равными С1 и С2. Зависимости скоростей выделяемого газа в трех циклах эксперимента от исходной концентрации клеток дрожжей отражены в диаграмме 5.
При микроскопировании не менее 20 гранул с иммобилизованными клетками разных концентраций были обнаружены наблюдения:
1. Гранулы с концентрацией иммобилизованных клеток С1 имели неровные края, небольшие выпуклости. На поверхности гранул, в районе выпуклостей, наблюдались четко выраженные трещины. Также на поверхности гранул было обнаружено большое количество клеток дрожжей.
2. Гранулы с концентрацией иммобилизованных клеток С2 также имели неровные края и небольшие выпуклости. Количество и размеры трещин наблюдались соизмеримыми со случаем с гранулами с концентрацией клеток С1. На поверхности гранул было обнаружено большое скопление клеток.
3. Гранулы с концентрацией СЗ иммобилизованных клеток имели ровные края. На поверхности гранул также были обнаружены клетки дрожжей, однако их количество было представлено единичными экземплярами.
Анализируя полученные результаты, можно заключить, что иммобилизованные клетки дрожжей рода S.cerevisiae способны активно расти внутри гранул кальций-альгината и даже прорастать через них. Согласно наблюдениям, в течение первых двух циклов эксперимента, гранулы с иммобилизованными клетками в концентрации С1 и С2 проявляли наибольшую метаболическую активность. Данный факт можно объяснить большой скоростью потребления субстрата, которую можно связать с большим количеством клеток.
Иммобилизованные клетки с наименьшей концентрацией равной СЗ оказались более метаболически-активными в третьем цикле в сравнении с другими концентрациями иммобилизованных клеток. Данное явление можно объяснить следующим образом:
Так как во всех гранулах в период термостатирования в питательной среде, несмотря на то, что клетки механически связаны, имеет место рост клеток, их концентрация постепенно увеличивается. С увеличением концентрации клеток увеличивается скорость потребления субстрата, что и наблюдалось в первом цикле. Однако, вероятно, избыточное количество клеток внутри гранул в определенный момент создает барьер для доступа субстрата клеткам, находящимся в «глубине гранул». Соответственно субстрат становится недоступен части клеток, что оказывает влияние на скорость выделения газа.
К третьему циклу количество клеток в гранулах с начальной концентрацией С1 и С2 увеличивается до уровня, когда клетки начинают выходить из гранул. Это свидетельствует о максимальной насыщенности гранул клетками. В результате лимитирования по субстрату, клетки, находящиеся в середине гранул оказываются менее активными. Их метаболическая активность падает. Исходя, из этого можно сделать вывод, что в конце третьего цикла в образовании газа в гранулах с высокой исходной концентрацией клеток С1 и С2 участвуют в основном клетки, находящиеся в непосредственной близости от поверхности гранул.
В случае с наименьшей исходной концентрацией иммобилизованных клеток СЗ, к третьему циклу их количество вырастает внутри гранул, но еще не достигает критической величины. Соответственно скорость выделения газа увеличивается и достигает величины, значительно превышающей, скорости образования С02 клетками в гранулах с большей исходной концентрацией иммобилизованных клеток.
Наблюдаемые явления с гранулами в трех циклах эксперимента также можно объяснить и следующим образом:
После второго цикла, в гранулах с концентрацией клеток С1 и С2 началось нарушение структуры. Часть клеток при этом высвободилось наружу. В процессе промывки гранул дистиллированной водой, высвободившиеся из гранул клетки были удалены. При этом концентрация клеток внутри гранул снизилась. Снижение концентрации клеток внутри гранул повлекло за собой снижение количества сбраживаемого субстрата, и соответственно количества выделяемого газа.
Первая версия изменения скорости выделения газа, кажется более предпочтительнее.
Исходя их полученных результатов, можно заключить, что из трех выбранных концентраций иммобилизованных клеток CI, С2, СЗ наиболее пригодной для проведения многократных синтезов является СЗ.
Трехцикловая биотрансформация аденозина в аденозинфосфаты с подращиванием и обработкой толуолом иммобилизованных клеток после каждого цикла
Следующий эксперимент проводился в идентичных условиях предыдущих экспериментов с внесением толуола в концентрации 1.5 % (об) после каждого цикла. Схематично эксперимент можно изобразить следующим образом: Трансформация 1 цикл - подращивание -добавление толуола - трансформация 2 цикл - подращивание -добавление толуола - трансформация 3 цикл. После каждого цикла гранулы с иммобилизованными клетками отмывались в солевом растворе. На основании полученных данных был построен график 31 отражающий образования АТФ от времени, в течение всех трех циклов эксперимента.
Из графика 31 видно, что образования АТФ постоянно увеличивается от цикла к циклу. Максимальные выходы АТФ составили 1 цикл : 2 цикл : 3 цикл = 75 : 80 : 85 %.
В диаграмме 6 отражены выходы аденозинтрифосфата во всех сериях эксперимента. 1 серия - без подращивания и толуола, 2 серия - с подращиванием, 3 серия - с подращиванием и толуолом. Диаграмма №6 Максимальные выходы АТФ в трех сериях эксперимента.
Анализируя результаты проделанных экспериментов можно заключить, что иммобилизованные клетки проявляют наибольшую ферментативную активность по трансформации аденозина в аденозинфосфаты при многократном использовании, в случае обработки клеток толуолом и подращивании.
Образование аденозинфосфатов из аденозина, в случае иммобилизованных клеток заметно растягивается во времени, в сравнении со свободными клетками. Этот феномен можно объяснить, таким образом, за счет большой плотности клеток внутри гранул доступ предшественника, в нашем случае аденозина затруднен и происходит по градиенту концентрации иммобилизованных клеток внутри гранул. То же самое происходит и с толуолом. Второй момент, большая плотность иммобилизованных клеток внутри гранул затрудняет выход продуктов реакции. Соответственно, можно сделать вывод, что из всех иммобилизованных клеток, находящихся внутри гранулы наиболее активен только верхний слой клеток. Клетки, расположенные более глубоко менее активные. Активность иммобилизованных клеток, вероятно, уменьшается по градиенту их концентрации внутри гранул.
Полученные результаты еще раз подчеркивают принятую нами ранее концепцию - снятия блокировки фермента фосфофруктокиназы в процессе гликолиза в присутствии толуола. Аллостерический центр под воздействием толуола возможно претерпевает изменения, позволяющие снять ингибирование высокой концентрацией АТФ. В работах авторов [81], указывается, что жирные кислоты, образующиеся в результате метаболизма клеток, также оказывают ингибировающие воздействие на процесс гликолиза. Путем растворения жирных кислот толуол оказывает дополнительный эффект, направленный на снятие блокировки процесса гликолиза.
Однако через некоторое время фосфофруктокиназа разрушается в процессе протеолиза внутри клетки, а новый фермент не может образоваться вследствие отсутствия анаболических процессов. Все это создает существенное препятствие для использования данных клеток в непрерывных процессах.
Для определения операционной стабильности биосинтеза АТФ иммобилизованными клетками дрожжей по схеме с подращиванием и обработкой толуолом был проведен ряд циклов биотрансформации. Результаты отражены ниже
Использование иммобилизованных клеток с возможностью их подращивания между циклами и повторной обработкой толуолом, делает эти клетки пригодными для проведения биотрансформации аденозина в аденозинфосфаты со стабильным выходом в не менее чем 20 циклах.
