Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Возбудитель плевропневмонии свиней A. pleuropneumonia 11
1.1.1. История открытия возбудителя и его систематическое положение 12
1.1.2. Биологические свойства возбудителя 13
1.1.3. Серологическая дифференциация A.pleuropneumoniae 14
1.2. Роль A. pleuropneumoniae в патологии животных 15
1.2.1. Факторы вирулентности A. pleuropneumoniae 16
1.2.2. Эпизоотологические особенности и клинические признаки заболевания ' 18
1.3. Роль серологических методов и иммуноферментиого анализа в
диагностике актинобациллезной плевропневмонии 20
1.3.1. Диагностика актинобациллезной плевропневмонии1 свиней 20
1.3.2. Иммуноферментный анализ 23
1.3.2.1 Непрямой метод ИФА '. 24
1.3.2.2 Интерпретация результатов ИФА 27
1.3.3. Применение ИФА для выявления антител к бактериям A pleuropneumoniae 28
1.4. Особенности технологии производства бактериальных диагностикумов (антигенов и диагностических сывороток) 32
1.5. Заключение по обзору литературы 34
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 35
2.1. Материалы 35
2.1.1. Штаммы и изоляты микроорганизмов 35
2.1.2. Питательные среды 36
2.1.3. Лабораторные животные '. 37
2.1.4. Сыворотки 37
2.1.5. Растворы и реактивы 37
2.1.6. Оборудование ' .' 39
2.2. Методы 40
2.2.1. Методы изучения биологических свойств микроорганизмов 40
2.2.2. Получение бактериальных антигенов 41
2.2.3. Определение активности и специфичности антигенов 43
2.2.4. Получение нормальных и специфических сывороток крови животных 46
2.2.5. Определение серовариантнои принадлежности штаммов A.pleuropneumoniae 48
2.2.6. Постановка непрямого твердофазного варианта ИФА для выявления антител к бактериям A.pleuropneumoniae 50
, 2.2.7. Статистическая обработка результатов 51
2.3. Результаты собственных исследований 52
2.3.1. Биологические свойства штаммов бактерий A.pleuropneumoniae, выделенных на территории РФ 52
2.3.2. Определение серовариантнои принадлежности штаммов A.pleuropneumoniae 55
2.3.2.1. Определение серовариантнои принадлежности штаммов A.pleuropneumoniae в РА на стекле 55
2.3.2.2. Определение серовариантнои принадлежности штаммов A.pleuropneumoniae в РДП , 57
2.3.2.3. Определение серовариантнои принадлежности штаммов A.pleuropneumoniae в РА -. 58
2.3.3. Выбор антигена A.pleuropneumoniae для ИФА 61
2.3.4. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антител к бактериям A.pleuropneumoniae 63
2.3.4.1. Оптимизация условий постановки непрямого варианта ИФА 63
2.3.4.2. Определение оптимальных разведений антигена и конъюгата....66
2.3.4.3. Получение комбинированного антигена 69
2.3 А А. Выбор условий хранения комбинированного антигена на планшетах 70
2.3.4.5 Сравнительная оценка результатов выявления антител к бактериям
A.pleuropneumoniae в непрямом варианте ИФА и в РА 71
2.3.4.6. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления
антител к бактериям A.pleuropneumoniae при тестировании сывороток крови свиней в одном разведении 73
2.3.4.6.1. Определение рабочего разведения сыворотки крови свиней и расчет титра антител 74
2.3.4.6.2. Определение допустимых величин оптической плотности для контрольных положительной и отрицательной сывороток 77
2.3.4.6.3. Определение позитивно — негативного порога 79
2.3.4.6.4. Сравнение чувствительности и специфичности разработанной иммуноферментной тест-системы с РА и коммерческим набором ИФА 81
2.3.5. Иммунологический мониторинг свинопоголовья в отношении
возбудителя актинобациллезной плевропневмонии на свинокомплексах
Российской Федерации 83
2.3.5.1. Определение динамики накопления поствакцинальных антител..83
2.3.5.2. Серологический мониторинг в отношении возбудителя
актинобациллезной плевропневмонии на свинокомплексах РФ, проведенный
с применением разработанных наборов ИФА 85
2.3.6. Технологическая схема производства иммуноферментных наборов
для определения антител к бактериям A.pleuropneumoniae 87
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 90
4. ВЫВОДЫ 97
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 98
6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 100
7. ПРИЛОЖЕНИЯ 120
- Возбудитель плевропневмонии свиней A. pleuropneumonia
- История открытия возбудителя и его систематическое положение
- Материалы
Введение к работе
Актуальность темы. Болезни свиней представляют одну из значимых проблем ветеринарной науки и практики. Перевод свиноводства на промышленную технологию выявил значение ряда инфекционных болезней, которые до этого оставались за пределами внимания специалистов. К этой категории бактериальных болезней свиней можно отнести актинобациллезную плевропневмонию [12, 24, 28, 29].
Этому заболеванию подвержены поросята всех возрастов [172, 173].
Болезнь свиней наносит значительный урон свиноводческим хозяйствам за счет большого падежа свиней, затрат на лечение больных животных и проведение ветеринарно-санитарных мероприятий [30, 33, 34, 78].
В настоящее время актинобациллезная плевропневмония свиней широко распространена в Канаде, США, Франции, Великобритании, Италии, Дании, Финляндии, Голландии, Японии, Греции, Австралии, а также в странах Южной Африки [47, 65, 159, 160].
Диагноз на актинобациллезную плевропневмонию свиней устанавливают комплексно на основании данных эпизоотологического обследования хозяйства, клинических признаков и патологических изменений у пораженных животных и результатов лабораторных исследований [17, 78, 172].
Особенностью данного заболевания является возможное субклиническое течение инфекции (часто после лечения антибиотиками) а также бактерионосительство, без внешних проявлений болезни, которое представляет потенциальную опасность при формировании нового, смешанного стада [41, 43, 51]. В таком случае вспышка происходит внезапно, болезнь носит острый характер, часто с привлечением сопутствующей микрофлоры, что влечет за собой значительный экономический ущерб. Поэтому выявление серопозитивных животных является важным звеном в противоэпизоотических мероприятиях при данном заболевании [58, 66, 78].
Принятые в нашей стране методические указания по лабораторной диагностике гемофилезной плевропневмонии свиней, утвержденные в 1981 г., не предусматривают проведения серологических исследований [17], в то же время, в ряде стран ЕС и Северной Америке широкое распространение нашли методы выявления антител с помощью, как традиционных серологических реакций, так и иммуноферментного анализа. В Канаде и Дании серологические методы используют для эпидемиологического надзора за поголовьем свиней [67, 78, 86, 162, 163, 168].
Разработка иммунохимических методов, в частности ИФА, расширила возможность выявления специфических антител к возбудителям бактериальных инфекций, открыла перспективы устранения многих технических проблем лабораторной диагностики и повышения ее стандартизации и достоверности [124, 156, 157, 161, 178, 179].
Являясь одним из сравнительно "молодых" методов, базирующихся на использовании антител, конъюгированных с различными ферментами, ИФА по многим параметрам превосходит традиционные методы диагностики: по чувствительности, специфичности и производительности, быстроте получения результатов, возможности стандартизации условий постановки анализа, доступности широкому кругу практических учреждений [169, 173].
Указанные преимущества этого метода, способствовали его выбору для изучения возможности использования в качестве метода выявления и количественного определения антител к бактериям A.pleuropneumoniae [156, 161,178, 179].
Кроме того, важным аспектом в диагностике актинобациллезной плевропневмонии является определение серовариантного состава циркулирующих в хозяйствах изолятов A.pleuropneumoniae.
До настоящего времени в РФ отсутствовали коммерческие
диагностикумы для выявления антител в сыворотках крови свиней к
бактериям A.pleuropneumoniae и серотипирования изолятов
A.pleuropneumoniae, что и послужило выбору данной темы.
Цели и задачи исследования. Целью наших исследований была разработка иммуноферментной тест системы для выявления антител против бактерий A.pleuropneumoniae в сыворотках крови свиней.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
- получить специфические препараты антигенов и сывороток на
лабораторных и восприимчивых животных для использования в качестве
компонентов в РА и ИФА;
обосновать схему постановки реакции агглютинации для выявления антител к бактериям A.pleuropneumoniae микрометодом и изучить возможность использования её для серотипирования выделенных изолятов бактерий A.pleuropneumoniae;
разработать иммуноферментную тест систему для количественного определения антител к бактериям A.pleuropneumoniae в сыворотках крови свиней;
разработать регламент на изготовление и контроль диагностических наборов для выявления антител к бактериям A.pleuropneumoniae в сыворотках крови свиней иммуноферментным методом;
- провести серологический мониторинг в отношении возбудителя
актинобациллезной плевропневмонии свиней в свиноводческих хозяйствах
Российской Федерации.
Научная новизна работы:
получены специфические компоненты A pleuropneumoniae для ИФА;
обоснована схема постановки реакции агглютинации микрометодом для серотипирования изолятов бактерий A.pleuropneumoniae;
разработана иммуноферментная тест-система для выявления специфических антител к бактериям A.pleuropneumoniae в сыворотках крови свиней при тестировании их в одном разведении;
- проведена сравнительная оценка результатов исследований сывороток
крови свиней, с использованием разработанного непрямого варианта ИФА,
реакции агглютинации и иммуноферментного коммерческого набора;
- проведен серологический мониторинг свинопоголовья в отношении возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней.
Практическая значимость. Штаммы бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae «Г-1», «Ш-1», «К-2», выделенные на территории РФ депонированы во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГУ «ВГНКИ».
Экспериментальные данные диссертационной работы явились основой для разработки методических рекомендаций по получению специфических компонентов для постановки РА и ИФА.
Разработана нормативная документация на набор для выявления антител к бактериям Actinobacillus pleuropneumoniae в сыворотках крови свиней иммуноферментным методом.
Иммуноферментный набор для выявления антител к бактериям A.pleuropneumoniae применяется в ФГУ «ВНИИЗЖ» при исследовании сывороток крови свиней.
Публикации научных работ. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, одна из них в издании по перечню ВАК РФ.
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и получили положительную оценку на заседаниях Ученого Совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2004-2009 гг, на Международных научно-практических конференциях: «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» - Владимир, 2004; «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику», - Владимир, 2008 г.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах, иллюстрирована 18 таблицами и 15 рисунками. Список использованной литературы включает 186 источников, из них 149 иностранных.
Основные положения, выносимые на защиту.
результаты изучения биологических свойств штаммов бактерий A.pleuropneumoniae, депонированных во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГУ «ВГНКИ»;
ссротипирование изолятов бактерий A.pleuropneumoniae в РА микрометодом;
- разработка технологии изготовления иммуноферментного набора для
выявления антител к бактериям A.pleuropneumoniae при тестировании
сывороток крови свиней в одном разведении;
- результаты применения разработанной иммуноферментной тест-
системы для выявления антител к бактериям A.pleuropneumoniae при
определении динамики накопления поствакцинальных антител и проведении
серологического мониторинга в отношении возбудителя актинобациллезной
плевропневмонии свиней.
Возбудитель плевропневмонии свиней A. pleuropneumonia
Актинобациллезная плевропневмония свиней — это инфекционная контагиозная болезнь, которая характеризуется при остром течении геморрагическим воспалением легких и фибринозным плевритом, а при подостром и хроническом - развитием очаговой гнойной некротизирующей плевропневмонии и фибринозным плевритом [14, 21, 28, 30, 31, 32, 33, 34]. Возбудителем актинобациллезной плевропневмонии свиней является -Actinobacillus pleuropneumoniae — грамотрицательная, капсулообразующая гемофильная бактерия [22].
Впервые возбудитель актинобациллезной плевропневмонии был описан P.R. Matthews и l.H. Pattison в 1961г. [126]. Позднее H.J. Olander сообщил о вспышке болезни у свиней, сопровождающейся септицемией, плевропневмонией и артритами, в процессе которой, из пораженных тканей были выделены гемолитические, нуждающиеся в V — ростовом факторе, гемофильные бактерии [148]. Ввиду большого сходства этих бактерий с культурами H.parahaemolyticus, им дали аналогичное наименование -H.parahaemoh ticus [172].
В 1964г. R.E. Shope выделил из пораженных легких, больных плевропневмонией свиней, культуры гемофильных бактерий, и назвал их Haemophilus pleuropneumoniae. [166, 167]. Дальнейшими исследованиями J.Nicolet и Н. Konig в 1966 г. было установлено, что культуры, выделенные R.E.Shope, сходны по морфологическим и биохимическим свойствам со штаммами Haemophilus parahaemolyticus, что послужило основанием для присвоения им видового названия Н. parahaemolyticus [135]. Однако ДНК штаммов этого вида, выделенных от свиней при плевропневмонии, в своем составе имеет более высокий процент гуанина и цитозина, а штаммы H.parahaemolyticus, выделенные от людей, не обладали патогенностыо для свиней. На основании этого, М.А. Killian в 1976 г. предложил именовать гемолитические, гемофильные бактерии, вызывающие плевропневмонию у свиней, Н. pleuropneumoniae [117, 118]. В 1983 г. году, бактерии Н.pleuropneumoniae были переведены в род Actinobacillus по причине высокой гомологии к A.ligniersii на уровне ДНК [44, 177].
В настоящее время вид Actinobacillus pleuropneumoniae относят к роду Actinobacillus, семейству Pasteurellaceae [22, 23, 121].
Бактерии A.pleuropneumoniae - это мелкие (0,3 - 0,4x0,4 - 0,5 мкм) грамотрицательные, неподвижные коккобактерии и палочки [22]. Спор не образуют, вирулентные штаммы имеют капсулу, бактерии обладают выраженным тропизмом к легочной ткани. Молодые культуры полиморфны: в них часто находят нитевидные формы бактерий. Возбудитель проявляет широкий диапазон морфологической изменчивости [22, 30]. В препарате раздавленная капля бактерии выглядят как небольшие палочки с закругленными концами, терминальные части бактериальных клеток оптически более плотные [30].
Бактерии из молодых культур окрашивают анилиновыми красителями. При работе со штаммами возбудителя, которые находятся в состоянии диссоциации, наблюдают вариабельность окраски по Граму [30, 31]. Капсулу у вирулентных штаммов обнаруживают при окраске по методу Гинса[78, 172].
Штаммы A. pleuropneumoniaе могут быть сгруппированы в два биотипа на основе зависимости к V-фактору роста - дифосфо-пиридин-нуклеотиду (ДГШ); биотип 1 является ДПН-зависимым, а биотип 2 является ДПН-независимым [133, 139, 144, 177].
В качестве источника ДПН для бактерий первого биотипа используют баккормилку (штаммы E.coli, S.albus, S.aureus) или дрожжевой экстракт. На агаре по Хоттингеру с добавлением дрожжевого экстракта, актинобациллы образуют колонии в "S" форме (мелкие и среднего размера, слегка опалесцирующие, гладкие, бесцветные, гомогенные с ровными краями в диаметре 3-5 мм). В мясо-пептонном бульоне с добавлением дрожжевого экстракта, через 18-24 ч, можно наблюдать равномерное помутнение среды, через 4-5 дней роста образуется характерный слизистый осадок, поднимающийся при встряхивании в виде неразбивающейся косички с полным просветлением бульона. При выращивании микроорганизмов на питательных средах с баккормилкой, наблюдают значительные
История открытия возбудителя и его систематическое положение
Серологическое разнообразие штаммов A. pleuropneumoniae определяют поверхностные антигены - капсульный полисахарид (КПС) и липополисахарид (ЛПС) клеточной стенки [115, 129, 134].
В настоящее время установлено 13 серотипов штаммов A.pleuropneumoniae в рамках первого биотипа [82, ПО, 118, 137, 142, 146, 158], и 2 серотипа (13-ий 14-й) среди штаммов второго биотипа [78].
Объединение по серотипам и биотипам не является строго обязательным, так как есть сообщения о выделении серотипов 2, 4, 7 и 9 в группе второго биотипа [75]. Кроме того, в Канаде и США выделили 2 штамма 13 серотипа, но с признаками первого биотипа [78].
Вследствие того, что отдельные типоспецифические капсульные полисахариды являются общими для ряда сероваров, отмечают перекрестные реакции между 1, 9 и 11 серотипами; 3, 6 и 8; 4 и 7 серотипами [46, 56]. Другие перекрестные реакции можно наблюдать из-за общих липополисахаридных антигенов [102, 138].
Существуют штаммы с различным набором КПС/ЛПС антигенов. Так, есть сообщения о выделении в Северной Америке и Европе 1/7 и 2/7 серотипов. Есть мнение, использовать для серотипирования актинобацилл обе классификации, как по КПС так и по ЛПС антигену [120, 171], но такая номенклатура не получила пока широкого распространения [46, 78].
В различных странах доминируют разные серотипы возбудителя. В Швейцарии, Дании и Швеции преобладает 2 серовар. В Аргентине, Австралии, Мексике и Польше - 1, в Канаде, Чили, США — 1 и 5, в Венгрии -1 и 2 [130, 172]. Самыми вирулентными считают серотипы: 1, 5, 9, 10 и 11 [173]. В тоже время, в ряде стран серьезную проблему могут представлять отдельные серотипы (в том числе 3-ий), которые относят к низко вирулентным [58, 66].
По данным Д.И. Скородумова, серологическая идентификация эпизоотических культур A.pleuropneumoniae, выделенных от свиней в хозяйствах Российской Федерации, выявила наличие сероваров 2, 3, 4, 6, а исследования в РИГА сывороток крови свиней из различных хозяйств показало доминирование антител к сероварам 1, 2, 4 , 6, 12 [31]. По данным В.С Русалеева, на территории Российской Федерации циркулируют 3 сероварианта A.pleuropneumoniae, причем 2 из них, а именно 2 и 6 выделяют в хозяйствах наиболее часто [28].
Материалы
В работе использовали следующие референтные штаммы бактерий, полученные из Американской коллекции типовых культур (АТСС):
- Actinobacilluspleuropneumonia серотип 1 (штамм № 27088);
- Actinobacillus pleuropneumoniae серотип 2 (штамм № 27089);
- Actinobacillus pleuropneumoniae серотип 3 (штамм № 27090);
- Actinobacillus pleuropneumoniae серотип 5 (штамм № 33377);
- Actinobacillus pleuropneumoniae серотип 6 (штамм № 33590);
- Pasteurella multocida серогруппа А (штамм № 15742);
- Haemophilus parasuis штамм № 19417. Штаммы бактерий, полученные из ФГУ «ВГНКИ»:
- Salmonella typhimurium № 371;
- Yersinia enterocolitica №3.
Штаммы бактерий Apleuropneumoniae, выделенные из патологического материала от свиней лабораториями микробиологии и диагностики бактериальных инфекций животных, ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»: «Ш-1», «К-2», «Г-1», депонированные во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГУ «ВГНКИ». 2.1.2. Питательные среды
Для культивирования бактерий использовали следующие питательные среды: - мясо-пептонный агар (МПА);
- мясо-пептонный бульон (МПБ);
- мясо-пептонный полужидкий агар (ПЖА);
- агар на основе мясного перевара по Хоттингеру с добавлением 10% эритроцитов лошади (ХКЭ);
- агар на основе мясного перевара по Хоттингеру с добавлением 10% дрожжевого экстракта, 10% эритроцитов крови лошади, 5% сыворотки крови крупного рогатого скота 1-й категории, 1% раствора глюкозы (ХФЭ);
- агар на основе мясного перевара по Хоттингеру с добавлением 10% дрожжевого экстракта, 5% сыворотки крови крупного рогатого скота 1-й категории, 1% раствора глюкозы (ХФ);
Приготовленные питательные среды хранили в защищенном от света месте при 4С не более 14 дней.
При выращивании бактерий рода Actinobacillus и Haemophilus в питательные среды вносили ростовые факторы:
- в качестве V-фактора роста добавляли 10% дрожжевой экстракт (ДЭ).
Для приготовления дрожжевого экстракта 100г пекарских дрожжей
ресуспендировали в 400 мл дистиллированной воды и кипятили в течение 3-5 минут при непрерывном помешивании. Суспензию остужали и центирфугировали при 2000 об/мин в течение 30 мин, после чего надосадок (ДЭ) фильтровали через картон и стерилизовали холодным способом, используя мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. ДЭ хранили в защищенном от света месте при 4С не более 10 дней;
- в качестве Х-фактора роста добавляли гемин х.ч (0,01%) фирмы "Serva" или 5% эритроцитов крови лошади (КЭ), приготовленных в лаборатории микробиологии ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных». Кроме того, в питательные среды вносили: сыворотку крови крупного рогатого скота 1-й категории (5% от объема среды) и 1% глюкозы.
Все указанные биологически активные компоненты добавляли в питательные среды непосредственно перед культивированием. При внесении биологически-активных компонентов в плотные питательные среды, расплавленный агар охлаждали до температуры 40-45С.
Для постановки РДП использовали агар Noble фирмы Difco.
