Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Способы повышения молочной и мясной продуктивности животных
1.1.1. Антибиотики 8
1.1.2. Гормональные препараты, применяемые в животноводстве
1.1.3. Характеристика эстрадиола-170 15
1.2. Методы контроля остаточных гормонов в продуктах животного происхождения27
2. Собственные исследования 33
2.1. Материалы и методы 33
2.2. Получение антител к эстраднолу-17(3 35 2.2.1. Получение сывороток,содержащих антитела эстрадиола-38
17(3 2.2.2 Изучение чувствительности и специфичности антител к эстрадиолу 41
2.3. Разработка иммуноферментного метода количественного определения эстрадиола-17(3 в продуктах животного происхождения
2.3.1. Подбор оптимальной дозы антигена БСА-эстрадиол для конструирования набора иммуноферментного анализа
2.3.2. Получение пероксидазного коньюгата козьих антител к иммуноглобулинам класса G кролика 47
2.4 Отработка иммуноферментного метода количественного определения эстрадиола-17-в в продуктах животного происхождения
Разработка метода подготовки продуктов животного
происхождения для исследования на эстрадиол-170
Испытание разработанного набора и метода
иммуноферментного анализа количественного ,~
определения эстрадиола-17 в в продуктах животного происхождения в лабораторных условиях Испытание разработанного набора иммуноферментного анализа для количественного определения эстрадиола- _„ 17р в продуктах животного происхождения в производственных условиях
Обсуждение результатов исследований 75
Выводы 81
Практические предложения 82
Список литературы 83
Приложения 102
Введение к работе
Актуальность темы. В условиях возрастающей интенсификации сельскохозяйственного производства и сильной конкуренции, с целью увеличения привесов, отдельные мясопроизводители незаконно применяют различные химические стимуляторы роста, опасные для здоровья человека, такие как антибиотики, другие антимикробные средства, тиреостатики и различные гормональные препараты (76, 95, 97,104, 105, 106, 109, ПО).
Проведенная в последнее время сертификация продуктов животного происхождения, а также кормов и кормовых добавок, производимых в России и ввозимых в Россию из-за рубежа, позволила в ряде случаев выявить и предупредить реализацию продуктов, которые могли бы нанести серьезный вред здоровью человека.
В связи с тем, что в России применяемые до настоящего времени инструментальные методы исследований трудоемки и дорогостоящи, контроль за содержанием остаточных количеств антибиотиков, тиреостатиков и гормонов осуществляется недостаточно полно и регулярно (40, 45).
В то же время в странах ЕЭС и США, наряду с такими инструментальными методами как газовая и жидкостная хроматография, хромато-масспекторометрия, для определения антибиотиков и гормонов широко используют иммуноферментные методы исследования, позволяющие осуществлять массовый мониторинг продуктов животного происхождения, кормов, кормовых добавок и животных в местах их выращивания.
Для осуществления постоянного мониторинга за наличием антибиотиков, тиреостатиков и гормонов в продуктах животного происхождения необходимо разработать новые отечественные методы, пригодные для скрининговых исследований. К таким методам следует отнести иммуноферментный анализ (ИФА), т.к. решением комиссии европейского сообщества 93/25 7/ЕЕС (197) утверждены методы, которые должны
применяться для обнаружения остатков химических веществ, имеющих гормональное или тиреостатическое действие, куда включен и ИФА.
Арбитражными аналитическими методами, которые должны применяться подтверждения присутствия остатков химических веществ (за исключением тяжелых металлов и мышьяка) являются:
иммуноферментный анализ;
тонкослойная хроматография;
жидкостная хроматография;
газовая хроматография;
масс-спектрометрия;
спектрометрия.
Как показали научные исследования наиболее часто в пищевых продуктах выявляют повышенные концентрации эстрадиола-17р\
В связи с этим мы поставили перед собой цель разработать иммуноферментный метод определения в пищевых продуктах эстрадиола-17(3.
Задачи исследований.
Получить антитела к эстрадиолу-17(3 и оценить их специфичность
Разработать на основе полученных антител ИФА определения эстрадиола 17(3 на основе полученных антител с чувствительностью, позволяющей определять гормон на уровне предельно допустимой концентрации (ПДК).
Разработать метод подготовки проб анализа на эстрадиол-17Р в разработанном варианте ИФА.
Провести оценку пригодности разработанного метода для количественного анализа эстрадиола-17(3 в различных продуктах животного происхождения.
Испытать метод в лабораторных условиях.
Испытать метод в производственных условиях.
7. Разработать нормативно-техническую документацию на определение эстрадиола-17 f3 в продуктах животного происхождения.
Научная новизна.
Впервые для ветеринарной практики разработаны набор реагентов и методивдколичественного определения эстрадиола-170 в различных продуктах животного происхождения, позволяющие определять гормон в концентрации до 0,05 мкг/кг.
Практическая значимость.
Результаты научно-исследовательских работ вошли в нормативно-техническую документацию:
ТУ 9388-004-54919320 «Набор для количественного определения эстрадиола-170 в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа (ИФА-АФ-эстр.).
Наставление по применению набора для количественного определения эстрадиола-170 в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа (ИФА-АФ-эстр.), утверждённое Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 31.07.2001 г. № 13-5-02/0146.
Инструкция по изготовлению и контролю набора для определения эстрадиола-170 в продуктах животного происхождения иммуноферментным методом.
Разработанный набор для определения эстрадиола-17(3 в пищевых продуктах применяется в ветеринарной практике в соответствии с указанием Главного госветинспектора Российской Федерации по организации надзора №12-7-1/900 от 04.10.1999 г(103).
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1. заседаниях ученого совета ВНИТИБП (1998-2001 г)
Всероссийской научно-производственной конференции «Разработка и освоение производства нового поколения лекарственных средств для животных и их применение в ветеринарной практике», Ставрополь 2000 г.
Всероссийский научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИТИБП «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щёлково 2000 г.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, отчет по научно-исследовательской работе, нормативно-техническая документация на изготовление, контроль и применение диагностикума. Основные положения, выносимые на защиту:
получение специфических компонентов для постановки иммуноферментного анализа;
обработка условий постановки иммуноферментной тест-системы для обнаружения эстрадиола-17Р в различных биологических объектах;
изучение чувствительности и специфичности разработанной тест-системы;
апробация набора иммуноферментного определения эстрадиола-17(3 в продуктах животного происхождения.
Объём и структура диссертации.
Диссертационный материал изложен на 105 листах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения и приложения. Диссертация иллюстрирована 19 таблицами и 3 рисунками. Список литературы содержит 217 источников, в т.ч. 101 зарубежных.
Способы повышения молочной и мясной продуктивности животных
Антибиотики применяются при массовом разведении животных главным образом в так называемых «питательных» дозах, т.е. в количествах меньших, чем лечебные дозы. Антибиотики также применяются с целью лечения больных животных.
Остаточные количества антибиотиков в мясе, молоке и пищевых продуктах способны вызывать у человека явления аллергии или создавать устойчивость микроорганизмов к антибиотикам (28,30,34,70).
В связи с этим Санитарными правилами и нормами СанПиН 2.3.2.1078-01 в продуктах животного происхождения нормируются остаточные количества антибиотиков, применяемых в животноводстве для целей откорма, лечения и профилактики заболеваний скота и птицы. В мясе, мясопродуктах, субпродуктах убойного скота и птицы контролируются как допущенные к применению в сельском хозяйстве кормовые антибиотики - гризин, бацитрацин, так и лечебные антибиотики, наиболее часто используемые в ветеринарии - антибиотики тетрациклиновой группы, левомицетин; в молоке и молочных продуктах - пенициллин, стрептомицин, антибиотики тетрациклиновой группы, левомицетин; в яйцах и яйцепродуктах -бацитрацин, антибиотики тетрациклиновой группы, стрептомицин, левомецин.
В США в соответствии с национальной программой инспекция продовольственной безопасности проводит различными методами контроль мяса на тетрациклин, окситетрациклин, хлортетрациклин, бета-лактамы (пенициллины и цефалоспорины и другие недифференцируемые в этой группе), гектамицин, спекциномицин/стрептомицин (не дифференцированные), эритромицин, тилмикозин, тилозин, неомицин, флавомицин, бацитрацин, гигромицин, новобиоцин, линкомицин, пирлимицин, клиндамицин, спирамицин, олеандомицин. Упомянутые антибиотики определяются биологическими исследованиями (задержка роста микроорганизмов и высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Многие антибиотики идентифицируются масспектрометрией (49). Нет количественного определения таких аминогликозидов как омикацин, апрамицин, комамицин, спектиномицин, стрептомицин и ампициллина (бета-лактома).
В нашей стране антибиотики определяют путем ингибирования микроорганизмов и методом хроматографии.
В 2000 г. с целью сертификации продуктов животного происхождения ветеринарные лаборатории России исследовали 8064 образца проб различной животноводческой продукции. Положительные результаты получены в 15 (0,2%) случаев, в том числе: мясо всех видов - 5, молоко сырое - 3, яйцо - 5, меланж, яичный порошок - 2.
В США в 2000 г. по плану проведено исследование на наличие токсических остатков веществ 28973 образца пищевых продуктов, в 134 (0,46%) случаях выявлены различные антибиотики и сульфамиламиды (150).
Антибиотики
Эстрадиол-17(3 (Е2), эстра-1,3,5(10) - триеке 3, 17(3 -диол является 18-карболовым стероидным гормоном и наиболее сильнодействующим из естественных эстрогенов.
Этот гормон продуцируется главным образом путем развития фолликул яйцеклеток у взрослых самок Е2 оказывает влияние на биологический эффект роста клеток и значительную дифференциацию через механизмы, связанные с рецепторами. Е2 связан с высокой эффективностью и высокой специфичностью к внутриклеточным белкам известным как эстрогенные рецепторы (169, 170, 171). Известно два ггодтипа эстрогенных рецептора (ЕР) ED-a иЕР-В. Известно, что эти белки могут образовывать или гомо- или гетеродимерные комплексы, точная информация о ЕР-В малоизвестна. Значение величины распада Е2 для ED-a варьирует в пределах 0,1-1,0 нМ. (124, 151).
Известны ароматические А-кальцевые и 3-ОН группы Е2, которые могут быть важными компонентами активности лигантных связей и повышения активности рецепторов Е2.
Известно, что метаболиты сильно ослабляют аффинные связи для ЕР-а, метаболиты, 2-ОН- Е2 и 4-ОН- Е2 способны связать соответственно 100% и 150% аффинных связей эстрадиола. Дальнейшая обработка метиленом этих эстрогенов является результатом сильного ослабления аффинных связей (124,151,173,172).
а) Фармококинетика эстрадиола -17р у животных.
У крупного рогатого скота эстрадиол применяется или как Е2 или как эстрадиол бензоат путем подкожной имплантации в ухо. Ухо вместе с любым остатком препарата удаляется при забое. Эстрадиол бензоат быстро гидролизуется в организме животного в Е2.
В циркуляционной системе животного Е2, отделенной от имплантанта, неразличим от эндогенного Е2 (171). Дозы эстрадиола, применяемые в качестве имплантанта варьируют от 10 до 45 мг/на животное (171).
Доказано, что улучшение прироста массы тела и эффективности кормления наблюдается при последующем применении эстрадиола -17 Р и что гипофиз стимулируется для увеличения количества продукции гормона роста (170,171).
После применения телятам меченного радиационной меткой Е2, радиоактивность 17а -эстрадиола в моче состояла вначале с наименьшим количеством экстрона. Коньюгаты Е2 и Ej также определялись.
Радиоактивность фекалиев включала вначале 17а -эстрадиол, а также Е2 и Е] в неконьюгированнной форме (171,168).
Материалы и методы
Работа выполнена в отделе иммунологии ВНИТИБП, ЦНМВЛ и в Научно-производственной фирме «Медицина.Аналитика.Ветеринария.» в периоде 1998 по 2002 гг.
Для получения антител к эстрадиолу-17 в использовано 10 кроликов самцов породы Шиншилла массой 2,5-3 кг. Для получения антител к иммуноглобулинам G кролика было проиммунизировано 2 козы. Иммунизацию проводили с использованием полного и неполного адъювантов Фрейнда фирмы «Амершам» (Англия). Сыворотку получали путем центрифугирования отобранных образцов крови при 3000 g на центрифуге фирмы «Бекман» (США). Образцы сывороток крови до работы хранили в низкотемпературном холодильнике при минус 70 С. Из полученных в результате иммунизации сывороток крови аффинно на свежеприготовленном сорбенте (BrCN-сефароза - белок А) выделяли иммуноглобулины G кролика и козы. Иммуноглобулины G кролика истощали от антител к носителю - бычьему сывороточному альбумину (БСА) - на свежеприготовленном сорбенте (BrCN-сефароза - БСА). В работе использованы следующие реактивы: конъюгат БСА-эстрадиол фирмы «Фармация» (Швеция), белок А фирмы «Амершам» (Англия), эстрадиол 17-в фирмы «Серва» (Германия), фосфаты и гидрофосфаты натрия и калия, «Серва» (Германия). Работа по аффинной очистке антител проводилась на хроматографическом оборудовании фирмы «ЛКБ» (Швеция). Концентрацию выделенных антител определяли по методу Лоури на спектрофотометре СФ-46 отечественного производства.
Конъюгаты козьих антител и пероксидазы хрена к иммуноглобулинам G кролика получали общепринятым методом перийодатного окисления. В работе использовали пероксидазу хрена, перийодат натрия и борогидрид натрия фирмы «Сигма» (США). Активность полученных конъюгатов оценивали методом иммуноферментного анализа на спектрофотометре вертикального сканирования фирмы ЗАО «Пикон» (Россия) и фирмы «Лабсистемс» (Финляндия).
При постановке иммуноферментного анализа использовали 96-луночные планшеты фирм «Нунк» (Дания), «Костар» (Голландия), «Бекман» (США), «Лабсистемс» (Финляндия), дозаторы с переменным объемом и наконечники фирм «Биохит» и «Лабсистемс» (Финляндия), вибротермостат фирмы «Элми» (Латвия), промывное устройство фирмы ЗАО «Пикон» (Россия) и фирмы «Лабсистемс» (Финляндия).
Для подготовки образцов продукции животного происхождения использовали гомогенизаторы, термостаты и центрифуги отечественного производства, а также следующие реактивы: этиловый эфир, этанол и ацетон отечественного производства, ацетонитрил, гексан и этилацетат фирмы «Мерк» (США).
Количественное определение эстрадиола-17 в проводили в следующих образцах продукции животного происхождения:
Мясо : свежее, охлажденное и мороженое конины, говядины, свинины, баранины, козлятины, кролика, мясо других видов, блоки, мясные полуфабрикаты.
Мясо птицы: свежее, охлажденное и мороженое кур, уток, гусей, индеек, перепелов, индеек тяжелых кроссов.
Колбасы и кулинарные изделия из мяса (говядины, свинины, баранины, конины, субпродуктов) и птицы: колбасы сырокопченые, колбасы полукопченые, колбасы варено-копченые, колбасы вареные, сосиски, сардельки, колбасы и колбаски вареные для школьного питания из мяса и птицы, колбасы ливерные, колбасы кровяные, зельцы, паштеты, студни, соусы, мясные вареные, жареные, запеченные и копчено-запеченные продукты . Консервы из мяса и птицы, консервы мясо-растительные. Субпродукты сельскохозяйственных животных и птиц.
Полуфабрикаты.
Масло коровье, жиры животные.
Яйца и изделия пищевые на яичной основе.
Рыба и рыбопродукты, рыбные консервы.
Кисломолочные изделия, сыры и творожные изделия.
