Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Иммунохимические методы анализа пестицидов 9
1.1. Основные этапы разработки иммунохимических методов анализа пестицидов
1.1.1. Дизайн и синтез гаптенов, конъюгирование гаптенов с белками 10
1.1.2. Получение антител 13
1.1.3. Тестирование антител; оптимизация иммуноанализа 13
1.2. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) 15
1.2.1. Хемшгюминесцентный ИФА 18
1.3. Твердофазный ИФА в проточных системах 21
1.3.1. Иммуносорбенты и методы иммобилизации 23
1.3.2. Неспецифическое связывание в проточных системах 24
1.3.3. Стабильность реагентов в условиях проточного иммуноанализа 25
1.3.4. Регенерация иммуносорбентов 25
1.4. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА) 26
1.4.1. Влияние структуры трейсера на чувствительность ПФИА 29
ГЛАВА 2. Общая характеристика ДДТ, производных и метаболитов 30
2.1. Физико-химические свойства ДДТ и его основных производных 32
2.2. Метаболизм и транспорт ДДТ в окружающей среде 36
2.3. Метаболизм ДДТ и производных в живых организмах 38
2.4. Механизм инсектицидного действия ДДТ 39
2.5. Механизмы токсического действия ДДТ на живые организмы 40
ГЛАВА 3. Методы определения ДДТ в различных природных объектах 42
3.1. Физико-химические методы анализа ДДТ 42
3.2. Иммунохимические методы анализа ДДТ 46
ГЛАВА 4. Материалы и методы 55
4.1. Материалы и оборудование 55
4.2. Методы исследования 57
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 5. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА) ДДТ и производных 71
5.1. Получение меченых производных ДДТ 71
5.2. Тестирование моноклональных антител против ДДТ 73
5.3. Исследование специфичности ПФИА ДДТ 82
5.4. Аналитические характеристики ПФИА ДДТ 84
ГЛАВА 6. Твердофазный иммуноферментный анализ ДДТ 90
6.1. Оптимизация ИФА ДДТ 90
6.1.1. Изучение сорбционного поведения конъюгата на поверхности планшетов; исследование влияния температуры и времени проведения стадий на вид калибровочных кривых ИФА ДДТ 91
6.1.2. Исследование влияния физико-химических факторов на стадию конкуренции 97
6.1.3. Влияние органических растворителей на чувствительность твердофазного ИФА ДДТ и суммы производных ДДТ 102
6.1.4. Исследование специфичности твердофазного ИФА ДДТ 105
6.1.5. Стабильность ИФА ДДТ 107
6.2. Твердофазный ИФА ДДТ в водах различного происхождения 109
6.2.1. Твердофазный ИФА ДДТ в водопроводной и минеральной воде 109
6.2.2. Твердофазный ИФА ДДТ в поверхностных водах 111
6.3. Твердофазный ИФА ДДТ в почве и продуктах питания 116
ГЛАВА 7. Иммуноферментный анализ ДДТ в проточной системе 120
7.1. Получение и свойства носителей для ИФА ДДТ в проточной системе 120
7.2. Выбор схемы проведения иммуноферментного анализа ДДТ в проточной
системе 122
7.2.1. Конкурентная схема ИФА ДДТ в проточной системе с использованием
конъюгатов антивидовых антител с пероксидазой хрена 122
7.2.2. ИФА ДДТ в проточной системе с использованием конъюгатов
моноклональных антител с пероксидазой хрена 126
7.2.2.1. Получение и тестирование конъюгатов моноклональных антител с пероксидазой хрена методом твердофазного ИФА на планшетах 126
7.2.2.2. Тестирование конъюгатов антител против ДДТ с пероксидазой в проточной системе 128
7.3. Оптимизация условий проведения ИФА ДДТ в проточной системе 130
ВЫВОДЫ 136
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 13 8
- Основные этапы разработки иммунохимических методов анализа пестицидов
- Физико-химические свойства ДДТ и его основных производных
- Физико-химические методы анализа ДДТ
Введение к работе
В настоящее время в результате хозяйственной деятельности человека в биосфере циркулирует большое число различных чужеродных для человека и животных соединений. Из органических соединений выделены приоритетные, так называемые стойкие органические загрязнители (СОЗ), которые представляют наибольшую опасность для окружающей среды. В группу СОЗ входит и хлорорганический инсектицид ДДТ, применение которого в развитых странах было запрещено в 70-ых годах прошлого века, а в развивающихся странах ДДТ до сих пор используют для борьбы с насекомыми - переносчиками болезней.
ДДТ и его производные характеризуются высокой кумулятивной способностью и устойчивостью в условиях окружающей среды. Вследствие этого возникает проблема загрязнения воды, почвы и продуктов питания остаточными количествами ДДТ и его метаболитов. Вместе с тем попадание в организм человека пестицидов группы ДДТ с пищевыми продуктами приводит к накоплению этих соединений в жировых тканях, что может представлять потенциальную опасность ввиду возможного проявления токсических эффектов пролонгированного действия. Данные факты свидетельствуют о необходимости контроля над содержанием пестицидов группы ДДТ, как в природных объектах, так и в биологических образцах.
Методы высокоэффективной капиллярной газовой хроматографии, в основном используемые для анализа пестицидов группы ДДТ, имеют ряд недостатков, в частности для них характерны трудоемкая и длительная пробоподготовка, использование дорогостоящей аппаратуры (тандем-приборов с несколькими детекторами), недостаточная надежность и специфичность, связанные с разложением ДДТ в ходе анализа и одинаковым временем удерживания пестицидов группы ДДТ и полихлорированных бифенилов. Вследствие высокой стоимости анализа такие методы неприменимы для массового скрининга реальных образцов. Поэтому актуальной является разработка специфичных, чувствительных, надежных, точных, относительно простых и экспрессных методов анализа пестицидов группы ДДТ, удовлетворяющих установленным гигиеническим нормам. Этим требованиям отвечают иммунохимические методы анализа, которые получили широкое распространение для осуществления мониторинга остаточных
количеств пестицидов в объектах окружающей среды. В зависимости от конкретных прикладных задач используют различные варианты иммунохимических методов анализа. Гомогенный поляризационный флуоресцентный иммуноанализ позволяет быстро охарактеризовать иммунореагенты и провести первичный скрининг образцов. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) на планшетах позволяет определять концентрацию пестицидов в образцах с высокой точностью, в то время как ИФА в проточной системе используется для массового скрининга образцов, когда за короткое время необходимо установить факт наличия или отсутствия пестицидов в пробах. Применение высокочувствительной хемилюминесцентнои системы детекции основанной на реакции усиленной хемилюминесценции позволяет сократить время анализа Описанные в литературе иммлчгохимические методы анализа ТТТТТ основаны на принттт-гпах твеплоЛіязного TTcdA на планшетах или пробирках со спектрофотометрической детекцией Для них характерны
ТТедоГТЯТП^ТТТЯ ST ЧЛ/ПҐчТ1ТІХТТ^хТТТчТТОҐ*'ТТ» ттр/л ГТТТО'ПО TTTTOf* TTf^nf^T^T^f^f^THY^f* ТІеаГІТТІПКЯНtTF* в
TT^VTTTTf1 TTfsf*T,ITTriTrTOR /T/T 1^ а 'ПґЧС'ЯСЄ* Г^ТТЯЧТТТ1/:*ТТТ.Т4Т»Т* ттду\ртлг\ррггттттр ТІР^аТСТТТ-ТТ-Т Г* TTT^\/T~4T1VTXT
х ТТҐ^ТЛҐїТЛТ"1ЯТ1ТТЧ(:*Г*ТТ"ЇЛ/ТТ'Т ТТб^ґ'ТТ-ТТТТ-'ТТТЯЛ/ТТ-Т Т"^Ґ\ТПЛС"\Ґ* Т^"аГ*ї1ТОТТТТТМГ*ЇГ ПТТТТ/ТЛ/їТПЯТТХ-ГТ'Г \АҐ* TTORWIT
-у-т-уч ґ~\ xj ґ> тт ґ* TJTЛ О" О Х-Г*Э ТТТуГ'Э С\ ТТґ"* i^HPT-fTfTJ ТТҐЛТ2 1 *tW ГТТТТЧ-Т Jl Jl Т TJ г2'01'тЯҐ*ТХ'АіН*\Ґ*гТгЇХ Arr t» s~\ ттт,^"|Л OT'TJf^ir'f^
объекта
Целью работы является разработка иммунохимических методов анализа пестицидов группы ДДТ и оптимизация методов для определения этих пестицидов в природных объектах (воде, почве, продуктах питания и биологических образцах). Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
охарактеризовать иммунохимические реагенты - моноклональные антитела и антигены методом ПФИА, для чего получить меченые флуоресцентной меткой производные антигенов (трейсеры), подобрать сочетания иммунореагентов для разработки ИФА;
исследовать влияние различных параметров и подобрать оптимальные условия проведения твердофазного ИФА ДДТ с хемилюминесцентнои детекцией на планшетах и в проточной системе;
определить аналитические характеристики разработанных методик и провести их апробацию на модельных системах и реальных образцах.
Основные этапы разработки иммунохимических методов анализа пестицидов
Разработку иммунохимических методов анализа проводят, принимая во внимание вышеизложенные критерии. Основные этапы разработки иммунохимических методов анализа следующие:
1. Дизайн и синтез гаптенов, конъюгирование гаптенов с белками;
2. Получение антител;
3. Тестирование антител, оптимизация иммуноанализа; анализ реальных образцов; определение надежности иммуноанализа.
1.1.1. Дизайн и синтез гаптенов, конъюгирование гаптенов с белками
У большинства пестицидов отсутствуют реакционно-способные группы, поэтому приходится использовать производные пестицидов (гаптены). Гаптен обычно представляет собой производное пестицида, содержащее спейсерный мостик с функциональной группой, необходимой для связывания с белком-носителем. Наиболее часто используются карбоксильные и аминопроизводные пестицидов [2].
Дизайн структуры гаптенов начинают с изучения свойств определяемого пестицида (физико-химические свойства, стабильность в лабораторных и природных условиях, пути деградации и основные метаболиты) и определения требований, предъявляемых к специфичности антител (класс-специфический анализ или анализ на индивидуальный антиген) [3]. Большое значение имеет объект иммуноанализа, так как в некоторых случаях происходит модификация пестицида компонентами матрикса образца, и необходимо проводить анализ производных пестицида. На основании полученных данных выбирают молекулу-мишень и проводят анализ электронных и пространственных свойств этой молекулы. Для этих целей в последнее время применяются методы молекулярного моделирования, которые позволяют провести расчет электронной конфигурации молекулы и определить ее пространственные характеристики [4, 5]. Исходя из структуры и свойств молекулы-мишени, выбирают структуры гаптенов для иммунизации и для анализа [6].
Требования к структуре гаптенов для иммунизации и гаптенов для анализа различаются [7]. В гаптене для иммунизации должны быть максимально сохранены химическая структура, распределение электронной плотности и пространственная конфигурация молекулы-мишени. Введение спейсерного мостика не должно затрагивать характеристические структурные фрагменты и функциональные группы молекулы-мишени. Так как антитела распознают дистальную по отношению к спейсерному мостику часть молекулы гаптена, то все предполагаемые антигенные детерминанты молекулы-мишени должны быть расположены в этой части гаптена. Спейсер вводят преимушественно через атомы углерода, так как при этом в меньшей степени нарушается пространственная и электронная конфигурация исходной молекулы. Химическая структура и длина спейсерного мостика должны быть выбраны таким образом, чтобы минимизировать иммунный ответ на спейсерный мостик при сохранении доступности гаптена для иммунной системы. Спейсерный мостик не должен содержать гетероатомов или электроно-насыщенных групп, оптимальная длина спейсерного мостика - 3-6 атомов [2].
Физико-химические свойства ДДТ и его основных производных
Технический препарат ДДТ представляет собой твердое воскообразное вещество, в то время как чистый ДДТ - белое кристаллическое вещество без запаха. Лучшими растворителями ДДТ являются кетоны, эфиры низших жирных кислот, ароматические углеводороды и галогенпроизводные углеводородов жирного и ароматического рядов.
Основным способом получения ДДТ является конденсация хлорбензола с хлоралем:
2 С1С6Нз + ССЬСНО - (С1C6H4)2СHCC1з + н2О Эта реакция протекает в присутствии конденсирующих средств: концентрированной серной кислоты, олеума, хлорсульфоновой и фторсульфоновой кислот, фтороводорода, безводного хлорида алюминия и др. В промышленности чаще всего использовалась конденсация хлораля с хлорбензолом в присутствии серной кислоты или слабого олеума при температуре не выше 20 С, так как при более высокой температуре резко возрастает количество п-хлорбензолсульфокислоты, образующейся в качестве побочного продукта. Основными препаратами ДДТ являлись дусты, концентрированные эмульсии, смачивающиеся порошки, препараты для мелкокапельного опрыскивания, а также аэрозольные составы.
Технический препарат ДДТ представляет собой сложную смесь соединений, содержание л,и-изомера в которой доходит до 65-80%. Содержание о,«-измера ДДТ составляет 15-21%, и,«-ЩЩ (1,1-дихлор-2,2-бис(«-хлорфенил)этан) - свыше 4%. Было также обнаружено, что в технических препаратах ДДТ содержится до 10% полихлорированных бифенилов (ПХБ) и диоксинов [88]. Из всех изомеров ДДТ и примесей инсектицидными свойствами обладает только n,n-J\J\l [89]. Структурный аналог ДДТ - дикофол (2,2,2-трихлоро-1,1-бис(4-хлорфенил)этанол) - является эффективным митицидом и акарицидом.
Химические свойства ДДТ определяются наличием в его составе ароматических колец и трихлорметильной группы [90]. Чистый ДДТ термически устойчив. Разложение его начинается при 195 С и протекает по схеме:
(С1СбН4)2СНСС1з (С1СбН4)2С=СС12 + НС1
Примеси солей железа (особенно хлорного железа) резко снижают температуру разложения ДДТ, в присутствии 0.01% хлорного железа она снижается до 120 С. При разложении ДДТ под влиянием солнечного света протекают следующие реакции: (СЮбЩЬСНССЬ + 2С2Н5ОН 2СНзСНО + (С1СбН4)2СНСС1=СС1СН(С6Н4С1)2 +
4НС1 В присутствии кислорода воздуха процесс идет дальше, и получается п,п-дихлорбензофенон:
(С1СбН4)2СНСС1=СС1СН(С6Н4С1)2 - [(С1C6H4)2C=C=С=С(C6H4C1)2] СО(СбН4С1)2 + 2С02 По-видимому, такие процессы протекают и в листьях растений. Гидролиз ДДТ водой происходит по схеме:
(С1СбН4)2СНСС1з + 2 НзО (СЮбЩЬСНСООН + 3 НС1 При комнатной температуре эта реакция протекает медленно. Едкие щелочи, известь, гидрат оксида бария, другие щелочные агенты повышают скорость гидролиза ДДТ. Первой стадией реакции ДДТ с щелочами является отщепление хлористого водорода и образование ди-ДДЭ (1,1-дихлор-2,2-бис(«-хлорфенил)этилен), который далее при более высокой температуре переходит в «,и-ДДУ (2,2-бис(«-хлорфенил)уксусная кислота).
(С1СбН4)2СНСС1з + КОН - (С1СбН4)2С=СС12 + КС1 + Н2О ДДТ способен вступать в реакции теломеризации, образуя малотоксичные для насекомых продукты:
(С1СбН4)2СНСС1з +JcCH2=CH2 - (С1СбН4)2СНСС12(СН2СН2)хС1 В связи с этим при продолжительном стоянии растворов ДДТ в непредельных углеводородах происходит уменьшение токсичности препарата. Особенно быстро эта реакция протекает при повышенной температуре и на свету.
Основные метаболиты ДДТ - ДДД и ДДЭ - являются побочными продуктами производства ДДТ и образуются в результате деградации ДДТ в природных условиях. Конечным продуктом деградации ДДТ в природе является ДДУ. о, и-ДДТ также подвергается деградации в природных условиях с образованием о,«-ДДЭ, о,п-ДДД и о,л-ДДУ [91]. Структуры изомеров и метаболитов ДДТ приведены на рис. 4. Основные физико-химические свойства ДДТ и метаболитов приведены в табл. 3.
Физико-химические методы анализа ДДТ
Чаще всего для определения пестицидов группы ДДТ применяют методы газовой хроматографии (ГХ). Предложено большое число вариантов таких методов, условий проведения и способов детектирования. Чаще всего используют селективные детекторы, такие как детектор электронного захвата (ЭЗД), электрохимический детектор Холла (ДХ) и термоионный (ТИД) детектор; а также универсальные детекторы: пламенно-ионизационный (ПИД), масс спектрометрический (МС) и атомно-эмиссионный детектор (АЭД), и комбинации этих детекторов [134]. Наиболее часто используется ЭЗД, так как он обладает высокой селективностью по отношению к хлорорганическим пестицидам. Методы высокоэффективной капиллярной газовой хроматографии (ВКГХ) позволяют проводить определение индивидуальных компонентов в сложных смесях, содержащих десятки различных соединений. Так в работе [135] для газохроматографического разделения (с масс-спектрометрическим детектированием в режиме SCAN) 18 хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов (ПХБ) применяли капиллярные колонки из плавленого кварца различной длины с неподвижной фазой различной полярности. Однако традиционные газохроматографические методы могут давать неадекватные результаты вследствие 1) деградации ДДТ во время проведения анализа до ДДЭ и ДДД; 2) влияния матрикса образца на процесс деградации ДДТ во время анализа и 3) одновременной элюции производных ДДТ и ПХБ. Поэтому были разработаны специальные приемы для повышения надежности этих методов.
Деградация ДДТ во время газохроматографического анализа происходит в системе испарения газовых хроматографов. Использование специальных материалов для обработки испарителей, а также постоянный мониторинг состояния испарителей позволяют снизить процент деградации ДДТ [134]. Использование методик дериватизации позволяет дополнительно повысить надежность идентификации пестицидов группы ДДТ. Каталитическое гидродехлорирование производных ДДТ осуществляют непосредственно в испарителе хроматографа (катализатор - Pt или Pd, Т=200 С), затем продукты реакции хроматографируют на капиллярной колонке и идентифицируют по временам удерживания [136]. Каталитическое дехлорирование производных ДДТ проводят во вкладыше хроматографа, заполненного катализатором (1% PdCl2 на хромосорбе и 12 мг/г NaOH), затем разделяют их на капиллярной колонке и детектируют при помощи ПИД [137]. В работе [138] были получены метил-третбутиловые эфиры хлорорганических пестицидов, которые затем анализировали методом ВКГХ/ЭЗД.
Некоторые ПХБ типа Арохлор 1260 имеют такое же время удерживания, что и производные ДДТ, при проведении ГХ, тонкослойной хроматографии (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [139]. Было предложено несколько методов, позволяющих разделять эти соединения. Так в работе [140] был предложен метод разделения этих веществ при помощи УФ-иррадиации. Предел обнаружения метода - 0.22 мкг/кг ДДТ и ДДЭ. В работе [139] проводили обработку экстрактов, содержащих ПХБ и ДДЭ, триоксидом хрома. При этом ДДЭ окислялся до п,п-дихлоробензофенона, время удерживания которого отличается от времени удерживания ПХБ.
Для извлечения ДДТ и производных из образцов применяются различные методы экстракции. Жидкость-жидкостная экстракция (ЖЖЭ) различными растворителями применялась в работах [141, 142]. Однако для такой экстракции характерны использование больших количеств органических растворителей и значительные временные затраты. Поэтому в последнее время используют новые методы экстракции, к которым относятся твердофазная экстракция и твердофазная микроэкстракция (ТФЭ и ТФМЭ), сверхкритическая экстракция (СКЭ), ускоренная жидкостная экстракция (УЖЭ) и микроволновая экстракция (МВЭ). Твердофазную экстракцию осуществляют на дисках или картриджах. Твердофазную микроэкстракцию на С18-дисках (ГХ/МС) применяли для определения ДДТ и производных в лекарственных травах [143]. В этом же объекте проводили сверхкритическую жидкостную экстракцию СОз (ГХ/МС и ГХ/ЭЗД) [144]. В работе [145] для извлечения ДДТ из почвы применяли сверхкритическую экстракцию С02. Открытие метода составило 70%, для анализа требуется 10 г почвы. Основными факторами, влияющими на эффективность экстракции, являются уровень содержания воды и органического вещества в почве. Таким образом, неполное извлечение ДДТ в данном случае связано с высоким содержанием органических веществ в почве. При анализе жира [146] использовали препаративные колонки из глинозема и силикагеля с СОз, модифицированным метанолом (2%), в качестве подвижной фазы. В этом случае открытие составило 1.66+0.05 мг/кг о,«-ДДТ. Сверхкритическая экстракция применялась также для определения содержания ДДТ в продуктах питания. Сверхкритическую жидкостную экстракцию С02 использовали для определения хлорорганических пестицидов в яйцах [147]. Использовали флорисиловые картриджи, пестициды элюировали смесью ацетона и гексана и анализировали методом ГХ/ЭЗД. В работе [148] для улучшения диспергирования образцов и удаления воды применяли специальные сорбенты. Открытие метода для всех исследованных образцов (морковь, салат, картофель, арахисовое масло и др.) превысило 85%.
