Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Систематика рода Solarium и происхождение картофеля 8
1.1.1. Происхождение и систематика видов Solarium, относящихся к серии Tuberarium (Buk.) или Petota (Hawkes) 8
1.1.2. История культивируемых видов Solarium (картофеля) 11
1.2. Идентификация сортов и видов Solarium на основе морфологических признаков и биохимических маркеров 22
1.3. Методы ДНК генотипирования растений и их использование в генетике, селекции и семеноводстве культурных растений 25
1.3.1. Полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов (Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLP) и его использование для генотипирования растений 26
1.3.2. Минисателлиты 28
1.3.3. Методы, основанные на полимеразной цепной реакции 29
1.3.3.1. Полиморфизм ДНК, амплифицированной случайным образом (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) 30
1.3.3.2. Охарактеризованная последовательность амплифицированного участка ДНК (Sequence Characterized Amplified Region, SCAR) 33
1.3.3.3. Методы, основанные на полиморфизме микросателлитных последовательностей растительного генома 34
1.3.3.4. Последовательности между простыми повторяющимися последовательностями (Inter-Simple Sequence Repeats, ISSR) 42
1.3.4. Методы, занимающие промежуточное положение между методами, основанными на гибридизации, и PCR-методами 44
1.3.4.1. Полиморфизм по длине амплифицированных фрагментов (Amplified Fragment Length Polymorphisms, AFLP) 44
1.3.4.2. Методы, основанные на полиморфизме амплифицированных ретротранспозон-специфических последовательностей (Retrotransposon-based Sequence-Specific Amplification Polymorphism, SSAP) 48
1.3.4.3. Полиморфизм амплифицированных и отрестриктированных последовательностей (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence, CAPS) 49
1.4. Сравнительная оценка методов ДНК генотипирования 51
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 54
2.1. Растительный материал 54
2.2. Методы ДНК анализа 55
2.2.1. Выделение геномной ДНК из тканей растений 56
2.2.1.1. Приготовление растворов, используемых для выделения геномной ДНК 58
2.2.2. Условия проведения ПНР 59
2.2.3. Детекция продуктов реакции 60
2.3. Кластерный анализ 61
2.4. Анализ результатов полиморфизма умеренных повторов 64
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 66
3.1. Воспроизводимость метода 66
3.2. Полиморфизм умеренных повторов среди видов Solarium 68
3.3. Полиморфизм умеренных повторов внутри видов Solarium 72
3.4. Изучение процесса интрогрессии генетического материала с помощью анализа полиморфизма умеренных повторов 75
3.5. Границы разрешения метода анализа полиморфизма умеренных повторов 81
4. ОБСУЖДЕНИЕ 82
4.1. Возможности использования метода анализа полиморфизма умеренных
повторов для изучения генетического разнообразия форм Solarium 82
4.2. Исследование межвидовых связей рода Solarium с помощью полиморфизма умеренных повторов и сравнительный анализ полученных результатов с данными фенотипической и молекулярной систематики Solarium, полученными другими авторами 85
4.3. Исследование полиморфизма умеренных повторов у разных форм S. tuberosum и сравнение полученных результатов с селекционной историей сортов 96
4.3.1. Исследование полиморфизма умеренных повторов у раннеспелых сортов картофеля и сравнительный анализ полученных результатов с их родословными 102
4.3.2. Исследование полиморфизма умеренных повторов у сортов картофеля, в селекции которых участвовал S. stoloniferum 105
4.3.3. Исследование полиморфизма умеренных повторов у сортов картофеля, в селекции которых участвовал S. chacoense 106
4.3.4. Исследование полиморфизма умеренных повторов у американских сортов картофеля и сравнительный анализ полученных результатов с их родословными 108
4.3.5. Исследование полиморфизма умеренных повторов у нематодоустойчивых сортов картофеля и сравнительный анализ полученных результатов с их родословными 114
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 116
ВЫВОДЫ 118
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 119
ПРИЛОЖЕНИЕ 1 130
ПРИЛОЖЕНИЕ 2 132
- Происхождение и систематика видов Solarium, относящихся к серии Tuberarium (Buk.) или Petota (Hawkes)
- Методы ДНК анализа
- Полиморфизм умеренных повторов среди видов Solarium
Введение к работе
Большинство сортов картофеля являются сложными межвидовыми гибридами. На протяжении всей истории селекции картофеля важнейшие закономерности его изменчивости и наследственности изучались по преимуществу путем анализа полиморфных морфологических признаков, которые легли в основу общепринятой системы описания сортов картофеля (Зайцева, 1965, Костина, 1985, UPOV, 1986). Однако проявление фенотипических признаков сильно зависит от условий произрастания и фазы развития растения, что затрудняет оценку сортов и требует проведения трудоемких повторных наблюдений. Особенно сложно различать генотипы на первых этапах селекционного процесса (отбор в популяциях), когда оценивают большую выборку индивидуальных растений. Поэтому генетика, селекция и систематика картофеля остро нуждаются в новых методах получения объективной информации о свойствах генотипа. Начиная с середины 1960 гг., в качестве генетических и селекционных маркеров используются белки, однако со временем оказалось, что число идентифицированных таким образом локусов невелико, а проявление признака связано с определенным этапом развития растений и зависит от условий среды. За последнее время быстрое развитие получили ДНК технологии, которые позволяют оценить внутривидовое разнообразие и генотипировать культурные растения с целью идентификации сортов и защиты авторских прав селекционеров. По сравнению с методами, основанными на анализе фенотипических признаков, методы ДНК анализа обладают высоким разрешением и хорошо воспроизводимы. Они помогают восстановить близкородственные связи, которые играют важную роль при подборе родительских форм в процессе селекции, и позволяют проследить за интрогрессией генетического материала дикорастущих форм в культурные растения.
Известно, что большая часть генома растений представлена некодирующими повторяющимися последовательностями. К сожалению, у
представителей рода Solarium генетический полиморфизм повторяющихся последовательностей исследован совершенно недостаточно, и методы генотипирования по этим фрагментам генома остаются в основном эмпирическими.
Для анализа генетического разнообразия картофеля и его
дикорастущих сородичей мы использовали праимеры PawS, которые были
сконструированы для анализа умеренно повторяющихся
последовательностей генома ржи, известных как семейство повторов R173 (Rogowsky et al., 1992). Ранее проведенные в нашей лаборатории исследования показали, что эти праимеры пригодны для анализа полиморфизма растений других семейств растений, включая Solanaceae (Зайцев, Хавкин, 2001).
Целью данной работы было изучить возможности использования полиморфизма умеренных повторов для различения сортов картофеля и его дикорастущих сородичей.
В задачи исследования входило:
- исследовать генетическое разнообразие умеренных повторов геномной ДНК у дикорастущих форм Solarium, вовлечённых в процесс селекции картофеля;
- выявить интрогрессию генетического материала дикорастущих сородичей картофеля в современные сорта картофеля;
- исследовать генетическое разнообразие умеренных повторов геномной ДНК у культурных форм картофеля;
4. - провести сравнительный анализ полиморфизма умеренных
повторов у близкородственных (сибсы и полусибсы) и отдалённых (сорта
важнейших групп селекции) форм картофеля и оценить разрешающую
способность умеренных повторов как дескрипторов для различения сортов;
5. - сопоставить полученные результаты с родословными сортов и
данными фенотипической и молекулярной систематики Solarium,
полученными другими авторами.
Научная новизна. На примере выборки размером более 180 генотипов Solarium впервые показана возможность использования умеренных повторов генома как дескрипторов для различения видов Solarium и сортов картофеля, в том числе близкородственных (сибсы и полусибсы).
Практическая значимость. Показано, что анализ умеренных повторов генома доступен для селекционных и контрольных лабораторий в качестве метода оценки и систематизации генетического разнообразия форм Solarium.
Происхождение и систематика видов Solarium, относящихся к серии Tuberarium (Buk.) или Petota (Hawkes)
Картофель относится к большому семейству Solanaceae (Пасленовые), широко распространённому по всему миру. Внутри этого семейства Arsy (1991) выделяет 96 родов и 2300 видов; Judd et al. (1999) 147 родов и 2930 вида, a Hunziker (2001) 92 рода и 2300 вида. Кроме картофеля, семейство Solanaceae включает несколько экономически ценных культурных растений: баклажаны, сладкий и чили перец, петуния, табак, томаты и др. Картофель относится к обширному роду Solarium Tourn., который насчитывает более 2000 видов; подавляющая их часть видов происходит из Центральной и Южной Америки и Африки (Жуковский, 1964).
Виды картофеля резко различаются по морфологическим признакам, биологическим и физиологическим особенностям и биохимическим свойствам. До настоящего времени ещё нет единой классификации клубнеобразующих видов Solarium (Бацанов, 1970).
В систематике видов Solarium, используемых в селекции, существует три различных направления: 1. отечественные систематики СМ. Букасов и СВ. Юзепчук; 2. английский систематик Дж. Хокс; 3. английский систематик Д. Коррелл (Букасов, 1966).
Серии секции Tuberarium подразделяются на две географические группы: южноамериканскую и североамериканскую. По форме венчика серии объединены в две группы - 1) с колесовидным (пятиугольным) венчиком - Rotata и 2) со звездчатым венчиком - Stellata (Букасов, 1971).
Форма венчика - примитивная звездчатая (stellata) или более продвинутая колесовидная (rotata) - является существенным таксономическим признаком для клубнеобразующих видов подсекции Potatoe. Согласно Hawkes (1990), виды Solarium со звездчатым или колесовидным венчиком должны объединяться в соответствующие надсерии. Примечательно, что как показали Volkov et al. (2001), 5S rDNA остается очень схожей у некоторых видов Solarium с различной морфологией цветка. Согласно данным этих исследователей, надсерия Stellata, очевидно, имеет полифилетическую природу, и положение видов серии Yungasensa (S. chacoense) должно быть заново пересмотрено. Что касается морфологии stellata, эти виды первоначально располагались вместе с S. commersonii в сер. Commersoniana (Букасов, 1978; Correll, 1962; Hawkes, 1978), но позже были отнесены к сер. Yungasensa (Hawkes, 1990).
По данным Volkov et al. (2001), надсерия Rotata имеет монофилетическое происхождение, потому что все виды rotata, за исключением bukasovii, содержат ту же самую делецию (DEL 7).
Букасов включает в секцию Tuberarium виды 32 серий, перечисленных ниже. Эти серии объединены в пять подсекций. Южноамериканские - 1. Orientale Buk., 2. Pacificum Buk., 3. Andinum Buk.; североамериканские - 4. Arcticum Buk., 5. Stellatum Buk. (Букасов, 1970).
Серию Tuberosa Букасов и его сотрудники разделили на серии Demissa, Longipedicellata и ряд южноамериканских серий подсекций - Andinum и Pacificum. Объём серии Tuberosa ограничили лишь тихоокеанскими видами. Серию Pinnatisecta Rydb. подразделили на серии Cardiophylla, Commersoniana и Glabrescentia (Букасов, 1970). В целом система подсекций, серий и видов картофеля рода Solanum по Букасову (1970) выглядит так, как показано на рис. 1.
Система серий Букасова существенно отличается от системы Хокса. По сравнению с Букасовым (1966), Хокс укрупнил некоторые серии и виды картофеля, в том числе и культурные. Он включает серию Glabrescentia в состав серии Commersoniana, тогда как Букасов выделяет их в самостоятельные серии, аргументируя это тем, что они отличаются не только
Методы ДНК анализа
Для генотипирования видов Solarium и сортов картофеля мы исследовали полиморфизм умеренных повторов, используя праимеры, узнающие умеренные повторяющиеся последовательности из семейства R173 элементов ржи. Это семейство содержит около 15000 копий (R173 элементов) в диплоидном геноме ржи, которые равномерно распределены по всем семи хромосомам. Rogowsky et.al. (1991) сконструировали геномную библиотеку для анализа генетической организации семейства специфических для ржи повторяющихся последовательностей ДНК R173. С помощью пяти праймеров (Таблица 4) были получены маркеры, которые были впоследствии использованы для картирования генома ржи и пшеницы. (Rogowsky et al., 1991). Эти праимеры характеризуют различные участки повторяющегося элемента R173, картированного вблизи центромеры на хромосомном плече IRS (Rogowsky et al., 1992).
Проведённые ранее в нашей лаборатории исследования показали, что эти праимеры можно использовать для генотипирования широкого круга растений, в том числе и семейства пасленовые (Зайцев, Хавкин, 2001).
Несмотря на то, что о природе этих последовательностей у видов Solarium нам известно немного, они достаточно полиморфны и хорошо различают виды Solarium и сорта картофеля. С помощью компьютерной программы OLIGO 6 для каждого праймера была определена температура отжига: PawS 5 - 56С, PawS 6 - 45С, PawS 11 -36С, PawS 16 - 55С, PawS 17 - 50С. В случае сочетания праймеров температура отжига для ПЦР-реакции подбиралась с учётом температур отжига обоих праймеров.
По результатам предварительных исследований мы отобрали праймеры PawS 5, PawS 6, PawS 11, PawS 16 и комбинацию праймеров PawS 5 + PawS 16. Праймер PawS 17 не подходит для генотипирования Solanum, о чем свидетельствует отсутствие продуктов амплификации в агарозном геле.
Воспроизводимость - важнейший критерий при оценке метода ДНК генотипирования. Считается, что RAPD метод плохо воспроизводим, так как этот анализа ДНК последовательностей использует короткие десятинуклеотидные праймеры, имеющие низкую температуру отжига и подобранные случайным образом. В отличие от RAPD метода, для анализа полиморфизма умеренных повторов мы использовали праймеры размером 18 п.н. каждый. Температура отжига праймеров, используемых в работе находится в пределах от 40 - 55С, что также улучшает воспроизводимость метода. Генотипирование растений на основе умеренных повторов состоит из нескольких этапов:
Полиморфизм умеренных повторов среди видов Solarium
Для анализа полиморфизма умеренных повторов у картофеля было исследовано около 140 форм, представляющих сорта и гибриды, созданные в важнейших центрах отечественной и зарубежной селекции с участием генетического материала различных дикорастущих и культурных видов Solarium; особое внимание уделялось близкородственным сортам, имеющим одного (полусибсы) или двух общих родителей (сибсы).
В результате проведенного анализа было получено 168 дескрипторов. Наибольший полиморфизм наблюдали при использовании праймеров PawS6 и PawS 16 (42 и 37 полиморфных фрагмента) (рис. 24 а, б). Пары праймеров PawSl 1 (рис. 24 в) и PawS 16 + PawS 5 (рис. 25 б) давали равное количество полиморфных фрагментов (31 фрагмент). Праймер PawS 5 (рис. 25 а) оказался наименее информативными из всех пар праймеров, с ним было получено всео 27 фрагментов ДНК. Наиболее информативным праймером оказался праймер PawS 6. Пяти праймеров оказалось достаточно для различения видов Solarium и сортов картофеля.
Спектры амплификации ДНК сортов картофеля, полученные с праймером PawS 5 и праймерами PawS 16 и PawS 5, содержат одинаковые фрагменты размером 1,3 т.п.н. и 0,9 т.п.н. Эти фрагменты обозначены стрелками на рис. 23. Наличие общих фрагментов объясняется тем, что в первом случае PawS 5 используется в качестве прямого и обратного праймера для ПНР реакции, а в сочетании с PawS 16 этот праймер выступает в роли обратного праймера.
Поскольку практически все современные сорта картофеля являются сложными межвидовыми гибридами, большой интерес представляет возможность использования методов ДНК анализа для изучения интрогрессии фрагментов генома от диких видов в культурные сорта картофеля. По данным Росса (1989), большинство европейских сортов картофеля являются демиссоидами - гибридами S. tuberosum и S. demissum, который является основным донором генов устойчивости к фитофторозу, раку картофеля и колорадскому жуку. В спектрах умеренных повторов мы обнаружили фрагменты, общие для дикорастущих видов Solarium и сортов, в происхождении которых участвовали эти виды (рис. 26, рис. 27, рис. 28, рис. 29). Фрагменты ДНК, которые переходят из генома дикорастущих видов в культурный картофель, можно рассматривать как потенциальные видоспецифичные маркеры, и в дальнейшем их идентификация позволит значительно облегчить исследование процесса интрогрессии.
То обстоятельство, что фрагменты, общие с дикорастущими сородичами, принимавшими участие в селекции данного сорта, не всегда обнаруживаются в культурных растениях можно объяснить двумя причинами: (1) каждый из дикорастущих видов характеризуется большим внутривидовым полиморфизмом, и в настоящее время нельзя установить, какие конкретные генотипы дикорастущих видов были использованы в качестве родительских форм при создании исследуемых сортов картофеля; (2) некоторые фрагменты генома, связанных с R173 элементами, могли быть элиминированы в беккроссах. Обнаруженные общие фрагменты представляют особый интерес, если они связаны с конкретным хозяйственным признаком, ради которого проводили интрогрессию. Однако чтобы это доказать, потребуется клонировать и секвенировать этот фрагмент из картофеля и дикорастущего вида и установить его связь с признаком с помощью независимых методов.
