Введение к работе
Актуальность проблемы. Анализ известных точечных мутаций в ДНК является одним из основных направлений современной ДНК-диагностики и находит широкое применение при выявлении предрасположенности человека к различным наследственным заболеваниям, при анализе устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам, в миграционных исследованиях, а также в фармакогеномике
Существующие методы детекции известных точечных мутаций можно разделить на две группы В одной группе методов анализ мутаций проводится после амплификации исследуемого участка ДНК. Точечные мутации обнаруживают по расщеплению анализируемых фрагментов ДНК соответствующими рестриктазами, с помощью аллель-специфической гибридизации или удлинения праймера на один нуклеотид. Ко второй группе методов относятся те, в которых амплификация является частью системы детекции Эти методы основаны на лигировании специфических олигонуклеотидных зондов в месте потенциальной мутации и аллель-специфической полимеразной цепной реакции. Тем не менее, при всем существующем многообразии методов не один из них пока не является полностью подходящим для клинического использования К общим недостаткам методов первой группы, ограничивающим их применение в клинической практике и крупномасштабных исследованиях, можно отнести трудоемкость, наличие стадии постреакционной обработки продуктов амплификации (это способствует контаминации), долгое время анализа и низкую производительность. Кроме того, наиболее используемый в клинической диагностике метод первой группы, основанный на анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, имеет существенные ограничения по применению, поскольку требует наличия сайта рестрикции в месте предполагаемой мутации Методы второй группы являются более предпочтительными с точки зрения использования их в клинической практике, т к. они позволяют проводить генотипирование в одну стадию, что сокращает время анализа и значительно упрощает анализ Однако, эти методы также являются малопроизводительными, что ограничивает их широкое применение. Кроме того, метод аллель-специфического олигонуклеотидного лигирования характеризуется низким выходом продукта реакции. Таким образом, разработка новых, удобных в эксплуатации, быстрых, высокопроизводительных и надежных методов детекции известных точечных мутаций в ДНК является актуальной задачей современной биотехнологии
Результаты многочисленных научных исследований, полученные при изучении структуры и организации геномной ДНК животных, растений и микроорганизмов, существенным образом отразились на методологии их систематизации, ранее основанной, главным образом, на анализе фенотипических признаков Проблема адекватного отнесения
конкретного организма к той или иной группе не является чисто академической Основанная на точных критериях систематика живых организмов, определяющая эволюционное родство между ними, помимо чисто теоретического представляет и большой практический интерес. В частности, определение источника патогенных микроорганизмов при больничных инфекциях позволило бы выработать эффективные меры зашиты против их распространения. Идентификация микроорганизмов важна не только для медицинской практики, но также и в других областях, например, при сертификации продуктов питания, при определении экологической чистоты воды и почвы и т.д В настоящее время молекулярно-генетические методы позволяют осуществлять идентификацию личности в судебно-медицинских исследованиях, а также решать в спорных случаях проблему определения отцовства Применение технологий генотипирования в сельском хозяйстве открывает новые возможности для эффективного решения различных задач современной селекции, таких как поддержание генетических коллекций, подбор родительских форм для скрещивания, составление родословных, контроль интрогрессии генетического материала, паспортизация и сертификация сортов, создание «генетических паспортов» сельскохозяйственных растений, представляющих собой основу защиты интеллектуальной собственности селекционеров
Наиболее важным подходом для исследования генетического полиморфизма представляется использование методов молекулярного анализа, позволяющих получать индивидуальную характеристику отдельного генотипа - ДНК-профиль Существующие методы ДНК-типирования геномов отличаются по сложности, надежности и объему получаемой информации Для надежного различения и идентификации генотипов, исследования филогенетических взаимосвязей и интрогрессии генетического материала, наиболее перспективным является метод анализа полиморфизма микросателлитов, позволяющий получать воспроизводимые, информативные профили известных фрагментов генома.
Целью данной работы явилась разработка новых подходов для детекции точечных мутаций, а также разработка принципов стандартизации технологий генотипирования, основанных на анализе полиморфизма микросателлитов. Исследования были направлены на создание конкретных технологических решений, обеспечивающих применение разработанных подходов к идентификации геномов в практике клинических, судебно-медицинских исследований и в сельском хозяйстве
Для выполнения работы были поставлены следующие ЗАДАЧИ' 1 Исследовать возможность применения лигазной цепной реакции (ЛЦР) для детекции
однонуклеотидных полиморфизмов
Разработать технологию детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической полимеразной цепной реакции (АС-ПЦР) с последующим анализом продуктов реакции с помощью автоматического анализатора ДНК на основе электрофореза высокого разрешения.
Разработать методологию конструирования аллель-специфических праймеров для выявления мутаций в любых интересующих генах путем анализа продуктов АС-ПЦР на автоматическом анализаторе ДНК
4 Применить разработанную технологию для выявления нуклеотидных замен в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—>Т), факторов II (20210G-»A) и V (1691G—»А) свертываемости крови, для анализа полиморфизмов М235Т, Т174М, G(-6)А в гене ангиотензиногена человека, а также нуклеотидных замен в генах otl-коллагена типа 1 (2046G—»Т), рецептора витамина D3 (45082G—>А) и эстрогенового рецептора а (938Т-*С и 984A->G).
Разработать методические подходы, позволяющие стандартизировать технологию молекулярно-генетической идентификации личности, основанную на анализе количества тандемных повторов в микросателлитных локусах геномной ДНК человека
Исследовать возможность применения метода микросателлитного анализа для генотипирования растений родов Solarium и Brassica, Разработать универсальную технологию для генотипирования картофеля, культурных и дикорастущих форм Brassica на основе анализа полиморфизма микросателлитов. Отобрать оптимальные наборы праймеров к полиморфным микросателлитным локусам для различения и идентификации растений родов Solarium и Brassica, соответственно.
7 Применить технологию микросателлитного анализа для исследования генетического разнообразия представителей родов Solarium и Brassica как на внутри- и межвидовом уровне, так и для генотипирования сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции, а также близкородственных сортов и гибридов Brassica.
Изучить природу межвидового и внутривидового полиморфизма исследуемых микросателлитных локусов
Исследовать возможность применения технологии микросателлитного анализа для осуществления контроля интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды/сорта при межродовых, межвидовых и внутривидовых скрещиваниях
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Технология детекции мутаций на основе АС-ПЦР с последующим анализом продуктов реакции с помощью автоматического анализатора ДНК на основе капиллярного электрофореза.
Методология конструирования аллель-специфических праймеров для выявления мутаций в любых интересующих генах путем анализа продуктов АС-ПЦР на автоматическом анализаторе ДНК.
Разработанные тест-системы для выявления нуклеотидных замен в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—»Т), факторов II (20210G—>А) и V (1691G—»А) свертываемости крови, для анализа полиморфизмов М235Т, TI74M, G(-6)А в гене ангиотензиногена человека, а также нуклеотидных замен в генах otl-коллагена типа 1 (2046G—*Т), рецептора витамина D3 (45082G—>А), эстрогенового рецептора а (938Т->С и 984A-»G)
Основные принципы стандартизации технологии молекулярно-генетической идентификации личности, основанной на анализе количества тандемных повторов в микросателлитных локусах геномной ДНК человека.
Технология генотипирования картофеля и его дикорастущих сородичей на основе анализа 20 микросателлитных локусов
Технология генотипирования культурных и дикорастущих растений рода Brassica на основе анализа 18 микросателлитных локусов.
Научная новизна работы. В настоящей работе осуществлено комплексное исследование вопросов идентификации геномных полиморфизмов. В процессе выполнения исследования создан ряд научно обоснованных технологических решений, имеющих приоритетное значение для современной ДНК-диагностики
Впервые разработана методология создания тест-систем для детекции мутаций на основе АС-ПЦР и капиллярного электрофореза, адаптированная для использования в клинической практике. На основе предложенной технологии разработаны диагностические наборы реагентов для выявления нуклеотидных замен в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—>Т), факторов II (20210G—>А) и V (1691G—>А) свертываемости крови, полиморфизмов М235Т, Т174М, G(-6)A в гене ангиотензиногена человека, а также для нуклеотидных замен в генах а 1-коллагена типа 1 (2046G—>Т), рецептора витамина D3 (45082G—»А) и эстрогенового рецептора а (938Т—С и 984A-*G).
В рамках задачи создания технологии детекции точечных мутаций, адаптированной для использования в клинической практике, разработан и создан прибор для
автоматизированного анализа фрагментов ДНК методом капиллярного электрофореза «Мультиген» Генетический анализатор «Мультиген» основан на оригинальной оптической схеме, защищен патентом на изобретение (Шилов И А и др, 2000) и рекомендован для применения в медицинской практике Комитетом по новой медицинской технике Министерства здравоохранения Российской Федерации
На основании комплексного исследования источников возможных ошибок при проведении молекулярно-генетической идентификации личности разработаны основные подходы к стандартизации этой технологии, а именно принцип единого технологического цикла, принципы создания наборов реагентов для идентификации личности, а также способы, обеспечивающие однозначную идентификацию аллелей при проведении генетических экспертиз с использованием автоматических анализаторов
В результате проведенных исследований были отобраны 20 микросателлитных локусов, являющихся перспективными для идентификации видов и сортов картофеля. С применением технологии микросателлитного анализа были получены уникальные генетические профили 85 образцов растений рода Solarium, 44 из которых являются сортами картофеля отечественной и зарубежной селекции.
Впервые показано, что предлагаемая технология микросателлитного анализа позволяет осуществлять контроль интрогрессии генетического материала родительских форм в гибриды/сорта На основе экспериментального анализа первичных структур ряда микросателлитных локусов показана возможность контроля интрогрессии генетического материала дикого вида S bulbocastanum и сорта Ласунак в гибрид L 4-11, а также интрогрессии генетического материала родительских форм, участвовавших в селекции сорта Скороплодный.
6 На основании проведенных исследований были отобраны 18 микросателлитных локусов, являющиеся перспективными для идентификации видов, сортов и дикорастущих форм Brassica. Показано, что с помощью технологии микросателлитного анализа можно различать и идентифицировать растения рода Brassica, составляющие треугольник U, а также представителей других родов семейства Brassicaceae (Smapis, Raphanus, Camelina) на родовом, видовом и внутривидовом уровне.
7. В результате микросателлитного анализа впервые были идентифицированы фрагменты, специфичные для геномов А, В и С диплоидных видов Brassica и подтверждена их интрогрессия в амфидиплоидные виды, а также межвидовые и межродовые гибриды Впервые показана возможность контроля интрогрессии
генетического материала родительских форм (сортов В гара) в гибриды с помощью
технологии микросателлитного анализа.
Научно-практическое значение работы. В результате проведенной работы созданы наборы реагентов АСП-МТГФР, АСП-ПР и АСП-Ф5Л для детекции мутаций в генах метилентетрагидрофолатредуктазы (677С—>Т), факторов II (20210G—>А) и V (1691G—>А) свертываемости крови, соответственно. Завершены медицинские испытания наборов, инструкции по применению наборов утверждены Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации С использованием разработанных наборов реагентов было проведено обследование пациенток с нормальным течением беременности и гестозом; при этом выявлена более высокая частота встречаемости вышеупомянутых мутаций у пациенток с гестозом. Также была выявлена высокая частота встречаемости данных мутаций в ДНК беременных женщин с варикозной болезнью. Данные результаты свидетельствуют о связи этих мутаций с предрасположенностью к гестозу и варикозной болезни во время беременности.
Разработанная технология может служить основой для создания новых тест-систем для выявления мутаций в любых интересующих генах.
На основании разработанных в данной работе технологических подходов созданы наборы реагентов для идентификации личности CTWA и FFTL. Эти наборы реагентов зарегистрированы Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Российской Федерации и внесены в государственный реестр изделий медицинского назначения и медицинской техники.
Показана перспективность применения технологии микросателлитного анализа для исследования генетического разнообразия сельскохозяйственных культур, а также их идентификации, генетической паспортизации и сертификации, подбора генетически однородного материала для скрещиваний и контроля селекционной работы, а также для решения проблем молекулярной систематики и эволюции.
Продемонстрирована возможность различения близкородственных сортов картофеля Альтаир и Аксамит, в селекции которых участвовали одни и те же родительские формы; различения сортов отечественной и зарубежной селекции (сорт Скороплодный и Wauseon), различения близкородственных генотипов - сортов Голубизна и Скороплодный, являющихся полусестринскими сортами картофеля На примере сорта Голубизна показано, что предлагаемая технология микросателлитного анализа позволяет отслеживать и подтверждать сортовую подлинность экспертных образцов, сохраняемых и поддерживаемых в различных опытно-производственных хозяйствах.
Полученные в работе результаты микросателлитного анализа шести исследованных видов В гара, В nigra, В oleracea, В juncea, В. napus и В cannata полностью соответствуют их ботанической и онтогенетической классификации и могут быть использованы для решения задач молекулярной систематики представителей семейства Brasskaceae В результате микросателлитного анализа выявлены фрагменты, специфичные для геномов А, В и С, которые могут быть использованы в качестве маркеров интрогрессии генетического материала при межвидовых и межродовых скрещиваниях.
Личный вклад автора. В цикле исследований, включенных в диссертацию, автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке экспериментальных подходов и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад автора заключался в непосредственном участии во всех этапах исследования - от постановки задачи, проведения молекулярно-биологических и физико-химических экспериментов до обсуждения и литературного оформления полученных результатов
Апробация диссертации. Разработанные методики апробированы и применяются в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН (г. Москва), Российском государственном медицинском университете (г. Москва), Приморском краевом клиническом центре охраны материнства и детства (г. Владивосток), Центральном институте травматологии и ортопедии (ЦИТО) им Н.Н. Приорова (г. Москва), Российском центре судебно-медицинской экспертизы (г. Москва), Бюро СМЭ Московской области, Бюро СМЭ департамента здравоохранения г. Москвы, Республиканском Бюро СМЭ Татарстана, Республиканском Бюро СМЭ Башкортостана, Бюро СМЭ Новосибирской области, Бюро СМЭ Комитета по здравоохранению Ленинградской области, Бюро СМЭ г. Санкт-Петербурга, Бюро СМЭ Рязанской области, Бюро СМЭ Воронежской области, Бюро СМЭ Саратовской области, Бюро СМЭ Иркутской области, Алтайском краевом Бюро СМЭ (г. Барнаул), Приморском краевом Бюро СМЭ (г. Владивосток), Бюро СМЭ Новгородской области, Бюро СМЭ Самарской области, Бюро СМЭ Тюменской области, Бюро СМЭ Ярославской области, Республиканском Бюро СМЭ Северной Осетии-Алании, Красноярской государственной медицинской академии, Оренбургской государственной медицинской академии и в ряде других учреждений.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 283 страницах печатного текста, содержит 30 таблиц и 70 рисунков Список литературы включает 284 источника.
